专利名称：直接快速分析微生物所含生化成分的方法与其组成的制作方法
此项发明是针对微生物所含生化分子的直接快速分析的创新，它能够避免分析这些生化分子之前的提取纯化的过程。
长期以来，人们一直是通过分析它们的生化成分来研究和定性微生物，其中DNA(脱氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)、脂肪、蛋白、糖或无机物之类需要预先进行提取、纯化。提取纯化过程，尤其是操作大量样品时，通常是人力和时间花费最多的一个步骤，除此之外，这个过程还需要用到有害试剂，产生有毒废物，这些有毒废物的处理和丢弃又花费昂贵。
举例来说，在细菌中一个含有插入片段的质粒要通过少量制备分析来筛选和确定(Ausubel et al(1989)Current Protocols in Molecular Biology.Vol 2，John Wiley& Sons，New York)。这个过程需要将转化过的细菌在液体培养基中培养一夜，第二天再将质粒DNA提取纯化出来。通常小规模质粒DNA制备包括离心，苯酚和氯仿萃取和沉淀多种步骤。纯化过的DNA通常是要先用限制性内切酶消化，然后进行电泳分析以对质粒中所含插入片段定性，这种少量制备需要至少两天的时间和人力，需要用到苯酚、氯仿之类的有毒有机物，实际上，分析所需DNA只占总制备量的百分之十。
最近一个关于小量制备质粒DNA的报道说，用改进的碱性裂解方法处理转化过的细菌来释放DNA质粒，可以在常规纯化过程的中途分析超螺旋结构的质粒，虽然这是对小量制备的一个改进，但其不足是，细菌的过夜培养，质粒的提取纯化，以及用限制性内切酶分析来确定结果这些步骤仍是不可避免(Biao et al.，BioTechniques 23601-607(1997))。
另外一种用来筛选确定重组菌株的方法是PCR-多聚酶链反应(Costa and Weinter，Strategies 735-37(1994))。这种方法不需要在液体培养中生长过夜细菌，转化培养皿上的菌株克隆可以直接用PCR检侧DNA质粒。如果质粒中含有插入片段，PCR结果就会有一条适当大小的产品。这种方法看起来似乎方便快速，但却仍然存在不少问题，例如每种质粒都要事先做多次实验来找出最佳所用引物，此过程耗费人力物力，如果插入片段比较长的话，PCR结果就不一定可靠，会含有很多杂的其它不需要的基因产品。
筛选大量数目的重组细菌克隆还可用克隆杂交和放射性自显影的方法(Sambrook etal，(1989)Molecular CloningA laboratory Manual，2nd ed，CSH Laboratory Press.Cold Spring Harbor，NY)。然而这些方法涉及到安全，环境保护和费用问题，已逐步不再作为日常研究使用的最佳方法。
总之，所有类似以上所提到的有关分析DNA的方法，RNA、蛋白、脂肪或微生物所含其它非核酸成分的各种分析方法都需要提取和纯化这个耗费人力物力的步骤。
因此，人们对发展能够从微生物中不需要提取纯化而直接分析它们的生化成分的新方法有浓厚兴趣，并且，如果这些新方法能够避免使用有害物质，将会引起更广泛的兴趣。
此项发明是根据一个微生物克隆含有足够可以用凝胶电泳检测的DNA、RNA、蛋白质等生物物质的事实，描述了一个不需要事先提取纯化就可以直接分析微生物克隆所含细胞物质的实验方法和步骤。这个新方法大量提高了现有的分析检测细胞成分的能力，使得整个过程简捷快速准确。
此项发明描述从微生物中直接快速分析其细胞成分的方法和步骤。用这种方法分析细胞成分不需要分析前的提取和纯化，因此可以用于大量样品的分析和获得准确的结果。
此项发明的一个内容是不用事先将核酸与其它细胞物质分离而可以检测到核酸的存在，其中包括(a)将微生物悬浮于含0.1％(体积/体积)-5％(体积/体积)非离子去污剂的溶液中形成第一悬浮液，其中去污剂的作用是将微生物溶解以释放出所需要核酸；(b)将第一悬浮液在65℃以上的温度范围内加热至少10秒钟；(c)将第一悬浮液和含限制性内切酶的溶液合并而形成第二悬浮液，其中的限制性内切酶用以消化核酸分子；(d)检测第二悬浮液中核酸分子的存在。
此项发明的另一个内容包括(a)将微生物悬浮于含(i)0.1％(体积/体积)-5％(体积/体积)非离子去污剂和(ii)限制性内切酶的溶液中，其中去污剂令微生物溶解并释放出核酸，而限制性内切酶紧接着会把释放出的核酸切断；(b)检测第二悬浮液中核酸分子的存在。
此项发明还有一个内容包括(a)将微生物悬浮于含有有效阻止DNA酶的活性的第一溶液而形成第一悬浮液；(b)将第一悬浮液与含有碱性缓冲液和去污剂的第二溶液合并而形成第二悬浮液，微生物中的生化物质随即被释放出来，此为第二悬浮液；(c)检测第二悬浮液中的生化物质。
此项发明的另一内容是含有上述一种或多种溶液的Kits(试剂盒)。
除以上描述的几项内容外，此项发明的其它的应用对熟悉此领域的人显而易见，在此不再赘述。
本发明是一种从微生物中直接快速分析其生化成分的新方法，这种方法可以不需经过事先提取纯化的步骤而直接分析微生物所含生化物质，因此可以用于分析大量样品和获得精确结果。
此项发明的一个内容是限制性内切酶的方法，可用来直接检测核酸的存在，勿需经过事先分离。导致这种方法的其中一个重要发现就是限制性内切酶消化对插入片段质粒DNA，基因组DNA从微生物中的释放和检测起了关键的作用。这里微生物的定义包括细菌细胞、酵母菌细胞、真核细胞、病毒(包括噬菌体)等，用这种方法检测到的核酸主要是染色体外DNA，或基因组DNA分子。根据不同的情况，这里的DNA可以是单链或双链，这里“染色体外DNA分子”是指游离基因，比如质粒或载体，这些没有结合到微生物的基因组上，可以是线性或环状的DNA，结合到微生物基因组内的外源DNA也放在基因组DNA定义之内。
