本发明属于糖化血红蛋白检测
技术领域：
，具体涉及一种糖化血红蛋白、血红蛋白检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：根据idf统计，2015年全球糖尿病患者约有4.15亿人，每11个人就有1人患有糖尿病。预测到2040年，全球将会有6.42亿人患有糖尿病，中国糖尿病患者也将达到1.51亿，糖尿病前期患者多达2.24亿人。据国家卫计委和idf统计，2015年我国18岁及以上成人糖尿病患病率为10.7％，糖尿病前期患者高达16％，2015年全球18岁－80岁成年人的糖尿病患病率为9.1％。中国糖尿患者位居世界首位，趋于年轻化，具df统计，2015年我国有130万人死于糖尿病及其并发症，其中40.8％的人年龄低于60岁，且逐年呈现年轻口基数大，人口老龄化加剧以及饮食结构等因素，导致我国糖尿病患者人数约1.5亿人，位居世界第一，我国糖尿病消费群体量大，且呈现逐年患者增多的趋势。糖化血红蛋白(glycatedhemoglobin，或血红蛋白a1c，或者glycosylatedhemoglobin)(下文中有时称作“hba1c”)已被看做是筛选糖尿病、检查可能成为前驱糖尿病人的人的血糖控制、或者监测病人的血糖控制、以及诊断糖尿病的有用工具。在血红细胞的正常的120天寿命中，葡萄糖分子与血红蛋白反应，形成糖化血红蛋白。一旦血红蛋白分子被糖化，其保持被糖化的状态。因此，红细胞内的糖化血红蛋白的增多反映了在细胞的生命周期中细胞被暴露到的葡萄糖的平均水平。通过监测长期血清葡萄糖调节，测量糖化血红蛋白可以评估糖尿病的治疗效果。hba1c水平与前四周至三个月的平均血糖浓度成正比。据此，欧美国家已经将此作为糖尿病疗效和调整治疗方案的金标准。目前，前临床实验室中检测糖化血红蛋白的常见方法主要有两大类：一类方法基于糖化血红蛋白与非糖化血红蛋白所带的电荷不同，如离子层析法、电泳等方法；另一类方法基于血红蛋白上糖化基团的结构特点，如亲和层析、离子捕获法和免疫法等。其中，基于硼酸亲和层析法的糖化血红蛋白、血红蛋白检测备受关注。经检索发现，授权公告号为cn100593117c的发明专利公开了一种血红蛋白检测试剂盒，包括：能保留沉淀的血红蛋白的多孔膜；第一试剂，包括锌离子水溶液或者包括水可溶性锌化合物；第二试剂，包括发色团－硼酸偶联物；和任选包括水性洗涤试剂；尽管其技术方案解决了随着试剂盒保藏时间的延长检测结果呈现不稳定的问题，但是经临床实践证明其并未从本质上起到延长货架期的作用。检索还发现，申请公布号为cn102652264a的发明专利公开了一种用于测量糖化血红蛋白的离心微流结构、用于测量糖化血红蛋白的离心微流装置和用于测量糖化血红蛋白的方法，该技术方案将免疫吸附测定和亲和色谱测量相结合，不仅检测糖化血红蛋白，还检测糖化血红蛋白变异体或干扰物质，最终消除和/或补偿或者校准糖化血红蛋白测量中的差错，从而使糖化血红蛋白水平的检测更准确。尽管该技术方案从一定程度上相对于现有技术更能准确的测定出糖化血红蛋白的含量，但是其技术方案复杂，并且检测时间较长，不利于便捷式家用检测装置的开发。申请人还检索到，申请公布号为cn105301261a的发明专利公开了一种检测糖化血红蛋白的试剂盒及其制备方法和使用方法，其中，所述试剂盒包括反应液、洗涤液和反应板，但反应液和洗涤液保存条件严格限定为2－8℃，限制了自然条件下检测的进行，不利于便民试剂盒的推广。技术实现要素：针对现有技术的上述缺陷，本发明的目的是提供一种糖化血红蛋白、血红蛋白检测试剂盒及其检测方法，特别是一种基于硼酸亲和层析法的糖化血红蛋白、血红蛋白检测试剂盒及其检测方法，以缩短检测时间、降低采血用量、延长试剂盒货架期、增加检测准确性、提高检测条件的温和性。