一种检测糖化血红蛋白的试剂盒及其制备方法和使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及糖化血红蛋白检测技术领域，尤其涉及一种检测糖化血红蛋白的试剂 盒及其制备方法和使用方法。
【背景技术】
[0002] 糖化血红蛋白（HbAlC)是血液中红细胞内血红蛋白与血糖结合的产物。血糖通过 弥散方式进入细胞内，无需胰岛素参与。血糖与血红蛋白的结合过程缓慢且不可逆，在红细 胞死亡前一直存在，故体内衰老红细胞比新生红细胞的糖化血红蛋白含量高出1.5倍。血 红蛋白的平均寿命长达120天，且HbAlC的生成速度与过去2-3个月内血糖浓度水平成正 比，毫无疑问，HbAlC水平能够更准确地反映过去2-3个月中人体内的血糖情况。糖化血红 蛋白越高表示血糖与血红蛋白结合越多，糖尿病病情也越严重。检测HbAlC水平可避免每 日的血糖值波动的影响，与抽血时间，是否空腹，是否使用胰岛素等因素无关。当糖尿病控 制较好时HbAlC浓度在一定值范围内，糖尿病控制不住时HbAlC浓度则可高至正常值的2 倍以上，因此检测HbAlC水平成为糖尿病治疗过程中疗效监测的重要手段。HbAlC检测用于 常规实验室始于20世纪70年代末，且稳定发展至今，糖化血红蛋白浓度已成为了解糖尿病 控制良好与否的重要指标。国外已将糖化血红蛋白浓度监测作为糖尿病疗效判定和调整治 疗方案的"金标准"。
[0003] 目前，临床常用的测定HbAlC的方法主要有酶联免疫法、胶乳免疫凝集法和离子 树脂微柱层析法等。酶联免疫法是使用酶联免疫测定技术测定HbAlC，使用酶标仪、洗板机 等，该方法操作繁琐，耗时长，受影响因素较多。胶乳免疫凝集法是利用抗原抗体反应形成 复合物的自然凝集效果，以胶乳放大凝集信号，测定反应液浊度，一般使用全自动生化分析 仪，目前应用比较广泛，但其受到方法及使用仪器限制，标本需集中测定。离子树脂微柱层 析法是利用离子树脂的特异性吸附作用，将样本流过离子树脂层析柱，从而将HbAlC从样 本中分离出来，再与总血红蛋白比较测定其含量，特异性高、精密度高、重复性好，在临床上 有广泛应用，但是操作繁琐，耗时很长，受环境温度、挥发性酸碱物质影响大，如果不是熟练 人员则人为误差也很大；另外，有改进自然层析为负压引流或者正压挤出的方法，这种改进 方法仅是缩短了一定的操作时间，但同时带来了液体因流速过快跟树脂接触时间短而吸附 不完全的弊端。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有的糖化血红蛋白检测方法操作繁琐，耗时很长，人为误差大等问 题，提供一种灵敏度高，特异性强，检测方便快捷的用于检测糖化血红蛋白的试剂盒，以及 该试剂盒的制备方法和使用方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
[0006] -种检测糖化血红蛋白的试剂盒，包括反应液、洗涤液和反应板，所述反应板上设 有滤月吴；
[0007] 每IOmL所述反应液由以下各组分组成：12. 0-16. 5mg氯化锌，116. 5-127. 5mg氯化 钠，30. 0-31. Omg 六水氯化镁，238. 0-339. Omg HEPES，18. 5-29. 5mg 甘氨酸，39-41mg 氢氧化 钠，0.111^浓度为15%的1^切11乂-100,0.051^浓度为15%的叠氮化钠，余量为水；所述反 应液的pH为7. 9-8. 3 ;
[0008] 每5mL所述洗涤液由以下各组分组成：0. 09-0. 15mL的甲酰胺，0. 54mL浓度为 3. 15g/L 的 XC-DAP0L-CPBA 溶液，余量为水。
[0009] 优选的，每IOmL所述反应液由以下各组分组成：14. 4mg氯化锌，118. 9mg氯化钠， 30. 5mg六水氯化镁，298. 3mg HEPES，28. 8mg甘氨酸，40mg氢氧化钠，0· ImL浓度为15 %的 1^切11乂-100,0.051^浓度为15%的叠氮化钠，余量为水；所述反应液的？!1为8.1。
[0010] 优选的，每5mL所述洗涤液由以下各组分组成：0. 12mL的甲酰胺，0. 54mL浓度为 3. 15g/L 的 XC-DAP0L-CPBA 溶液，余量为水。
[0011] 以上所述反应液和洗涤液在2-8°C下保存。
[0012] 以上所述检测糖化血红蛋白的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
[0013] Sll制备反应液：将氯化锌溶于水中，得第一溶液；将氯化钠、六水氯化镁、叠氮化 钠和Triton X-100溶于水中，得第二溶液；将第一溶液与第二溶液混合均匀，得第三溶液；
[0014] 将氢氧化钠溶于水中，得第四溶液；将HEPES和甘氨酸溶于第四溶液中，得第五溶 液；
[0015] 将第五溶液与第三溶液混合均匀，得混合液，向混合液中加入水至混合液的体积 为10mL，然后将混合液的pH调至7. 9-8. 3,制得反应液；备用。
[0016] 优选的，将氯化锌溶于2. 5mL的水中，得第一溶液；将氯化钠、六水氯化镁、叠氮化 钠和Triton X-100溶于2. 5mL的水中，得第二溶液；将氢氧化钠溶于I. 5mL的水中，得第四 溶液。