此项发明可以用于各种各样的微生物，一般来说最常用的是细菌，这种转化过的带外源DNA的细菌可以从固体或液体培养基分离获得单个克隆，酵母菌克隆也可用同样方式获得，真核细胞和病毒可用各种常用方法获得，比如组织培养。
限制性内切酶方法的其中一项内容是将微生物悬浮于第一溶液中，该溶液含有离子或非离子去污剂。所用去污剂的浓度由经验决定，前提是不影响接下来所用的限制性内切酶的活性，第一溶液可以是水溶液，其的作用是溶解微生物，去污剂的浓度可以在0.1％到5％(体积/体积)之间，也可以在0.1％到2.5％之间，或者在0.25％到1.5％之间。0.5％左右的非离子去污剂能有效的溶解细胞壁和细胞膜，进而释放细胞物质包括DNA的作用。这里所用的非离子去污剂包括Triton X-100，Tween-20，NP-40，或者厨房用去污剂，为了达到最佳效果，最好选用Triton X-100，因为这种去污剂比较温和，不会抑制接下来所用的限制性内切酶的活性，同时促使限制性内切酶更好地接触到所要消化的DNA。
除了非离子去污剂之外，所用第一溶液可以含有常用缓冲液，例如Tris-HCl(pH8.0)或STET及其它不影响酶活性的成分，例如RNA酶，溶菌酶等，因SDS或EDTA可能会明显影响酶活性，所以一般要避免将此类成分加入第一溶液。
微生物用上述第一溶液悬浮后，会被溶解并释放出包括核酸在内的胞质，形成含核酸分子的第一悬浮液。为了减少微生物本身所含内源性DNA酶对质粒或基因组DNA的破坏，在加入限制性内切酶之前，应将第一悬浮液加热以使内源性DNA酶失活，另外，过长或过高温度加热后，双链DNA会变性为单链形式，这样就不会被限制性内切酶切断和释放出来。
根据上述原因，可将第一悬浮液在65℃以上温度至少加热10秒钟，最好加热30秒钟左右以达到使内源性DNA酶失活的最佳效果。另一种做法是将第一悬浮液在100℃至少加热10秒钟，最好加热1分钟左右以达到使内源性DNA酶失活的效果。加热时间和温度可根据经验和需要自行决定。
上述第一悬浮液，不需经过提纯就可以与含有限制性内切酶的第二溶液混合起来，在此称为第二悬浮液。第二悬浮液所含成分或缓冲液可根据不同的限制性内切酶的要求而定，酶反应时间和温度也据不同要求而定，限制性内切酶消化过程被认为是使DNA释放的一个重要的步骤。
应用限制性内切酶的方法最好选用第二类内切酶比如EcoRI，NdeI，XhoI，NotI，BamHI，HindIII。因为这些内切酶可以认得特殊的核酸序列，其活性也容易被监测和调节(请参见New England Biolabs产品目录)。当然如果需要的话，此方法也可以用于其它种类的限制性内切酶。
被限制性内切酶消化过的核酸分子可以用已知的多种方式检测。例如凝胶电泳，Southern转移分析，Northern转移分析，多聚酶链反应，层析等。这些都是日常操作中常用的技术。此方法还可以检测到载体所含插入片段的长短。
限制性内切酶的方法的另一项内容，将微生物悬浮于含有去污剂和限制性内切酶的单一溶液中。去污剂的浓度在0.1％-5％(％(体积/体积)，或者0.1％-2.5％，也可以在0.25％-1.5％，最好在0.5％(体积/体积)左右，这里去污剂用来释放核酸，限制性内切酶随之将其消化，接下来再用以前所叙述方法进行分析，所用溶液最好含有0.5％ Triton X-100，10mM Tris-HCl和1mM EDTA。
此项发明的另一项内容是用化学方法来直接检测微生物所含生化成分，勿需经过事先将生化成分与其它细胞物质分离的过程。这里“生化成分”是指核酸(DNA，RNA)及类似物、蛋白质、脂肪或糖类。这里“DNA”是指微生物的基因组或者染色体外的DNA，根据微生物来源可为单链或双链。“染色体外DNA”是指游离体，可为线性或环状的质粒或载体，“RNA”可包括微生物的基因组，染色体外组分、载体、转移核糖核酸、信息核糖核酸、细胞核糖核酸或者核蛋白体核糖核酸。根据其微生物来源，这些核糖核酸也可以是双链或单链形式。“类似物”这里是指含有非自然或合成碱基或改进过主链的(比如核酸肽)或含硫、氧、氮的核酸，它可以是单链或双链。
基于上述内容，本发明发现，当对质粒DNA进行凝胶电泳时，特定的碱性条件是使超螺旋DNA呈现为一条清晰电泳带的重要因素之一。此项发明的内容之一，是将微生物悬浮于含有阻止DNA酶活性成分的第一溶液。这种用来阻止DNA酶活性的成分可为任何已知DNA酶抑制剂，比如EDTA，其浓度在0.1mM-100mM，也可在0.1mM-50mM，或0.2mM-25mM，如果可能，最好是10mM。除此之外，第一溶液还可为任何类型的缓冲液。只要所选用缓冲液不含影响从微生物中释放生化成分以及其检测的成分，缓冲液最好选用含Tris-HCl系统，其浓度在1mM到300mM范围之内。
在化学方法里所用的第一溶液中含有一种去污剂，可以是Triton X-100，Tween-20，NP-40，含N-甲基甘氨酸的去污剂，SDS等，去污剂的浓度可在0.1％-10％(体积/体积)，或者0.1％-5％(体积/体积)，也可以在0.1％-2.5％(体积/体积)的范围，最好是0.5％(体积/体积)左右。其中最常用的第一溶液中含有50mM的Tris-HCl(pH8.0)，10mM的EDTA，还有0.5％(体积/体积)的Triton X-100和100微克/毫升的RNA酶A。
将微生物悬浮于第一溶液后，将这第一悬浮液与第二溶液相混合形成第二悬浮液。第二溶液含(i)碱性缓冲液和(ii)去污剂。这种碱性缓冲液可以是任何pH大于7的缓冲液。通常是pH大于8，还可以大于9，大于10，大于11，最好能达到大于12，只要不影响检测到第二悬浮液中所含生化物质的能力就更好，可选用碱性缓冲液包括含羟基的氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化钙，其中最好选用氢氧化钠，这些碱性缓冲液的浓度在0.2％到1.6％之间，有时浓度也选在此范围之外。