本发明的目的是通过如下技术方案实现的：第一方面，本发明提供一种糖化血红蛋白、血红蛋白检测试剂盒，包括r1试剂、r2试剂、r3试剂、r4试剂、糖化血红蛋白－血红蛋白沉积膜；所述r1试剂，其ph为弱碱性，溶剂为浓度小于等于0.35wt％的氯化钠水溶液，溶质及其在所述溶剂中含量为：表面活性剂0.12－0.18％w/v；所述r2试剂，其溶剂为甘氨酸－氢氧化钠缓冲液，溶质及其在所述溶剂中的含量为：发色团－硼酸偶联物0.001－0.003wt％，表面活性剂0.12－0.18％w/v；所述r3试剂，其ph为弱碱性，具体为水性洗涤试剂；所述r4试剂液，其溶剂为甘氨酸－氢氧化钠缓冲液，溶质及其在所述溶剂中的含量为：无机锌盐10－15mm，表面活性剂0.1－0.2％w/v。优选地，所述表面活性剂具体指tween20和tritonx－100质量比为2：1。优选地，所述弱碱性具体指ph为7.2－7.5。优选地，所述弱碱性具体指ph为7.35－7.45。优选地，所述r1试剂，还包括：0.002％w/v的叠氮化钠、0.05％w/v的甘油、0.005％w/v的脱脂奶粉、0.001％w/v的酪蛋白，0.01％w/v的bsa。优选地，所述r2试剂，还包括：2－8mm的六水氯化镁、1－1.5％v/v的甲酰胺。优选地，所述r4试剂，还包括：10－15％v/v的乙醇、0.002－0.004％w/v的叠氮化钠，0.1－0.3％w/w的氯化钠。优选地，所述糖化血红蛋白－血红蛋白沉积膜选自玻璃纤维膜、硼酸盐滤膜或纤维质膜。第二方面，本发明提供一种基于所述检测试剂盒的糖化血红蛋白、血红蛋白检测方法，包括如下步骤：取待检测血样与r1试剂，混合，得溶血后的血样；将溶血后的血样中加入r2试剂，混合，得糖化血红蛋白检测样；将糖化血红蛋白检测样置于糖化血红蛋白－血红蛋白沉积膜上，放置一端时间后，再加入r4试剂液，再放置一段时间；用r3试剂清洗所述糖化血红蛋白－血红蛋白沉积膜；基于反射光度法对所述糖化血红蛋白－血红蛋白沉积膜上的样品位点进行检测，即可分别获得检测血样中糖化血红蛋白、血红蛋白含量。本发明试剂盒及检测方法的机理在于：在r1试剂中，糖化血红蛋白和血红蛋白被释放，然后糖化血红蛋白与r2试剂中的硼酸结合，加入r4试剂后，靶标蛋白被沉积，r3试剂冲洗后，除沉积在糖化血红蛋白－血红蛋白沉积膜上的靶标蛋白外，其他检测样品组分被洗去，通过上述操作，糖化血红蛋白和血红蛋白被沉积、检测，准确性高。与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：采用本发明的检测试剂盒基于其组分种类及含量，可以缩短检测时间、降低采血用量、延长试剂盒货架期、增加检测准确性、提高检测条件的温和性。另外，本发明的试剂盒是一种基糖化血红蛋白和血红蛋白检测于一体的检测试剂盒，不仅适用于糖尿病的预防、检测，还适用于贫血的预防、检测，相对于单一蛋白检测的现有试剂盒来讲更加便民实用、更加有利于市场推广。再者，基于本发明的试剂盒组分及种类优选、检测方法优化，在本发明糖化血红蛋白－血红蛋白沉积膜上沉积的糖化血红蛋白、血红蛋白颗粒分布非常的均匀，颗粒大小适中，为2－5μm，这样的沉积特点更加有利于检测结果的准确性。附图说明图1为分别使用实施例中所述试剂盒和美国bio－rad公司生产的糖化血红蛋白检测试剂盒检测相同样本的检测结果对比图。具体实施例下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。实施例1实施例1提供了一种糖化血红蛋白、血红蛋白检测试剂盒，包括r1试剂、r2试剂、r3试剂、r4试剂、糖化血红蛋白－血红蛋白沉积膜；其中，r1试剂：其ph为7.2－7.5，溶剂为浓度等于0.35wt％的氯化钠水溶液，溶质及其在所述溶剂中含量为：表面活性剂0.12％w/v；所述表面活性剂具体指tween20和tritonx－100质量比为2：1；r2试剂：其溶剂为甘氨酸－氢氧化钠缓冲液，溶质及其在所述溶剂中的含量为：二甲苯－苯胺－苯基硼酸偶联物0.001wt％，表面活性剂0.12％w/v；所述表面活性剂具体指tween20和tritonx－100质量比为2：1；r3试剂：具体为生理盐水；r4试剂：其溶剂为甘氨酸－氢氧化钠缓冲液，溶质及其在所述溶剂中的含量为：氯化锌10mm，表面活性剂0.1％w/v；所述表面活性剂具体指tween20和tritonx－100质量比为2：1；糖化血红蛋白－血红蛋白沉积膜：纤维质膜。