[0017] S12制备洗涤液：将甲酰胺与XC-DAP0L-CPBA的甲酰胺溶液混合均匀，然后向混合 液中加入水至混合液的体积为5mL，制得洗涤液；备用。
[0018] S13组合：所述的反应液、洗涤液与设有滤膜的反应板组成试剂盒。
[0019] 以上所述检测糖化血红蛋白的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0020] S21反应：向反应液中加入5yL全血，充分震荡，然后静置2-3min使全血与反应 液反应完全，得混悬液；震荡混悬液使混悬液均匀。
[0021] 优选的，向25 μ L反应液中加入5 μ L全血。
[0022] S22沉淀和洗涤：将混悬液滴加到反应板上，静置IOs以上使混悬液充分浸入滤膜 内；然后向反应板中滴加洗涤液，静置IOs以上使洗涤液充分浸入滤膜内。
[0023] 优选的，将25 μ L混悬液滴加到反应板上；向反应板中滴加25 μ L洗涤液。
[0024] S23检测：在5min内用糖化血红蛋白检测仪检测与硼酸结合物结合的蓝色的糖化 血红蛋白在波长为620nm的光下的反射率Rl与红色的总体血红蛋白在波长为470nm的光 下的反射率R2,计算Rl与R2的比值即为检测样品中HbAlC的浓度。
[0025] 本发明试剂盒的原理为：反应液中含有可裂解红细胞并使血红蛋白沉淀的物质及 可与糖化血红蛋白的顺式-二醇基结合的蓝色硼酸结合物，当血液滴入反应液中时，红细 胞立即被裂解，所有的血红蛋白沉淀，硼酸结合物则与糖化血红蛋白的顺式-二醇基结合。 将适量的反应混合物置于反应板上，所有已沉淀的血红蛋白无论其是否被硼酸结合物所结 合，都将残留在滤膜之上，然后用洗涤液洗去多余的染色缀合物。最后使用血红蛋白检测仪 对蓝色（糖化血红蛋白）与红色（总体血红蛋白）分别在波长是620nm和470nm的光下的 反射率进行分析，计算二者的比值，比值即为样品中HbAlC的浓度。
[0026] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明根据糖化血红蛋白结合染料硼酸 结合物后在固定波长下的反射率与总的血红蛋白的反射率的比值，计算血液中糖化血红蛋 白的含量，利用其高灵敏度、高特异性的特点，设计新的原料、试剂和工艺流程。本发明提 供的试剂盒具有灵敏度高和特异性好及检测方法简单快捷的特点，五分钟即可完成测量报 告，大大缩短了操作时间，提高了检测效率，并且性价比高，适用于临床快速检测，可广泛应 用于各级医疗检验机构，尤其基层医疗机构包括乡镇卫生院均可开展。
【附图说明】
[0027] 图1为分别使用实施例中所述试剂盒和美国Bio-Rad公司生产的糖化血红蛋白检 测试剂盒检测相同样本的检测结果对比图。
【具体实施方式】
[0028] 为了更充分理解本发明的技术内容，下面结合具体实验对本发明的技术方案作进 一步介绍和说明。下述实验中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材 料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0029] 实施例
[0030] 本实施例提供一种检测糖化血红蛋白的试剂盒，以及该试剂盒的制备方法和使用 方法。该试剂盒由反应液、洗涤液和反应板组成，所述反应板上设有滤膜，用于沉淀血红蛋 白。
[0031] 所述反应液的体积为10mL，反应液由以下各组分组成：14. 4mg氯化锌，118. 9mg 氯化钠，30. 5mg六水氯化镁，298. 3mg HEPES，28. 8mg甘氨酸，40mg氢氧化钠，0· ImL浓度为 15%的Triton X-100,0. 05mL浓度为15%的叠氮化钠，余量为水；反应液的pH为8. 1。反 应液在2-8 °C下保存，备用。
[0032] 所述洗涤液的体积为5mL，洗涤液由以下各组分组成：0. 12mL的甲酰胺，0. 54mL浓 度为3. 15g/L的XC-DAP0L-CPBA甲酰胺溶液，余量为水。洗涤液在2-8°C下保存，备用。
[0033] 本实施例的试剂盒的制备方法如下：
[0034] (11)制备反应液
[0035] 将氯化锌溶于2. 5mL的水中，得第一溶液；将氯化钠、六水氯化镁、叠氮化钠和 Triton X-100溶于2. 5mL的水中，得第二溶液；将第一溶液与第二溶液混合均匀，得第三溶 液。
[0036] 将0. 2mL 5M的氢氧化钠溶于I. 5mL的水中，得第四溶液；将HEPES和甘氨酸溶于 第四溶液中，得第五溶液。
[0037] 将第五溶液与第三溶液混合均匀，得混合液，向混合液中加入水至混合液的体积 为10mL，然后将混合液的pH调至8. 1，制得反应液。
[0038] 反应液在2-8 °C下保存，备用。
[0039] (12)制备洗涤液
[0040] 将甲酰胺与XC-DAP0L-CPBA的甲酰胺溶液混合均匀，然后向混合液中加入水至混 合液的体积为5mL，制得洗涤液。
[0041] 洗涤液在2-8 °C下保存，备用。
[0042] (13)组合
[0043] 上述的反应液、洗涤液与设有滤膜的反应板组成试剂盒。
[0044] 本实施例的试剂盒的使用方法如下：
[0045] (21)反应
[0046] 向25 μ L反应液中加入5 μ L全血，充分震荡，然后静置2_3min使全血与反应液