化学方法中所用的第二溶液也可含有Triton X-100，Tween-20，NP-40或者是含N-甲基甘氨酸的去污剂，SDS等。去污剂的浓度是0.1％-10％(体积/体积)，或0.1％-5％(体积/体积)，还可以是0.1％-2.5％(体积/体积)，最好是0.5％(体积/体积)，最常用的第二溶液含有0.8％(体积/体积)的氢氧化钠，0.5％(体积/体积)的SDS，0.5％的甲基甘氨酸和0.2％的Tween-20，所有上述溶液都可按所需加上用于琼脂糖凝胶电泳的分子量指示剂。
化学方法中的特别一项内容是，可以只用一种溶液来悬浮所研究微生物，这种溶液是由上述第一和第二溶液组成，然后再用已知技术对所含生化成分进行分析。
针对以上所描述的限制性内切酶方法和化学方法这两项内容，有以下几点注意事项(1)应用于任何形式的细菌克隆菌落，新鲜培养液和甘油菌种，此方法或此试剂盒(Kit)可用于筛选含质粒的任何形式的细菌固体培养基克隆菌落，新鲜培养液和甘油菌株，在凝胶分析中，固体培养基克隆菌落产生较强的质粒DNA带，而液体培养细菌DNA在胶上的背景比较清晰。
(2)细菌在培养基上长20个小时以上。可根据具体情况在第一天早晨做细菌转化，第二天做质粒筛选。这样就可以将细菌培养至少二十小时以上，大的，长得好的克隆较容易分析，若要得到大而分离好的克隆，一个培养皿上只能接种少于300个的克隆。
(3)筛选液体培养基中的细菌。培养过夜的液体培养基或甘油贮藏的细菌可以用大规模和酶解方法检测细菌克隆，取1～3微升的液体细菌就可以进行筛选。如果细菌长得不够浓，则将细菌体积增加到5微升。将酶解方法中的反应体积增加到15至20微升。根据需要可取更大的液体细菌体积来进行筛选，但是建议做前先离心。
(4)用新鲜配制的琼脂培养基。用新鲜配制的琼脂培养基培养筛选用的细菌。
(5)1-2天的细菌克隆效果最好。贮放在4℃的固体培养基培养的细菌经过几天就会变的又干又硬。一般超过3天的克隆不宜于做酶解，7天老的细菌不宜于用化学筛选的方法。
(6)建立用于储藏菌种的培养皿来转移菌株。
(7)用过量限制性内切酶来酶解通常每次酶解反应需0.5个单位的限制性内切酶，酶解时间根据酶的用量而定，通常一个单位酶在一次酶解反应中需要保温20-30分钟，而1微升的酶(10-20单位)通常只需要5分钟的保温。
(8)用两个限制性内切酶进行酶解。当用到两个限制性内切酶进行酶切时，常常需要用到两个不同的缓冲液，这种情况下，应该先用低盐的缓冲液以10微升的体积使第一个酶解反应进行10分钟，然后再加上第二种缓冲液到15-20微升的体积。
(9)先加样，后将胶放入电泳缓冲液。为了避免样品流失，应先将样品加到琼脂胶上的样品槽内，然后再把胶放在电泳缓冲液中。
(10)制备新鲜的琼脂胶。建议用新鲜制备的琼脂胶(灌胶三十分钟之内)，原因是在上样的时候，如果胶太干，会吸收样品，甚至样品会渗透到样品槽的两边而使其分离。
(11)琼脂胶的染色胶和缓冲液中不含溴乙啶(EB)，电泳结束以后再染色。
(12)用新鲜制备的溴乙啶染色液。可以从溴乙啶的浓缩液(10毫克/毫升)来制备新鲜染液。用过的溴乙啶染液，比如超过一天的用过的染液令胶的背景明显增高，造成观察所要DNA的困难。
(13)用低浓度的溴乙啶染色。高浓度的溴乙啶染液会增加胶的背景，造成观察所要DNA的困难，用少于0.5微克/毫升的溴乙啶染液来做电泳后的染色需要稍长的时间(十分钟以上)。
(14)用超螺旋DNA作胶上其它DNA带的参考，超螺旋载体DNA在琼脂胶电泳上的迁移速度与线形DNA不同。
(15)照相分析结果。所要DNA有时会因为质粒在细菌中的复制数较低而不能够直接在胶上被看到，用大孔径(4.5)和长曝光(2-5秒)照相可分析筛选结果并对其存档。
(16)胶上跑得最快的DNA带是目标。在大规模筛选实验中，如果所挑选的克隆足够大而且跑胶时间足够长的话，每个克隆的DNA可以跑出四条带，跑得最快的带最亮，最具有信息性，所以这条带常用来与对照用的标准DNA来作比较。有时候在胶的前沿可看到非核酸物质和分解的RNA。这种情况更需要用超螺旋的标准带或线形的标准带来确定所要DNA的位置。另外，如果可能，最好也同时用一个不带DNA插入片段的载体作标准对照。
(17)增加DNA带的信号强度生长良好的细菌的培养，新鲜培养的大的菌株克隆可以产生强的DNA带以便于确认重组克隆。
此项发明的另一些内容是针对由上述一种或多种溶液组成的试剂盒(Kit)。
图1.用限制性内切酶消化的方法，将DNA从细菌中释放出来，从过夜培养的培养板上挑取经pcDNA3质粒转化的菌落，悬浮在含0.5％Triton X-100的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液中，然后用EcoRI(1)，SacII(3)和失活的SacII(4)进行消化。第二组(2)是阴性对照，未用限制性内切酶进行消化。M道是Lambda DNA/HindIH分子量标准。
图2A-D.在限制性内切酶消化的方法中，对含有质粒的转化菌落进行分析。质粒中所含的插入片段的大小分别为0.28Kbp(图2A)；0.68Kbp(图2B)；0.9Kbp(图2C)和2.5Kbp(图2D)。各图中右侧一道为Lambda DNA/HindIH分子量标准。
图3.在限制性内切酶消化方法中，不同去污剂对质粒DNA从细菌中释放出来的影响，挑取过夜培养的转化菌落，悬浮在10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液中，该溶液分别含有0.5％Triton X-100，0.5％SDS，0.2％Tween-20或0.5％NP-40，然后用NheI/XhoI进行消化。M道是Lambda DNA/HindIH分子量标准。