实施例2实施例2提供了一种糖化血红蛋白、血红蛋白检测试剂盒，包括r1试剂、r2试剂、r3试剂、r4试剂、糖化血红蛋白－血红蛋白沉积膜；其中，r1试剂：其ph为7.2－7.5，溶剂是浓度为0.20wt％的氯化钠水溶液，溶质及其在所述溶剂中含量为：表面活性剂0.18％w/v；所述表面活性剂具体指tween20和tritonx－100质量比为2：1；r2试剂：其溶剂为甘氨酸－氢氧化钠缓冲液，溶质及其在所述溶剂中的含量为：二甲苯－苯胺－苯基硼酸偶联物0.003wt％，表面活性剂0.18％w/v；所述表面活性剂具体指tween20和tritonx－100质量比为2：1；r3试剂：具体为甘氨酸－氢氧化钠缓冲液；r4试剂：其溶剂为甘氨酸－氢氧化钠缓冲液，溶质及其在所述溶剂中的含量为：硫酸锌15mm，表面活性剂0.2％w/v；所述表面活性剂具体指tween20和tritonx－100质量比为2：1；糖化血红蛋白－血红蛋白沉积膜：玻璃纤维膜。实施例3实施例3提供一种糖化血红蛋白、血红蛋白检测方法，具体是基于实施例1和实施例2提供的试剂盒进行的，具体包括如下步骤：取2.5μl待检测血样与100μlr1试剂，震荡3s，得溶血后的血样；将溶血后的血样加入等体积的r2试剂，震荡3s，得糖化血红蛋白检测样；将糖化血红蛋白检测样置于糖化血红蛋白－血红蛋白沉积膜上，静置5s后，再加入r4试剂液，再放置5s；用r3试剂清洗所述糖化血红蛋白－血红蛋白沉积膜；基于反射光度法对所述糖化血红蛋白－血红蛋白沉积膜上的样品位点进行检测，采用波长分别为616nm、415nm，即可分别获得检测血样中糖化血红蛋白、血红蛋白含量。在本实施例进行检测的过程中，为了体现本发明试剂盒的优势，本实施例还基于同样的待检测血样进行了高效液相色谱法检测，及采用购买市售生化试剂进行检测，每种方法重复三次，结果见表1。表1采用不同的试剂盒、方法对同一样品重复检测三次的结果第一次第二次第二次实施例15.75.75.7实施例25.75.75.7hplc5.75.85.8生化试剂5.45.35.4基于上述表1所述的结果不难发现，本发明实施例1和实施例2提供的检测试剂盒检测结果极其接近于hplc，显著优于市售生化试剂盒。进一步地，与hplc相比，实施例1和实施例2的试剂盒存在如下优势：本发明的试剂盒使用者无需具备专业的医疗测试知识，只要根据试剂盒的说明书指示即可完成，熟练操作整个检测方法不会超90s，并且重复性良好；本发明实施例的试剂盒在室温下即可操作，环境对其干扰及其微弱。在上述实施例实施过程中，发明人意外的发现：(1)对r1试剂做出本发明的限定具有意想不到的作用，具体是，该限定的r1试剂对血液中糖化血红蛋白、血红蛋白的释放具有加速作用，在极短时间(最多3s)内即可彻底释放，这样不仅能增加检测结果的准确性，而且还能间接对缩短检测周期起到显著作用；(2)尽管在细胞裂解液中增加表面活性剂是常用技术手段，但是发明人发现对表面活性剂的种类及其用量进行优化的情况下，红细胞裂解产物状态均匀稳定，受温度影响不大，无需使用者在2－8℃下实施检测，另外，在试剂盒贮存过程中，直接将其自然存在即可，无需对其贮存温度进行限定；(3)在对r2试剂进行优化过程中，发明人发现，通过对发色团－硼酸偶联物及表面活性剂含量、种类的优化，使得在将其加入溶血血样后色团－硼酸偶联物和糖化血红蛋白结合速度加快，并且在将其混合物移至糖化血红蛋白－血红蛋白沉积膜上后，糖化血红蛋白分布均匀，颗粒大小适中(直径2－5μm)，与沉积膜结合牢固，能避免糖化血红蛋白流失，增加检测准确性；(4)在对r4试剂进行优化过程中，发明人发现，尽管锌离子作为沉淀剂为本领域常见，但是对其浓度进行优化限定特别有利于加速血红蛋白的沉积，并且沉积颗粒大小适中(直径2－5μm)，颗粒分布均匀，在表面活性剂种类及含量优化的基础上，r4试剂还无需贮存于2－8℃而直接置于常温放置即可。