乳腺癌标志物和治疗靶标-pzr及其用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及乳腺癌的诊断和治疗领域，其具体涉及用于检测PZR的物质在制备诊断乳腺癌的试剂盒中的用途，以及用于抑制PZR表达的物质在制备治疗乳腺癌的药物中的用途。
【背景技术】
[0002]乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，全球每年新发病例超过130万，每年有近50万妇女死于乳腺癌。在世界范围内，乳腺癌发病率存在明显的地区差异:在发达国家，乳腺癌发病率是70-100/100000 ;在经济欠发达的国家，包括中国其发病率是20-30/100000。然而，中国是乳腺癌发病率增长最快的国家之一。中国城镇登记处的数据显示，近几年乳腺癌的发病率正在迅速上升。一项研究预测表明，到2021年时年龄介于35-49岁的中国妇女乳腺癌的发病率可能会增加一倍。
[0003]乳腺癌是一种高度异质性的恶性肿瘤。根据在乳腺肿瘤中表达的不同标记蛋白，临床上可将乳腺癌归成3个主要的亚型，分别是:Luminal型、HER2过表达型和三阴性。Luminal型乳腺癌表达雌激素受体(ER)和/或孕激素受体(PR)，约占乳腺癌的60% [5]。其可以进一步划分为Luminal A型，表达ER和PR，但不表达酪氨酸激酶受体HER2/ErbB2 ；Luminal B型，ER、PR和HER2都表达。HER2过表达型乳腺癌ER、PR均为阴性，HER2阳性，占乳腺癌的25%左右。三阴性乳腺癌(TNBC)不表达ER、PR和HER2，占乳腺癌的15%左右。目前TNBC的诊断标准为ER、PR和HER2均不表达，这种方法很容易造成假阴性。所以发现新的TNBC生物标志物也能够对三阴性乳腺癌进行更准确的诊断。
[0004]与Luminal型乳腺癌相比，HER2过表达型和TNBC乳腺癌在最初4_5年里的生存率要低很多。HER2(+)或ER(-)乳腺癌易出现早而频繁地复发。TNBC通常显示恶劣的临床特征，即高度增生。更重要的是，TNBC患者易发生早期转移，常见转移器官为肺和肝脏器官，这是导致TNBC高死亡率的主要原因。用针对ER和HER2的靶向药物来治疗不同类型的乳腺癌已取得重大进展。内分泌治疗法，如雌激素受体拮抗剂(Tamoxifen)和芳香酶抑制剂(阿那曲唑和依西美坦)在治疗Luminal型乳腺癌时很有效。抗HER2治疗法，包括曲妥珠单抗(trastuzumab)和小分子抑制剂拉帕替尼(lapatinib)与标准化疗联合使用来治疗转移性HER2阳性乳腺癌。遗憾的是，至今还没有针对TNBC乳腺癌的特效治疗方法。目前治疗TNBC的标准方法还是化疗，特异性差且副作用大，有效期也非常短，TNBC很快就会复发和发生远端转移。缺乏特异性疗法也是导致TNBC高死亡率的原因之一。因此，迫切需要发现新的TNBC生物标志物来预测化疗反应或开发新的TNBC靶向治疗药物，以降低TNBC患者的死亡率，延长乳腺癌患者的寿命并且减少副作用。
【发明内容】
[0005]本发明基于以下发现，即PZR蛋白在ER(_)的乳腺癌特别是在TNBC中的表达要大大高于ER (+)乳腺癌。PZR蛋白的表达水平在ER+乳腺癌细胞系中
[0006](MCF7、T47D和ZR75-1)是非常低的，在Her2 (+)的乳腺癌细胞株BT-474和SKBR3略高。然而，PZR蛋白表达在大多数的TNBC细胞系(HCC70，SUM159，MB-231，BT-549，SUM149(图1))中表达最高。
[0007]为了验证上述实验结果，本发明进行了数据库数据发掘的工作。Oncomine (www.0ncomine.0rg)数据库中有着大量肿瘤病例的RNA微阵列芯片数据。本发明对PZR基因进行搜索和数据整理，发现与乳腺癌细胞株中表达相似。我们发现在Oncomine数据库中2个不同的人类乳腺癌数据集，PZR mRNA在TNBC-中的表达显著高于其它类型乳腺癌(图2)。因此，PZR蛋白可以作为一种新的TNBC标志物，在ER、PR和HER2三阴性的基础上增加PZR高表达作为评判指标，以提高TNBC的确诊率。