图4.将转化菌落A在下述溶液中用NheI/XhoI限制性内切酶进行消化第1-3道水；第4-6道10mM Tris-HCl(pH8.0)；第7-9道0.1％Triton X-100和10mMTris-HCl(pH8.0)；第10-12道0.5％Triton X-100和10mM Tris-HCl(pH8.0)；第13-15道1.0％Triton X-100和10mM Tris-HCl(pH8.0)；第16-18道2.5％Triton X-100和10mM Tris-HCl(pH8.0)；第19-21道5.0％ Triton X-100和10mM Tris-HCl(pH8.0)。
图5.在限制性内切酶消化方法中，加热对质粒DNA从细菌中释放出来的影响。挑取过夜培养的转化菌落，悬浮于含0.5％Triton X-100和10mM Tris-HCl(pH8.0)的溶液中，按所示的时间在100℃加热后，用NheI/XhoI限制性内切酶消化及电泳，M道是LambdaDNA/HindIH分子量标准。
图6.在限制性内切酶消化方法中，加热对质粒DNA从细菌中释放出来的影响。挑取过夜培养的转化菌落，悬浮于含0.5％Triton X-100和10mM Tris-HCl(pH8.0)的溶液中，按所示的时间在65℃加热后，用NheI/XhoI限制性内切酶消化及电泳，M道是LambdaDNA/HindIH分子量标准。
图7.在限制性内切酶消化方法中，微波处理对质粒DNA从细菌中释放出来的影响。挑取过夜培养的转化菌落，悬浮于含0.5％ Triton X-100和10mM Tris-HCl(pH8.0)的溶液中，按所示的时间在微波炉中处理后，用NheI/XhoI限制性内切酶消化及电泳，M道是Lambda DNA/HindIH分子量标准。
图8.用化学方法释放DNA后进行分析，第3，4，5，9，14，16和18道是重组质粒，含有2.5Kbp的插入片段，S道是超螺旋结构的DNA标准(分别为2.9，3.9，5.4和10Kbp)，M道是LambdaDNA/HindIII分子量标准。
图9A-B.对6个重组质粒(第1-6道)进行琼脂糖凝胶分析。图A是用化学方法将质粒从细菌中释放出来；图B是用小量制备/限制性内切酶方法。图A的C道是5.4Kbp的未经消化的载体质粒但不含插入片段，M道是Lambda DNA/HindIII分子量标准。
图10.在化学方法释放DNA的方法中，Tris和NaOH的浓度和比例对质粒DNA构形的影响。用下述4和浓度的NaOH处理20ng质粒DNA，浓度10.2％NaOH；浓度20.4％NaOH；浓度30.8％NaOH和浓度41.6％NaOH。所含Tris-HCl(pH8.0)的浓度如图所示。
图11.在化学方法释放DNA的方法中，Tris-HCl的浓度对DNA释放的影响，将培养板上的单个菌落悬浮在含有所示浓度的Tris-HCl(pH8.0)悬浮溶液中，然后用含有0.8％NaOH和1％SDS的溶液处理及在琼脂糖凝胶中电泳。
图12.用不同的悬浮溶液和变性溶液进行组合，然后比较不同的组合对DNA释放的效果。组合(1)50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA和0.8％NaOH，1％SDS；组合(2)50mMTris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA和0.8％NaOH；组合(3)50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA和1％SDS；组合(4)50mM Tris-HCl(pH8.0)和0.8％NaOH，1％SDS；组合(5)10mM EDTA和0.8％NaOH，1％SDS；组合(6)0.5％ Triton X-100和0.8％NaOH，1％SDS。
图13.在化学方法释入DNA的方法中，不同去污剂对DNA释放的影响；第1-3道，悬浮溶液(50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA)和变性溶液(0.8％NaOH，1％SDS)；第4-6道，悬浮溶液(50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA)和变性溶液(0.2％Triton X-100，0.8％NaOH，1％SDS)；第7-9道，悬浮溶液(50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA)和变性溶液(0.2％ Tween-20，0.8％NaOH，1％SDS)；第10-12道，悬浮溶液(50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA)和变性溶液(0.2％NP-40，0.8％NaOH，1％SDS)。
图14.在化学方法释放DNA的方法中，比较SDS和甲基甘氨酸的作用，第1-3道，变性溶液(0.8％NaOH，1％SDS)，第4-6道，变性溶液(0.8％NaOH，1％甲基甘氨酸)。
图15.用限制性内切酶消化方法从甘油贮存菌种中释放质粒DNA。第1-5道是用限制性内切酶消化方法释放DNA，用NheI/XhoI消化后，可见2.5Kbp的插入片段。所用的细菌数量分别为0.5，1.0，1.5，2.0和2.5μl。
图16.用化学方法从菌落中释放RNA并在1％的琼脂糖凝胶中电泳分析，悬浮溶液为300mM Tris-HCl，pH8.0，变性溶液为0.4％NaOH和1％SDS。
