一种热加工食品中蛋清含量的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及食品检测方法，尤其涉及一种热加工食品中蛋清含量的检测方法。
【背景技术】
[0002]我国是水产品生产和加工大国，在2012年我国鱼糜制品产量达到了 117万吨。为了提高鱼糜制品的口感，在实际生产过程中，部分企业会通过大量添加蛋清等非鱼肉成分，以提高制品的弹性。作为八大类致敏食物之一，鸡蛋在热处理后仍具有强的致敏性。现在虽然有一些针对疫苗中残留蛋清成分的检测方法的报道，但由于鱼糜制品在制备过程中的特殊加工工艺，使蛋清中的蛋白组分结构发生了变化，已报道的方法并不能在鱼糜制品检测中得到有效应用，因此，亟需开发一种有效准确的检测方法。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种准确，有效的检测热加工食品中蛋清含量的方法。
[0004]为实现上述目的，本发明提供一种热加工食品中蛋清含量的检测方法，其特征在于，步骤为，
将卵清蛋白抗原于95°C加热15min后配成浓度为200ng/孔，进行96孔板的包被，进行第一次孵育，37°C，2h ;
TBST洗涤后，再用含5重量％脱脂奶的TBST缓冲液封闭lh，每孔加入200μ?封闭液；将稀释后的热加工食品、不同浓度的标准品和等体积的抗卵清蛋白单克隆抗体各50uL分别进行预孵育，37°C，lh,再分别加入上述封闭好的96孔板，lOOuL/孔，37°C孵育lh，再加入ΙΟΟμ?辣根过氧化物酶标记的抗小鼠HRP-1gG为二抗37°C反应50min后，每孔加入ΙΟΟμ?四甲基联苯胺作为显色剂，37°C反应30min，每孔加50μ??#04终止反应，测定0D 45。。根据公式y=0.25+0.74/(1+Χ/1.33) h55进行计算，其中χ为样品吸光值与空白对照吸光值的比值；根据y值判断热加工食品中蛋清的含量；
所述稀释后的热加工食品是将热加工食品溶于10倍体积含8 mol/L尿素及0.1 mmol/L DTT 的 20 mmol/L pH 8.0 的 Tris-HCl 缓冲液，再分别用 20 mmol/L pH 7.4 的 PBS 缓冲液进行稀释，使其测定的0D值位于标准曲线线性区域内。
[0005]进一步，所述卵清蛋白抗原的制备方法为，将蛋清于Tris-HCl缓冲液中搅拌，离心得到的上清上样于DEAE-S印harose离子交换柱，用Tris-HCl缓冲液流洗后，再用含有0-0.lmol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集280nm洗脱峰，即为卵清蛋白抗原。
[0006]进一步，所述卵清蛋白抗原的制备方法为，将蛋清于4倍体积20mmol/L pH7.5的Tris-HCl缓冲液中，4°C搅拌2_4h，离心得到的上清上样于DEAE-Sepharose离子交换柱，用20mmol/L ρΗ7.5 的 Tris-HCl 缓冲液流洗后，用含有 0-0.lmol/L NaCl 的 20mmol/L ρΗ7.5的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集280nm第一个洗脱峰，即为卵清蛋白抗原。
[0007]进一步，所述热加工食品包括鱼糜制品和除鱼糜制品外的热加工食品。
[0008]进一步，所述根据y值判断热加工食品中蛋清的含量为: 当检测对象为鱼糜制品时，热加工食品中蛋清的含量等于y值乘以样品稀释倍数；
当检测对象为鱼糜制品以外的热加工食品时，热加工食品中蛋清的含量等于y值乘以系数20再乘以样品稀释倍数。
[0009]进一步，所述标准品的制备方法为，将纯化的卵清蛋白溶于20mmol/L pH7.5的Tris-HCl缓冲液中得到0,0.01,0.04,0.16,0.64,2.5、10ug/mL卵清蛋白含量的标准品溶液，分别于80-100°C加热15-30min，即为检测除鱼糜制品外的热加工食品的标准品。
[0010]进一步，所述卵清蛋白抗原的制备方法为，将蛋清于4倍体积20mmol/L pH7.5的Tris-HCl缓冲液中，4°C搅拌2_4h，离心得到的上清上样于DEAE-Sepharose离子交换柱，用20mmol/L ρΗ7.5 的 Tris-HCl 缓冲液流洗后，用含有 0-0.lmol/L NaCl 的 20mmol/L ρΗ7.5的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集280nm第一个洗脱峰，即为卵清蛋白抗原。
[0011]进一步，所述标准品的制备方法为，制备蛋清重量含量分别为0、0.1%、0.3%、1%、3%、10%和30%的鱼糜制品，再分别溶于10倍体积含8 mol/L尿素及0.1 mmol/L DTT的20mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液，最后分别用20 mmol/L PBS, pH 7.4的缓冲液稀释10倍体积即为检测鱼糜制品标准品。
[0012]本发明的技术方案中，包被的抗原为高纯度的热处理的卵清蛋白，以已知蛋清添加量的鱼糜制品提取物或热处理的高纯度卵清蛋白为标准品，建立抑制性ELISA法。
[0013]本发明的实施例对市售8种鱼糜制品进行了检测试验，其中4种标示了含有蛋清成分，另外4种在包装上的成分表中未见有蛋清的标示。实施例结果显示，在8种鱼糜制品中均添加了蛋清成分，添加量在0.2-3%不等。本发明所实施的实施例，充分说明了本发明的方法灵敏、简单，准确；具有重要的现实意义。
【附图说明】
[0014]图1是鱼糜制品中蛋清含量检测的标准曲线图。
[0015]图2是不同温度处理对卵清蛋白抗体结合能力的影响图。
【具体实施方式】
[0016]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本发明的描述中，“第一”、“第二”、“第三”等为指代或描述方便，不能理解为有顺序关系或者有相对重要性指示，除非另有说明，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0017]实施例1:鱼糜制品中大豆蛋白检测方法的建立
(1)卵清蛋白抗原的制备
将35g蛋清于140mL 20mmol/L的Tris-HCl，ρΗ7.5缓冲液中，4°C搅拌3h，离心得到的上清上样于DEAE-Sepharose离子交换柱，用20mmol/L的Tris-HCl，pH7.5缓冲液流洗后，用含有0-0.lmol/L NaCl的20mmol/L的Tris-HCl，pH7.5缓冲液进行洗脱，收集第一个洗脱峰，进行SDS-PAGE电泳分析，显示为单一条带，分子量约为45kDa，表明获得高纯度的卵清蛋白即为卵清蛋白抗原。
[0018](2)鱼糜制品检测标准品的制备
制备蛋清重量含量分别为0、0.1%、0.3%、1%、3%、10%和30%的鱼糜制品:分别称取10g剁碎的鱼糜样品，溶于100mL含8 mol/L尿素及0.1 mmol/L DTT的20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液，再分别用20 mmol/L PBS (pH 7.4)的缓冲液稀释10倍即为鱼糜制品检测标准品。
[0019](3)抑制性ELISA法的建立
将步骤(1)制备的卵清蛋白抗原进行95°C加热15min，配成浓度为200ng/孔，进行96孔板的包被，37°C，2h ；TBST洗涤5次后，用含5重量