一种微生物联合培养生产1,5-戊二胺的方法
【专利摘要】本发明公开了一种微生物联合培养生产1,5?戊二胺的方法。该方法包括：配种子培养基、发酵培养基、葡萄糖补料培养液、甘油补料培养液、乳糖诱导液以及赖氨酸溶液；对发酵罐，步骤1中的培养基以及三角瓶灭菌，其中步骤1中发酵培养基中的葡萄糖单独灭菌；取三角烧瓶接入种子培养基，分别接入产丁二酸菌和产赖氨酸脱羧酶菌培养后作为发酵菌种；向装有发酵培养基的发酵罐中通入无菌空气或纯O2，接入产丁二酸菌和产赖氨酸脱羧酶菌作为出发菌株，并加入葡萄糖补料培养液、甘油补料培养液和乳糖诱导液，控制菌体比生长速率发酵；厌氧转化阶段，控制葡萄糖浓度和pH即得产物1,5?戊二胺的方法。本发明方法简单易行，节约成本。
【专利说明】
-种微生物联合培养生产1，5-戊二胺的方法
技术领域
[0001] 本发明设及1,5-戊二胺发酵和生物催化领域，具体设及一种微生物联合培养生产 1,5-戊二胺的方法。
[0002]
【背景技术】
[0003] 1,5-戊二胺（1,5-pentanediamine )，又名尸胺（Cadaverine)、1,5-二氨基戊烧、 五亚甲基二胺或尸毒素，是生物胺类(包括腐胺、精胺、亚精胺和尸胺等）中的一种，是生物 体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱，为蛋白质腐败时赖氨酸在脱簇酶作用下发生脱簇 反应时生成的产物。在农业、医学和工业上具有广泛的应用。在农业上，1,5-戊二胺可用于 调控植物衰老过程、促进雌雄蕊的发育，改善植物果实发育，提高果实产量;医学上，亦可W 作为一种有效治疗频疾的药物成份;工业上是一种极为重要的化工原料，与己二酸、班巧酸 和癸二酸等二元酸聚合可分别形成新型材料聚酷胺5.6、聚酷胺5.4和聚酷胺5.10。
[0004] 随着经济快速发展，大气污染和全球变暖的趋势日益恶化。世界上每年消耗大量 石化资源来源的聚酷胺，戊二胺作为聚酷胺的重要组成单体，生物法合成戊二胺具有经济 学和生态学双重意义，生物法合成戊二胺的基因工程菌主要有谷氨酸棒状杆菌和大肠杆 菌。目前生物法合成1,5-戊二胺主要有两种方式:发酵法和生物转化法。发酵法原料来源广 泛且可再生，成本低，产量也较高，污染也较小，但其调控过程比较复杂；生物转化法产量 高，成本低，过程简单，有利于下游提取操作。但其要实现工业化生产，需要获得大量菌体， 运就需要有合适的培养基和发酵培养技术。而微生物联合培养则是联合培养一株一葡萄糖 为唯一碳源的高产下二酸大肠杆菌和一株W甘油为唯一碳源产高活性赖氨酸脱簇酶的大 肠杆菌，将发酵和转化有机结合在一起来进行，该方法不仅节约发酵成本，而且省略了收集 菌体运一步骤。并且该方法可W直接得到下二酸戊二胺盐，可用于聚酷胺5.4合成。
[0005]
【发明内容】
[0006] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种微生物联合培养生产1,5-戊二 胺的方法，简化生产方法，降低生产成本。
[0007] -种微生物联合培养生产1,5-戊二胺的方法，包括W下步骤： 步骤1，配种子培养基、发酵培养基、葡萄糖补料培养液、甘油补料培养液、乳糖诱导液 W及转化用赖氨酸溶液； 步骤2，对发酵罐，发酵培养基，种子培养基，葡萄糖补料培养液，甘油补料培养液，乳糖 诱导液，赖氨酸溶液W及Ξ角瓶进行灭菌处理，其中发酵培养基中的葡萄糖单独灭菌后再 于其他成分合并； 步骤3,取两个灭菌后的Ξ角烧瓶，接入灭菌后的种子培养基，分别接入产下二酸菌和 产赖氨酸脱簇酶菌摇床培养后作为发酵菌种； 步骤4，将灭过菌的发酵培养基接入发酵罐中，通入无菌空气或纯化，再按照接种量总 体积比为10%向发酵罐中接入发酵菌种，向发酵罐中加入葡萄糖补料培养液、甘油补料培养 液和乳糖诱导液，发酵过程中控制菌体比生长速率，溫度，抑和溶氧； 步骤5，当菌体干重达到15-20g/L，停止通无菌空气或纯化，转入厌氧转化过程，在此过 程中添加葡萄糖补料培养液控制葡萄糖浓度在l-4g/L之间，用赖氨酸溶液来控制pH在6.5- 7.5之间，发酵24小时得产物1,5-戊二胺。