图17.用限制性内切酶的方法从菌落中直接释放基因组DNA并在琼脂糖凝胶中电泳分析。将单个DH10B菌落悬浮在含有0.5％Triton X-100，10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液中，用EcoRI在37℃下消化16小时。
这些发明的进一步详情将由以下多具实例来说明。
实例1用限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳释放和分析DNA质粒将含有插入片段0.28kbp，0.68kbp，0.9kbp或2.5kbp的载体pcDNA3.1(Invitrogen)转化进大肠杆菌的Top10F’中，在含氨苄青霉素的培养基上培养过夜。第二天，那些大约1-2mm直径大小的，互相分离的很好的克隆被挑选出(在无菌情况下)，将每个克隆的一部分(约有25-50％)置入8微升含0.5％Triton X-100的10mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中。在每个样品中加上2微升的限制性内切酶混合液(1微升10倍浓的限制性内切酶缓冲液和1微升的限制性内切酶，EcoR I，Sac II或没有活性的SacII，每个反应中加0.5个单位)，然后在37℃保温30分钟，将样品加到0.8％-1.2％的琼脂糖凝胶上，用1倍的TAE或TBE电泳液对其进行电泳。电泳结束后，将胶放在0.5微克/毫升的溴乙啶中染色，DNA就可以在紫外照光仪上看到。
如图1所示，用EcoR I或Sac II酶解后，质粒DNA和染色体DNA可被释放出来并被检测。但是在未经酶解或用失活的酶进行酶解的样品中，未能测到DNA。因此，在DNA从细菌中释放出来的过程中，酶解起到了关键的作用。也可以说，酶解在观测DNA中起到了关键的作用。
另外，同上述方法同样处理含带有插入片段0.28kbp-2.5kbp质粒的转化过的细菌，但用下列不同的限制性内切酶来消化和释放DNA图2A-Nhe I/Hind III，图2B-Nhe I/BamH I，图2C-Not I/BamH I和图2D-Nhe I/Xho I。如图2A-D所示，每个质粒所含的插入片段被释放和确认出来，证明用此方法可以确定不同大小的插入片段。
实例2在限制性内切酶消化方法中，去污剂对DNA的释放和凝胶电泳分析的影响在下列实验中，对含有0.5％Triton X-100，0.5％SDS，0.2％Tween-20或0.5％NP-40的10mM Tris-HCl(pH8.0)进行了比较。将克隆A(带有2.5kbp插入片段的5.4kbp的质粒，插入片段的两端是Nhe I和Xho I酶切位点)转化到大肠杆菌的DH10B菌种中，在含氨苄青霉素的培养基上培养过夜。第二天，将互相之间分离的很好的，直径约1-2毫米的三个克隆的25-50％悬浮于8微升的10mM Tris-HCl(pH8.0)的缓冲液中，其中分别含有0.5％Triton X-100，0.5％SDS，0.2％Tween-20或者是0.5％NP-40，将每个样品中加入2微升的限制性内切酶混合液(1微升10倍浓的限制性内切酶反应液和1微升的限制性内切酶)，然后在37℃保温30分钟。将样品加到0.8％-1.2％琼脂糖凝胶上，用1倍的TAE或1倍的TBE电泳缓冲液进行电泳，电泳结束后，将胶放在0.5微克/毫升的溴乙啶中染色，就可以在紫外照光仪上看到DNA。
图3中的结果显示，用含Triton X-100，Tween-20或Np40的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液处理，克隆A释放出其所含2.5kbp的插入片段，但是用含SDS的缓冲液处理过的克隆A没有释放出其插入片段。原因很可能是SDS使限制性内切酶失活。
进一步的实验证明，TritonX-100在10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液中的浓度可以是0.1％到5％不等。0.5％Triton X-100是理想浓度。实验中，克隆A分别被加入到(1)水，(2)10mMTris-HCl(pH8.0)，(3)10mM Tris-HCl(pH8.0)含0.1％Triton X-100，(4)10mM Tris-HCl(pH8.0)含0.5％Triton X-100，(5)10mM Tris-HCl(pH8.0)含1％Triton X-100，(6)10mMTris-HCl(pH8.0)含2.5％Triton X-100，(7)10mM Tris-HCl(pH8.0)含5％Triton X-100，然后用Nhe I/Xho I酶解。如图4所示，Triton X-100浓度在0.1％到5％之间，DNA可以被消化和释放出来，其中0.5％的浓度效果最好。
实例3在限制性内切酶消化方法中，温度对DNA释放的影响因为细菌自身含有象DNA酶这样的内源性核酸酶，这些酶可能会消化质粒DNA，所以我们对加热使酶失活的影响作了研究。从琼脂糖培养皿上取转化过的克隆A，将其悬浮在含0.5％Triton X-100的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液中(见例1)，先将其在100℃加热10-180秒或65℃加热1-10分钟，然后再进行Nhe I/Xho I酶解(参见实例2)。如图5所示，100℃加热10-60秒种的质粒DNA产量比没有加热的要高，然而加热90秒产量反而降低，并且如在100℃加热180秒的话，质粒DNA就观察不到)。同样地，在65℃加热1，5或10分钟都改善了质粒DNA的产量，而未加热过的样品显示出质粒DNA分解的现象(图6)。