在上述试剂种类及含量优化的基础上，各个检测环节加速进行，不仅能够在小于90s的情况下完成检测，而且存贮条件温和，货架期1年内任何时间检测均能够确保结果准确性。实施例4实施例4是实施例1的优选例，其优选之处在于r1试剂中的溶质及其含量，具体如下：r1试剂：其ph为7.35－7.45，溶剂为浓度等于0.35wt％的氯化钠水溶液，溶质及其在所述溶剂中含量为：表面活性剂0.12％w/v；所述表面活性剂具体指tween20和tritonx－100质量比为2：1；另外，r1试剂还包括0.002％w/v的叠氮化钠、0.05％w/v的甘油、0.005％w/v的脱脂奶粉、0.001％w/v的酪蛋白，0.01％w/v的bsa；需要说明的是，r1试剂还包括0.001－0.003％w/v的叠氮化钠、0.04－0.06％w/v的甘油、0.003－0.006％w/v的脱脂奶粉、0.001－0.003％w/v的酪蛋白、0.01－0.03％w/v的bsa的情况下依然能够实现技术效果；只是在r1试剂还包括0.002％w/v的叠氮化钠、0.05％w/v的甘油、0.005％w/v的脱脂奶粉、0.001％w/v的酪蛋白、0.01％w/v的bsa的效果最优；r2试剂：其溶剂为甘氨酸－氢氧化钠缓冲液，溶质及其在所述溶剂中的含量为：二甲苯－苯胺－苯基硼酸偶联物0.001wt％，表面活性剂0.12％w/v；所述表面活性剂具体指tween20和tritonx－100质量比为2：1；还包括5mm的六水氯化镁、1.2％v/v的甲酰胺；需要说明的是，六水氯化镁的含量在2－8mm、甲酰胺的含量在1－1.5％v/v的条件下均可实现；r3试剂：具体为生理盐水；r4试剂：其溶剂为甘氨酸－氢氧化钠缓冲液，溶质及其在所述溶剂中的含量为：氯化锌10－15mm，表面活性剂0.1％w/v；所述表面活性剂具体指tween20和tritonx－100质量比为2：1；还包括：10－15％v/v的乙醇、0.002－0.004％w/v的叠氮化钠，0.1－0.3％w/w的氯化钠；糖化血红蛋白－血红蛋白沉积膜：纤维质膜。发明人意外的发现，在对试剂盒试剂进行优化后，其整体稳定性显著增加，具体如下：处理1：常温放置4年的实施例4试剂盒；处理2：常温放置2年的实施例4试剂盒；处理3：现时配置而成的实施例4试剂盒；处理4：现时配置而成的实施例1试剂盒；用上述四个处理检测同一血样，结果如下表2所示：表2处理1处理2处理3处理4糖化血红蛋白含量5.75.75.75.7通过上述表4的结果可以看出，实施例4的试剂盒在存储了4年之后，对血液检测的准确性没有降低，可见本实施例通过组分进行优化，最终对货架期显著提升。尽管不少现有技术对糖化血红蛋白检测试剂盒延长货架期做出了诸多努力，但是延长的期限还是极其局限，而本发明通过试剂盒组分的优化，最终显著改善了试剂盒的货架期，这是本领域技术人员意想不到的。上述改进除了对试剂盒货架期存在显著提升作用外，发明人还发现存在如下有益效果：(1)分析范围有所提升为了确定实施例4试剂盒的检测范围，发明人根据本领域常用技术配置了糖化血红蛋白样品梯度溶液(为0，0.5％，3％，5％，10％，12％，15％，20％，25％)，采用上述检测方法对糖化血红蛋白样品梯度溶液进行了检测，结果如下表3所示：表3通过表3可知，通过对试剂组分及含量的优化，本发明的试剂盒进一步在检测范围上有所提升，能够检测出0.5％含量级别的样品，同时也能检测到25％含量级别的样品。这也说明，试剂组分及含量的优化提升了试剂盒的灵敏度。