[0008]此外，本发明发现PZR高表达增强乳腺癌细胞的迀移和侵袭能力。为了探索PZR的功能，我们通过PLK0.1慢病毒载体表达两个不同的PZRshRNAs (shl和sh2)来干扰PZR在高表达细胞株(SUM149、MB-231和BT-549)中的表达(图3a)。干扰PZR明显影响了 MB-231乳腺癌细胞形状，(扁平形态)(图3b)，意味着细胞迀移能力的降低。伤口愈合(图3c)和Transwell迀移实验结果表明(图4a)，PZR KD干扰乳腺癌细胞的迀移。相反，在MCF7细胞中过度表达PZR则增强细胞的迀移能力(图4c)。此外，PZR KD也降低乳腺癌细胞的侵袭(图4b)。这些数据表明，PZR对保持乳腺癌细胞活动行为是至关重要的。我们的初步数据也表明，在3个乳腺癌细胞株中，干扰PZR的表达会减少EMT标记蛋白Vimentin的表达(图 5)。
[0009]本发明发现PZR表达促进乳腺癌细胞在软琼脂中和Tumorsphere的生长。我们发现，除了影响乳腺癌细胞的迀移行为，干扰PZR抑制BT-549和MB-231细胞在低密度条件下(colony forming)(图6a)和软琼脂(图6b)中的生长，显示PZR对乳腺癌细胞在anchorage-独立条件下生长的重要性。Anchorage-独立生长是癌细胞的重要标志之一。此外，我们还检测了 PZR表达对乳腺癌细胞成长为Tumorspheres的能力的影响。Tumorspheres被认为是浓缩肿瘤干细胞(CSC)的结构。我们发现，与载体对照相比，PZR在MCF7细胞中过度表达会增加4倍Tumorsphere的数目(图7)。考虑到PZR表达会促进乳腺癌细胞的EMT (图3，4，5)，且最近发表的研究报告显示，乳腺CSC具有EMT的特性，我们假设PZR高表达会扩大乳腺CSC池。这也许可以解释为什么PZR会在侵袭性强的乳腺癌ER(-)细胞中表达高。
[0010]本发明还发现异种移植小鼠肿瘤模型中shRNA干扰PZR表达会抑制三阴性乳腺肿瘤的生长(图8)和转移(图9)，显示PZR在动物体内对肿瘤和生长和转移的重要性，并提示其作为药物治疗靶标的潜能。
[0011]基于以上发现，PZR蛋白表达水平可作为一个新的生物标志物来帮助乳腺癌亚型的诊断和预测乳腺癌恶性程度及转移。另一个方面，可通过检测乳腺癌组织中的PZR蛋白水平而对乳腺癌患者的预后进行判断，判断乳腺癌病人对靶向药物治疗是否有效。此外，本发明涉及以PZR作为生物标志物进行三阴性乳腺癌治疗的新方法，涉及以PZR靶向的疗法如PZR单克隆抗体和或纳米粒子介导的PZR-siRNA或受PZR监管信号蛋白(如SHP2)来治疗ER-乳腺癌和或TNBC的药物组合物中的用途。
【附图说明】
[0012]图1为PZR在三阴性乳腺癌(TNBC)和其他类型乳腺癌细胞株中的表达量比较
[0013]图2为PZR mRNA在三阴性乳腺癌(TNBC)和其他类型乳腺癌中的表达量比较，数据来自Oncomine数据库，图2a为Hatzis Breast数据集，图2b为Stickeler Breast数据集。
[0014]图3为干扰PZR表达对于三阴性乳腺癌细胞运动能力的影响，图3a为指定细胞系表达对照shRNA (Csh)和两种不同的PZR的shRNA被裂解后用western blot来检测PZR和actin的表达；图3b为干扰PZR表达对乳腺癌细胞性状的影响。
[0015]图3c为划伤后MB-231细胞的愈合情况。
[0016]图4为PZR对三阴性乳腺癌细胞的迀移和侵袭的促进作用。图4a和图4b为PZR对SUM149和MB-231细胞迀移和侵袭的作用，图4c为ER+的MCF7细胞迀移与过度表达PZR的关系。
[0017]图5为干扰PZR对于三种三阴性乳腺癌细胞系中Vimentin和Actin表达的影响。图6.干扰PZR表达抑制三阴性乳腺癌细胞BT-549和MB-231细胞集落的生成(图6a)和其在软琼脂(图6b)里的生长。图6c为western blot检测转染NC、PZR-SH1和PZR-SH2的BT549细胞中PZR的表达量。
[0018]图7为过表达PZR与MCF7细胞Tumorspheres增长的关系。
[0019]图8显示了干扰PZR表达与三阴性乳腺肿瘤生长的关系。
[0020]图9显示了干扰PZR表达对三阴性乳腺肿瘤转移的抑制作用。包括肺转移情况观察(图9a)和荧光信号统计分析(图9b)。
实施例
[0021]实施例1.检测样品中是否存