我们还测验了微波炉处理对内源性核酸酶的失活及质粒DNA释放的影响，样品同样悬浮在上述的溶液中，在微波炉中以最高的温度加热0.5-3.0分钟，结果证明质粒DNA被充分释放出来，并被接下来的限制性内切酶消化。此例中，电泳结果显示，比起在100℃加热30秒钟的样品，这种微波炉处理过的质粒DNA带在胶上有扩散现象(图7)。
实例4不同的限制性内切酶对各种细菌菌种的DNA的释放和分析本实验证明不同的限制性内切酶可以直接分析各种细菌菌种所含质粒DNA。将克隆A转化到大肠杆菌的XL1Blue，DH5a，NM522，JM109，DH10B和Top10F’这些菌种内，将其在含氨苄青霉素的LB琼脂培养皿上培养过夜。取单个克隆的一部分悬浮在8微升含0.5％Triton X-100的10mM Tris-HCl(pH8.0)，然后再分别加入2微升的含EcoR I，Nhe I，XhoI，Xba I，Not I，Cal I，HindIII，BanH I，SacII或BstEII的溶液酶解，然后电泳分析(参见实例1)。结果证明，各种限制性内切酶对不同种菌种释放质粒DNA的结果雷同。
实例5化学处理法从细菌中释放和分析DNA将克隆A或者5.4kbp的质粒(不含其2.5kbp插入片段的克隆A)转化到LB琼脂培养皿上培养过夜。挑选18个分离好的直径约1-2毫米的克隆，分别将这些克隆中约25-50％的细菌挑出来，放在4微升含10mM EDTA的50mM Tris-HCl，pH8.0(悬浮溶液)中。每个样品再加入4微升的0.8％NaOH，1％SDS(变性溶液)。然后将样品加到0.8％到1.2％的琼脂胶上，用1倍的TAE或1倍的TBE缓冲液进行电泳。电泳结束后将胶放在0.5微克/毫升的溴乙啶中染色，用紫外照光仪观测DNA。
图8中结果显示，确认的7个含克隆A的质粒在胶上的迁移速度比只含5.4kbp的载体慢。为了进一步证实此结果，将另外6个含0.9-2.5kbp插入片段的重组细菌进行化学处理，并进行传统的小量制备/限制性内切酶消化。如图9A所示，用化学方法直接分析的重组质粒，在胶上迁移速度的减小与其插入片段的大小成比例。图9B所示的用传统的小量制备/限制性内切酶消化的方法也得到一致结果。
用以上描述的化学方法从大肠杆菌XL1blue，DH5a，NM522，JM109，DH10B和Top10F’分析质粒DNA，每个菌种的DNA都成功地被释放出来和被分析，对那些含质粒复制数较低的菌种增加所用细菌量可以达到同样的DNA产量(数据未示出)。
实例6 Tris和NaOH浓度对质粒DNA结构及其电泳迁移的影响为了测验前例所描述化学方法中NaOH/Tris比例对质粒DNA的结构及其在电泳中迁移的影响，取20ng的质粒DNA，置入4微升溶液(分别含50mM，100mM，200mM或300mM的Tris-HCl，pH8.0和10mMEDTA)。再加入4微升的变性溶液(分别含0.2％，0.4％，0.8％或1.6％NaOH和1％SDS)。结果如图10所示，质粒DNA的结构取决于Tris-HCl和NaOH的相对浓度。高浓度的NaOH降低线形质粒的量而高浓度Tris增加线形质粒的量。在NaOH与Tris的比值很高时，线形的质粒消失，形成一条很强的超螺旋质粒DNA带。
为了测验Tris浓度对细菌释放DNA及其在电泳中的迁移的影响，从培养过夜的转化培养皿上挑出不同的克隆A，分别悬浮在4微升含50mM，100mM，200mM，300mM，500mM，1000mM或2000mM Tris-HCl(pH8.0)和10mMEDTA的溶液中，并接下来加入4微升的0.8％NaOH和1％SDS。如图11所示，50-300mM的Tris(pH8.0)，释放出最多的质粒DNA，200-300mM的Tris-HCl浓度，因释放出染色体DNA的量减少而使的背景比较清晰。浓度在500mM以上的Tris-HCl，明显地降低了质粒DNA和染色体DNA的量，并且使其在胶上的迁移速度降低。
实例7化学处理释放质粒DNA方法的组成成分分析用下列不同浓度的悬浮溶液和变性溶液来分析其对细菌释放质粒DNA的影响①50mM Tris-HCl(Ph8.0)，10mM EDTA，0.8％NaOH，1％SDS；②50mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA，0.8％NaOH；③50mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA，1％SDS；④50mMTris-HCl(pH 8.0)，0.8％NaOH，1％SDS；⑤10mM EDTA，0.8％NaOH，1％SDS和⑥0.5％TritonX-100。
用五种不同的悬浮溶液和变性溶液处理经克隆A转化过的大肠杆菌的克隆，然后用凝胶电泳分析结果。如图12所示，所有五种处理都有质粒DNA的释放。然而在只用0.8％NaOH作为变性溶液时减低了DNA在胶上的迁移。相反，1％SDS变性溶液增加了染色体DNA的迁移率，并与质粒DNA混在一起难以分辨。与10mM EDTA相比，50mM的Tris-HCl悬浮溶液能够更好地释放细菌中DNA，有趣的是，可以用于克隆的限制性内切酶分析的Triton X-100，非常有效地释放出质粒和基因组DNA。
我们还测验了加入悬浮溶液或变性溶液中的Triton X-100，Tween-20和NP-40对DNA释放的影响。如图13所示，在变性溶液中加入0.2％的Triton X-100，Tween-20或NP40增加DNA的释放，其中Tween-20结果最好，在悬浮溶液中加Tween-20或NP-40不改善DNA的释放(数据未示出)。
