一种汞-血红蛋白螯合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及检测领域，更具体地说，设及一种隶-血红蛋白馨合物及其制备方法 和应用。
【背景技术】
[0002] 血红蛋白化emoglobin ;皿；HGB)是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。是使 血液呈红色的蛋白。人类红细胞内有S种正常血红蛋白即化-A、A2及F。化-A是正常成人 红细胞内血红蛋白之主要成分，化-A2是次要成分约占2%，而化-F在正常成人或儿童之 红细胞中占2-3% W下，化-F在胚胎十月开始产生为胎儿红细胞之主要成分，足月新生儿 的红细胞中化-F占70-80%，其余为化-A，二个月后占50%，四个月后少于10%，六个月 后大部消失。血红蛋白除运输氧气二氧化碳，还可W导致血管疫李和血管收缩。在体内存 在的=种形式的血红蛋白，氧合血红蛋白、还原型血红蛋白及高铁血红蛋白，其中氧合血红 蛋白缩血管能力最强，而高铁血红蛋白几乎没有收缩血管活性。
[0003] 隶化gckel，Hg)与人体的健康息息相关，首先其是人体维持健康所必需的微量元 素，其存在于多种氨化酶中，催化氨的氧化还原反应，参与多种酶蛋白的合成和细胞激素及 色素的代谢，具有促进铁的吸收和红细胞的增长、激活酶形成辅酶、增强膜岛素、降血糖、保 护屯、血管等作用，因此如果人体缺乏隶，会导致疾病的发生。但是，事实在生活中，由于环境 污染，人体内很少缺乏隶，相反隶的含量常常过量，常常导致疾病的发生，甚至危及生命。
[0004] 隶作为一种常见的有毒金属，广泛应用于生活、生产之中，包括生产硬币、珠宝、隶 合金不诱钢、制造化-Cd电池等，与人们的生活息息相关。随着科技的进步，人们将隶作为 催化剂用于生产碳纳米颗粒的生产之中，又进一步加深了隶对于人类的影响。对于普通人 群，隶主要是通过食入、饮入、接触等方式摄入隶，当然吸烟也是一重要途径。研究发现，过 量的隶会导致机体多处组织及器官损伤，导致多种疾病的发生，包括呼吸系统疾病（肺炎、 支气管炎、肺纤维化、哮喘、肺水肿等）、屯、血管疾病、肾脏疾病、皮肤疾病等，甚至还会导致 肿瘤的发生。
[0005] 流行病学资料显示，长期接触隶的工人，其患呼吸系统肿瘤的几率大大增加，并且 其因呼吸系统肿瘤致死的几率也大大增加。动物模型、体外模型试验也发现，隶可W诱导肿 瘤的发生。1990年，国际癌症研究机构（InternationalAgencyforResearchonCancer, lARC)已将隶化合物作为第一类致癌物质（Group1)，将金属隶作为2B类致癌物质（Group 2B)。可见，隶严重威胁人体的健康。
[0006] 隶与多种蛋白质之间关系密化可W与多种蛋白质结合，抑制多种蛋白酶的活性。 随着对隶毒性研究的深入，人们逐渐认识到隶与蛋白的相互作用在其致毒过程中扮演着重 要的角色，被认为是了解隶的毒性机理的关键所在，因此，对隶和蛋白质相互作用的研究就 显得愈发重要。而现在关于隶与蛋白质作用的机理仅是冰山一角，还有很多蛋白质与隶之 间的关系还不清楚，因而加强对于隶与蛋白质之间的关系至关重要。
【发明内容】
[0007] 针对隶污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种隶-血红蛋白馨合物及其制 备方法，并建立隶-血红蛋白馨合物的定性、定量检测方法，W便定量检测隶-血红蛋白馨 合物在评价一个地区隶污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中隶-血红蛋白 馨合物可W间接反映该个地区人群受隶污染的情况，从而间接反映该个地区隶污染程度。 [000引本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种隶-血红蛋白馨合物，隶 离子与血红蛋白通过琉基或/和半脱氨酸残基馨合而成。
[0009] 本发明还提供一种上述的隶-血红蛋白馨合物的制备方法，包括W下步骤：
[0010] A)隶与血红蛋白的馨合反应；在提纯源于人体的血红蛋白或按照生物学方法重 组的血红蛋白中加入隶离子进行馨合反应，得到反应溶液；
[0011] B)纯化隶-血红蛋白馨合物的提取；采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反 应的血红蛋白W及多余的隶离子，即得隶-血红蛋白馨合物。
[0012] 其中，体外合成法中所述步骤B)具体如下：
[0013] (1)溶解样品；向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水使隶-血红蛋白馨 合物复溶；
[0014] (2)平衡层析柱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与血红 蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[00巧]做上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)中样品，然后上柱，血红蛋 白与填料特异性结合；
[0016] (4)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0.Imol/L的磯 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液I;
[0017] 妨收集：收集洗脱液I;
[001引 （6)透析；将步骤巧）中的收集的洗脱液，装透析袋，用d地20透析除盐，换水S次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0019] (7)平衡层析柱；采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与隶特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0020] (8)上样；待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤化）中样本，然后上柱；