[0008] 作为优选的是，步骤1中发酵培养基的中葡萄糖与甘油的总含碳浓度为25-50g/ L。
[0009] 作为优选的是，发酵菌种中产下二酸菌与产赖氨酸脱簇酶菌的接种体积比为15: (1-3)。
[0010] 作为优选的是，步骤4中通入无菌空气或纯化的量为0.03-0.0化/(min . L)，葡萄 糖补料培养液和甘油补料培养液补加按照设定比生长速率在0.04-0.0化之间进行指数流 加，乳糖诱导培养液流加速率为20-50mL/h。
[0011] 作为优选的是，步骤4中，溫度控制在32-37°C，pH控制在6.5-7.5，溶氧控制在25%- 35〇/〇。
[0012] 作为优选的是，步骤4中pH通过体积比为50%的氨水来调节。
[0013] 作为优选的是，步骤5中控制葡萄糖浓度在l-4g/L。
[0014] 有益效果 本发明方法使得1，5-戊二胺的生产方法变得更加简单，与全细胞转化相比不仅省去了 收集菌体的步骤，而且有效的省去了转化过程中酸的添加。转化过程中产生的二氧化碳也 得到了充分的利用，运从很大程度上节约了生产成本。
[0015]
【附图说明】
[0016] 图1为本发明微生物联合培养产物MS分析结果，其中峰1为单丹酷尸胺； 图2为微生物联合培养产物MS分析结果，其中峰2为双丹酷尸胺。
[0017]
【具体实施方式】 [001引实施例1 一种微生物联合培养生产1，5-戊二胺的方法，包括W下步骤： 步骤1，配种子培养基、发酵培养基、葡萄糖补料培养液、甘油补料培养液、乳糖诱导液、 赖氨酸溶液，配方如下： 种子培养基：蛋白腺1%，酵母粉0.5%，NaCl 0.8%，氨节青霉素0.01%，氯霉素0.01%， 抑 7.0。
[0019]发酵培养基（g/L):3.0 g citric acid, 3.0 g 化出P04.7也0，8.00 g K也P〇4， 0.20 邑 NH4CI，0.75 邑（NH4)2S04，0.84 邑 Na肥〇3, l.OOgMgSCk. 7也0，10.0 mg CaCl2.2也0,0.28mg FeS〇4.7也0,20mg/L硫胺素（过滤除菌），2mg/L生 物素(过滤除菌），微量元素混合液0.1%，30g/L葡萄糖(分消），2g/L甘油(分消），氨节青霉 素0.01%，氯霉素0.01%。
[0020] 微量元素混合液(M):(NH4)6M〇7〇24 3xl〇-9 M，出B03 4xl〇-7 M，CoCl2.6出0 3xl〇-s M， CuS〇4.5出0 1x10-8M，MnCl2.4出0 8x10-8 M，ZnS04.7出0 1x10-8 Μ。
[0021] 葡萄糖补料培养液:600g/L葡萄糖溶液，灭菌条件为115 °C，10 min。
[0022] 甘油补料培养液:230g/L甘油溶液。灭菌条件为115 °C，10 min。
[0023] 乳糖诱导培养液:120g/L乳糖溶液。灭菌条件为115 °C，10 min。
[0024] 赖氨酸溶液:400g/L赖氨酸溶液。