在变性溶液中加1％SDS的缺点是会在贮存时形成沉淀。为了避免产生沉淀。用在变性溶液中加1％的N-甲基甘氨酸来取代SDS，N-甲基甘氨酸不会在贮存期间形成沉淀(数据未示出)并使胶的背景更清晰(图14)，但是N-甲基甘酸不能够从XL1Blue这种菌种或从甘油贮藏的细菌中有效地释放出质粒DNA(结果未示出)。
实例8甘油贮藏细菌中质粒DNA的释放及分析这个实验证明可以从甘油贮藏的细菌中直接释放和分析质粒DNA。将以克隆A转化过的大肠杆菌在甘油冰冻贮存。解冻后分别取0.5，1.0，1.5，2.0和2.5微升，加入含0.5％Triton X-100和10mM Tris-HCl，pH8.0的悬浮溶液中到8微升的体积。每个样品再加上2微升的酶解混合液(1微升的10倍的反应液，0.5微升的Nhe I和0.5微升的Xho I)，在37℃保温30分钟，将样品加到0.8％到1.2％的琼脂糖凝胶上，用1倍的TAE或1倍的TBE电泳液进行电泳。电泳结束后的胶放入0.5微克/毫升的溴乙啶染色，用紫外光照光仪观测DNA。
如图15所示，用限制性内切酶消化来释放DNA，仅0.5微升的甘油细菌就可给足够可以观察到的DNA，用实例5中描述的化学方法从甘油储存细菌中同样可以释放和分析其DNA。
实例9 RNA的直接分析用改进过的化学方法直接从细菌中释放和分析RNA。从克隆A转化的过夜培养的大肠杆菌培养皿上挑出单个克隆，将其悬浮在4微升300mM的Tris-HCl，pH8.0(RNA悬浮溶液)，再与同体积的0.4％NaOH，1％SDS(RNA变性溶液)相混合，在1％的琼脂糖凝胶上电泳。如图16所示，用这种技术很容易被观测到所得到的核糖体23S，16S和5S RNA。
实例10基因组DNA的直接分析将培养过夜的四个单个的大肠杆菌DH10B克隆分别悬浮在8微升的0.5％Triton X-100，10mM Tris-HCl，将每个样品再加入2微升的酶解混合液(1微升的10倍反应液，1微升的EcoR I)，在37℃保温16小时。将样品加到0.8％到1.2％的琼脂糖凝胶上，用1倍的TAE或1倍的TBE电泳缓冲液进行电泳，电泳结束后将胶放在0.5微克/毫升的溴乙啶中染色，用紫外光照光仪观测DNA。如图17所示，EcoR I酶解过的基因组DNA可以被有效的释放出来。
上述细节可以用来应用本发明。基于上述细节，用本发明的内容内行的人可以做出类似的，可靠的方法来获得同样的结果。然而，本发明的全部内容并不局限于上述文中的细节。所附权利请求条款才是本发明内容的法律依据，所引用的文献均已注明为参考文献。
权利要求
1.一种用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是本方法不需要将核酸分子预先与其它细胞成分分离，该方法包涵下述内容和步骤(a)将上述微生物悬浮于第一溶液中，致使上述微生物溶解并释放上述核分子，形成第一悬浮液；(b)将上述第一悬浮液在至少65℃左右加热至少10秒钟左右，该步骤并非必须；(c)将上述第一悬浮液和第二溶液合并形成第二悬浮液，第二溶液中含有限制性核酸内切酶，用于消化上述核酸分子；(d)检测第二悬浮液中的核酸分子。
2.根据权利要求1所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是第一溶液含有约0.1％(体积/体积)到约5％(体积/体积)的非离子去污剂。
3.根据权利要求2所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是所述的非离子去污剂由Triton X-100，Tween-20和NP-40当中所选取。
4.根据权利要求2所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是所述的非离子去污剂是Triton X-100。
5.根据权利要求1所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是所述的第一溶液是水。
6.根据权利要求1所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是所述的微生物选于细菌，真菌，真核细胞和噬菌体。
7.根据权利要求1所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是所述的微生物是细菌。
8.根据权利要求1所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是用凝胶电泳的方法来实行(d)步骤的检测。
9.根据权利要求8所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是所述的凝胶电脉能够辨别所述核酸分子量的大小。
10.根据权利要求1所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是所述的核酸分子几乎完全被所述的限制性核酸内切酶所消化。
11.根据权利要求1所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是所述的第1溶液中不含SDS或EDTA。
12.根据权利要求1所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是所述的核酸分子不是微生物的内源性核酸分子。
13.根据权利要求1所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是没有用多聚酶链反应的方法来扩增核酸分子的步骤。
14.根据权利要求1所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是所述的第一溶液含有Tris-HCl。