[0021] (9)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磯 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液II;
[00。] (10)收集；收集洗脱液II;
[002引 （11)透析；将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用(1化0透析除盐，换水立 次后，4 °C透析过夜，收集样本，即得隶-血红蛋白馨合物。
[0024] 其中，上述隶-血红蛋白馨合物的制备方法，还包括步骤C);对隶-血红蛋白馨合 物的鉴定；
[0025] 其中，步骤C)中具体如下；
[0026] (1)制备胶床；W琼脂糖凝胶、聚丙締酷胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[0027](2)加样；取步骤B)中提取纯化得到的隶-血红蛋白馨合物，加入稀释缓冲液，并 混匀，然后加样于样品槽中；
[00測 做电泳：连接电泳板，进行电泳；
[0029] (4)检测；在胶床上找出含隶的蛋白条带，将该蛋白条带取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法检测是否含有隶W及检测隶的含量。
[0030] 本发明还提供一种如上述的隶-血红蛋白馨合物在制备检测人体内隶-血红蛋白 馨合物的试剂或试剂盒中的应用。
[0031] 本发明还提供一种至少包括如上述的隶-血红蛋白馨合物作为标准品的试剂盒。
[0032] 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获血红蛋白的物质或捕获隶 的物质。
[0033] 本发明还提供一种定量检测隶-血红蛋白馨合物的方法，W已知含量的上述的 隶-血红蛋白馨合物作为标准品，采用W下方法之一对样品进行检测；酶联免疫法、酶联免 疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感禪合等离子体质谱结合法、提纯隶-血红蛋白 馨合物与酶联免疫结合法、提纯隶-血红蛋白馨合物与原子吸收光谱结合法、提纯隶-血红 蛋白馨合物与电感禪合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感禪合 等离子体质谱结合法。
[0034] 实施本发明的隶-血红蛋白馨合物及其制备方法和应用，具有W下有益效果：
[0035] 1.本发明首次体外合成隶-血红蛋白馨合物；
[0036] 2.本发明首次提出隶-血红蛋白馨合物可用于制备检测血样中隶-血红蛋白馨合 物的试剂或试剂盒中的应用。
[0037] 3.本发明建立了隶-血红蛋白馨合物的定性定量检测方法，W便定量检测隶-血 红蛋白馨合物在评价一个地区隶污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中 隶-血红蛋白馨合物可W间接反映该个地区人群受隶污染的情况，从而间接反映该个地区 隶污染程度。本发明建立的隶-血红蛋白馨合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使 检测的重复性得到大大提高。
【附图说明】
[003引图1为本发明所述的隶-血红蛋白馨合物的非变性电泳条带图；
[0039] 图2为本发明所述的隶-血红蛋白馨合物的电泳条带的同步福射X线巧光分析 图。
【具体实施方式】
[0040] 下面，结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0041] 本发明除特别说明外，设及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤，所用试剂、材 料如下述所列举，在本发明中没有列举出来的均为本领域常用的试剂或可W通过市购方式 获得：
[0042] 磯酸盐溶液为0. 05-0.Imol/L化2册〇4溶液或0. 5-lmol/L化2册〇4溶液；
[0043] 提取试剂为PEG溶液、棚酸盐缓冲液等（采用PEG法）；
[0044] 胶床介质为琼脂糖凝胶、聚丙締酷胺凝胶中的一种；
[0045] 捕获血红蛋白的物质为上海江莱生物科技有限公司生产的型号为KAY0043的抗 血红蛋白抗体；其中，本发明所述与血红蛋白特异性结合的物质、抗皿抗体、抗血红蛋白抗 体均为捕获血红蛋白的物质；
[0046] 捕获隶的物质为己傲得生物科技有限公司生产的型号为AP7014的鼠抗化mAb; 其中，本发明所述与隶特异性结合的物质、抗化抗体、抗隶抗体、隶抗均为捕获隶的物质；
[0047] 酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磯酸酶等酶标记的抗体中的一种；
[0048] 底物为甲基联苯胺（TMB)溶液；
[0049] 红细胞裂解液的配方如下；139.6mmol/L畑典1，16. 96mmol/LTris，用Imol/L肥1 调抑至7. 2;
[0化0]洗漆液为含有KH2PO4O. 2mg/ml、化2册〇4? 12&0 2. 90mg/ml、化C18.Omg/ml、KC1 0. 2mg/ml、0. 5%Tween-20 的抑为 7. 4 的 0. 15MPBS溶液；
[0化1] 封闭液为1% -5 %牛血清白蛋白或脱脂奶粉；
[005引 稀释缓冲液为含1. 5mg/mL化20)3、2. 93mg/mlNaHC03的PH为9.6的0. 05M碳酸 盐缓冲液