(2)批次稳定性有所提升为了确定实施例4试剂盒的批次稳定性，发明人根据本领域常用技术配置了糖化血红蛋白样品溶液(5％)，抽查五个批次的试剂盒基于上述检测方法对样品进行检测，每个批次抽查10个试剂盒，最终统计每个批次的检测结果平均值，具体结果见表4：表4第一批次第二批次第三批次第四批次第五批次实施例15.1％5％5％4.9％5％实施例45％5％5％5％5％通过表4可知，通过对试剂组分及含量的优化，本发明的试剂盒进一步在批次质量稳定性上有所提升，这说明，组分及含量的优化有助于试剂在物理化学性质上的稳定，从而保证其检测结果的稳定性。(3)等效性实验(与金标准高效液相色谱法进行方法学比对检测)为评估上述实施例所述的糖化血红蛋白检测试剂盒(微粒色谱法)及检测方法的准确性，与目前糖化血红蛋白诊断采用的金标准高效液相色谱法进行方法学比对试验。随机选取检验科正常人和糖尿病人的共100人血液，每人取二份标本，立即送检。实验步骤：1)实施例1试剂盒：按照上述实施例中所述的试剂盒的实验操作流程进行试验；2)高效液相色谱法：采用美国bio－rad公司生产的糖化血红蛋白检测试剂盒(高效液相色谱法)，按照其说明书操作流程进行试验。统计学方法：对100人的血液样本检测结果进行相关性分析，并求其相关系数。最终结论：请参见图1，数据进行相关性分析，二者检测结果高度相关，其相关系数是0.999，表明上述实施例1试剂盒检测结果和金标准检测结果等效。但高效液相色谱法检测成本高，专业性太强，受环境干扰大，稳定性差，而应用上述实施例中所述的试剂盒定量检测hba1c，成本低廉，操作简单，快速、灵敏。(4)可间断性能测试大多数情况下，对糖化血红蛋白的检测为即时性的，即采样完毕即刻检测，每次检测操作的人员、外部条件可能不同，因此难免造成误差，最终导致连续测定的结果可比性不强；对于家用检测试剂盒使用者来讲，并非是每次采完血样之后都有时间或者方便进行即刻检测。为了验证本发明的试剂盒能否克服上述技术问题，发明人进行了如下验证：随机选取检验科10名正常志愿者，抽取血样，并对血样进行如下处理：处理1：将血样立即加入实施例4的r1试剂，立即进行检测，所得糖化血红蛋白的含量分别为a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7、a8、a9、a10；处理2：将血样立即加入实施例4的r1试剂，常温保存1个月，再进行后续检测，所得糖化血红蛋白的含量分别为b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7、b8、b9、b10；处理3：将血样立即加入实施例4的r1试剂，常温保存2个月，再进行后续检测，所得糖化血红蛋白的含量分别为c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c10；最后分别比较处理1、处理2、处理3所得对应数据，看数据波动是否明显。结果显示，a1、b1、c1三数据基本没有波动，其他九组数据亦然。可见，本发明的r1试剂对样品具有质量保证作用。为了阐述上述有益效果的机理，发明人设置如下对照，该对照是上述处理3的对照，对照之处在于：对照1：采用的试剂盒是改造的，改造之处在于将实施例4的r1试剂中的表面活性剂种类改为tween20单一种类，同时表面活性剂的含量修改为0.2％w/v；对照2：采用的试剂盒是改造的，改造之处在于将实施例4的r1试剂中的0.5％w/v的叠氮化钠、0.05％w/v的bsa；对照3：采用的试剂盒是改造的，改造之处在于将实施例4的r2试剂中的六水氯化镁的含量在10mm，r4试剂中的氯化锌20mm。对对照1、对照2、对照3的数据进行统计，呈现的结果是，对照1和对照2的数据显著差于处理2，而对照3的稍差于处理2。该结果标明，之所以在本发明提供的试剂盒在处理血样之后可以延迟检测，主要原因在于试剂r1的组分种类及含量，辅助原因在于r2试剂和r4试剂的协同作用。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12