[0025] 步骤2，对发酵罐，发酵培养基，种子培养基，葡萄糖补料培养基，甘油补料培养基， 乳糖诱导培养基，赖氨酸溶液W及500mlS角瓶在12rC下灭菌15min备用，其中发酵培养基 中的葡萄糖单独灭菌后再于其他成分合并； 步骤3,取灭菌后的Ξ角烧瓶，接入50ml种子培养基，分别接入产下二酸菌与产赖氨酸 脱簇酶菌株，摇床37 °C转速为20化pm下培养8小时； 步骤4,将发酵培养基接入灭过菌的发酵罐中，通入无菌空气，通气量为0.07L/(min· L)，再按照接种量与发酵培养基的体积比为10%向发酵罐中接入发酵菌种，其中产下二酸菌 与产赖氨酸脱簇酶菌株比例为15:1，使菌体生长并消耗发酵罐中的发酵培养基，待培养基 中的初始碳源消耗完后按照发酵培养基中葡萄糖与甘油比例补加葡萄糖补料培养液和甘 油补料培养液，过程中控制菌体比生长速率为〇.〇71Γ?，同时W30ml/h的速率添加乳糖诱导 培养液； 步骤5，待菌体干重达到15g/L时停止通入空气，在此之前发酵过程抑控制为6.8，溫度 为37 Γ。停止通空气后，改通C〇2,同时停止流加甘油补料培养液和乳糖诱导培养液，继续流 加葡萄糖补料培养液，在运个过程中控制糖浓度在l-2g/L之间，并用赖氨酸溶液代替氨水 来控制pH为6.8，溫度控制为37°C，24小时后测定戊二胺产量。
[00%] 1,5-戊二胺含量用丹横酷氯衍生化后，册LC-MS分析。衍生步骤如下：移取100 ul 离屯、后的转化液到5 ml离屯、管中，依次加入2 Μ化0田容液200 μ1，饱和NaHC03溶液300 μ1 ，1〇 g/1的1,7-二氨基庚烧溶液（内标）100 μ1及10 g/1的丹横酷氯溶液1 ml。混匀后置于 40 °C水浴中避光反应45 min,而后加入25%的氨水100山，混匀后室溫避光静置30 min。反 应结束后，用乙腊定容至5 ml。
[0027] HPLC-MS分析使用电喷雾离子质谱，色谱柱为Prevail C18反向柱(250 mm X 4.6 mm X 5皿）dHPLC条件为:流动相A:100%乙腊，流动相B:0.1 Μ乙酸锭溶液，采用梯度洗 脱，条件如下:初始:50% A; 19 min:90% A; 20-30 min:50% A;流速：1.0 ml/min;柱溫:40± 1 进样量:10 μ1。检测使用紫外检测器，检测波长254 nm。
[0028] 转化产物经HPLC-MS分析（如图1、图2所示），峰1分子量为335(336-1=335)，峰2分 子量为568巧69-1=568)，分别于单丹酷尸胺和双丹酷尸胺的分子量吻合。
[0029] 实施例2 步骤1至步骤3同实施例1。
[0030] 步骤4,将发酵培养基接入灭过菌的发酵罐中，并加入按15:1配比的葡萄糖和甘油 溶液通入无菌空气，通气量为0.〇7L/(min · L)，再按照接种量与发酵培养基的体积比为10% 向发酵罐中接入发酵菌种，其中产下二酸菌与产赖氨酸脱簇酶菌株比例为15:1，使菌体生 长并消耗发酵罐中的发酵培养基，待培养基中的初始碳源消耗完后按照发酵培养基中葡萄 糖与甘油比例补加葡萄糖补料培养液和甘油补料培养液，过程中控制菌体比生长速率为 0.071Γ?，同时W30ml A的速率添加乳糖诱导培养液； 步骤5，待菌体干重达到15g/L时停止通入空气，在此之前发酵过程抑控制为6.8，溫度 为37°C。停止通气后，此步骤不通入C〇2,下二酸生产所需固定的C〇2由赖氨酸脱簇提供，同时 停止流加甘油补料培养液和乳糖诱导培养液，继续流加葡萄糖补料培养液，在运个过程中 控制糖浓度在l-2g/L之间，并用赖氨酸溶液代替氨水来控制抑为6.8，溫度控制为37°(：。24 小时后测定戊二胺产量。测量方法同实施例1。
[0031] 实施例3 步骤1-步骤3同实施例1，其中发酵培养基中葡萄糖浓度为25g/L，甘油浓度为5g/L。