15.一种用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是本方法不需要将核酸分子预先与其它细胞成份分离，该方法包涵下述内容的步骤(a)将所述的微生物悬浮于含有限制性核酸内切酶的溶液中，该溶液能裂解所述的微生物并从该微生物中释出核酸分子，所述的限制性核酸内切酶消化所释出的核酸分子，所述的悬浮步骤产生出了悬浮液；(b)在该悬浮液中检测所述的核酸分子。
16.根据权利要求15所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是所述的溶液中含有0.1％(体积/体积)到5％(体积/体积)的非离子去污剂。
17.一种用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是本方法不需要将生物化学组分预先与其它的细胞成份分离，该方法包涵下述内容的步骤(a)将所述的微生物悬浮于第一溶液中形成第一悬浮液，在第1溶液中含有有效阻止DNA酶活性的组份；(b)将第一悬浮液和第二溶液合并形成第二悬浮液，第二溶液中含有碱性缓冲液和去污剂，所述的生物化学组份由所述的微生物中释出；(c)检测第二悬浮液中的生物化学组份。
18.根据权利要求17所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是所述的生物化学组份是核酸分子。
19.根据权利要求18所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是所述的核酸分子是DNA。
20.根据权利要求17所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是所述能有效阻止DNA酶活性的组份是EDTA。
21.根据权利要求17所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是所述的第一溶液由Tris-HCl和EDTA所组成。
22.根据权利要求17所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是所述的第一溶液由约10mM Tris-HCl，约1mM EDTA和约0.5％(体积/体积)Triton X-100所组成。
23.根据权利要求17所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是所述的碱性缓冲液是含羟基的缓冲液。
24.根据权利要求23所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是所述的含羟基缓冲液是氢氧化纳或氢氧化钾。
25.根据权利要求17所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是所述的去污剂由Triton X-100，Tween-20，NP-40，SDS或甲基甘氨酸组成。
26.根据权利要求17所述的用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是所述的第二溶液由约0.8％(体积/体积)氢氧化纳，约0.5％SDS，约0.5％甲基甘氨酸和约0.2％Tween-20所组成。
27.一种用于检测微生物中核酸分子的方法，其特征是本方法不需要将生物化学组份预先与其它细胞成份分离，该方法包涵下述内容和步骤(a)将所述的微生物悬浮于一种溶液中，该溶液由(i)有效阻止DNA酶活性的组份(ii)碱性缓冲液和(iii)去污剂所组成，所述的生物化学组份由所述的微生物中释出后形成悬浮液；(b)检测所述悬浮液中的生物化学组份。
28.一种试剂盒，其特征是在试剂盒中包含下述溶液(a)由约0.1％(体积/体积)到约5％(体积/体积)的去污剂所组成的第一溶液；(b)由限制性核酸内切酶所组成的第二溶液。
29.根据权利要求28所述的试剂盒，其特征是所述的去污剂由Triton X-100，Tween-20和NP-40中所选取。
30.根据权利要求28所述的试剂盒，其特征是所述的第一溶液的组成成份为(a)约10mM Tris-HCl(pH 8.0)；(b)约0.5％ Triton X-100；(c)约1mM EDTA。
31.一种试剂盒，其特征是在试剂盒中包含下述溶液(a)第一溶液由能有效阻止DNA酶活性的组份和0.1％(体积/体积)到5％(体积/体积)的非离子去污剂所组成；(b)第二溶液由碱性缓冲液和去污剂所组成。
32.根据权利要求31所述的试剂盒，其特征是所述能有效阻止DNA酶活性的组份是EDTA。
33.根据权利要求31所述的试剂盒，其特征是所述碱性缓冲液是含羟基的缓冲液。
34.根据权利要求31所述的试剂盒，其特征是所述的去污剂由Triton X-100，Tween-20，NP-40，甲基甘氨酸和SDS中所选取。
35.根据权利要求31所述的试剂盒，其特征是所述的第一溶液由约10mM Tris-HCl，约1mM EDTA，约100微克/毫升RNase A和约0.5％Triton X-100所组成。
36.根据权利要求31所述的试剂盒，其特征是所述的第二溶液由约0.8％NaOH，约0.5％SDS，约0.5％甲基甘氨酸和约0.2％Tween-20所组成。
37.根据权利要求31所述的试剂盒，其特征是含有至少一个分子重量的指示剂用于琼脂糖凝胶电泳。
全文摘要
本发明简述用于直接和快速分析微生物中的生物化学组份的方法和组成成份。应用本发明的方法和组成成份,可在分析生物化学组份前免去提取和纯化步骤。
文档编号C12N15/10GK1243955SQ9910313
公开日2000年2月9日 申请日期1999年3月23日 优先权日1998年3月26日
发明者韩晓亮, 王万恒 申请人:韩晓亮, 王万恒