[0032] 步骤4,将发酵培养基接入灭过菌的发酵罐中，并加入按5:1配比的葡萄糖和甘油 溶液通入无菌空气，通气量为0.〇7L/(min · L)，再按照接种量与发酵培养基的体积比为10% 向发酵罐中接入发酵菌种，其中产下二酸菌与产赖氨酸脱簇酶菌株比例为5:1，使菌体生长 并消耗发酵罐中的发酵培养基，待培养基中的初始碳源消耗完后按照发酵培养基中葡萄糖 与甘油比例补加葡萄糖补料培养液和甘油补料培养液，过程中控制菌体比生长速率为 0.071Γ?，同时W25ml A的速率添加乳糖诱导培养液； 步骤5，待菌体干重达到20g/L时停止通入空气，在此之前发酵过程抑控制为6.8，溫度 为37 Γ。停止通空气后，改通C〇2,同时停止流加甘油补料培养液和乳糖诱导培养液，继续流 加葡萄糖补料培养液，在运个过程中控制糖浓度在l-2g/L之间，并用赖氨酸溶液代替氨水 来控制pH为6.8，溫度控制为37°C。24小时后测定戊二胺产量。测量方法同实施例1。
[0033] 对比例 W上述产赖氨酸脱簇酶菌株进行发酵，并在后期投入底物赖氨酸用下二酸进行pH调 控，其他反应条件同实施例1，发酵结束后发酵液中戊二胺最高浓度达到50.62g/L。
[0034] 本发明方法产1，5-戊二胺的产量记录于下表中。
[0035] 从上述数据可W看出，本发明产1,5-戊二胺量大，制备过程简单，适合产业化。
【主权项】
1. 一种微生物联合培养生产1，5-戊二胺的方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1，配种子培养基、发酵培养基、葡萄糖补料培养液、甘油补料培养液、乳糖诱导液 以及赖氨酸溶液； 步骤2，对发酵罐，发酵培养基，种子培养基，葡萄糖补料培养液，甘油补料培养液，乳糖 诱导液，赖氨酸溶液以及三角瓶进行灭菌处理，其中发酵培养基中的葡萄糖单独灭菌后再 于其他成分合并； 步骤3，取两个灭菌后的三角烧瓶，接入灭菌后的种子培养基，分别接入产丁二酸菌和 产赖氨酸脱羧酶菌摇床培养后作为发酵菌种； 步骤4,将灭过菌的发酵培养基接入发酵罐中，通入无菌空气或纯02,再按照接种量总体 积比为10%向发酵罐中接入发酵菌种，向发酵罐中加入葡萄糖补料培养液、甘油补料培养液 和乳糖诱导液，发酵过程中控制菌体比生长速率，温度，pH和溶氧； 步骤5，当菌体干重达到15-20g/L，停止通无菌空气或纯〇2，转入厌氧转化过程，在此过 程中添加葡萄糖补料培养液控制葡萄糖浓度，用赖氨酸溶液来控制pH，发酵24小时得产物 1，5-戊二胺。2. 根据权利要求1所述微生物联合培养生产1，5-戊二胺的方法，其特征在于：步骤1中 发酵培养基的中葡萄糖与甘油的总含碳浓度为25-50g/L。3. 根据权利要求1所述微生物联合培养生产1，5-戊二胺的方法，其特征在于:步骤4中， 发酵菌种中产丁二酸菌与产赖氨酸脱羧酶菌的接种体积比为15: (1-3)。4. 根据权利要求1所述微生物联合培养生产1，5-戊二胺的方法，其特征在于:步骤4中， 通入无菌空气或纯〇2的量为0.03-0.08lV(min · L)，葡萄糖补料培养液和甘油补料培养液 补加按照设定比生长速率在〇. 04-0.081Γ1之间进行指数流加，乳糖诱导培养液流加速率为 20-50mL/h〇5. 根据权利要求1所述微生物联合培养生产1，5-戊二胺的方法，其特征在于:步骤4中， 温度控制在32-37°(：4田空制在6.5-7.5，溶氧控制在25%-35%。6. 根据权利要求1所述微生物联合培养生产1，5-戊二胺的方法，其特征在于：步骤4中 发酵过程中pH通过体积比为50%的氨水来调节。7. 根据权利要求1所述微生物联合培养生产1，5-戊二胺的方法，其特征在于：步骤5中 控制葡萄糖浓度在l_4g/L。
【文档编号】C12P39/00GK106011216SQ201610609543
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月28日
【发明人】陈可泉, 齐雁斌, 马伟超, 曹伟佳, 曹逊, 欧阳平凯
【申请人】南京工业大学