专利名称：沙眼衣原体pcr－rlb检测分型方法及所使用的引物、探针的制作方法
专利说明沙眼衣原体PCR-RLB检测分型方法及所使用的引物、探针 本发明涉及一种新型分子生物学方法，用于检测沙眼衣原体并对其进行分型；尤其涉及一种PCR-RLB检测沙眼衣原体及其分型方法及其所使用的引物和探针。沙眼衣原体(Chlamydia Trachomatis，CT)是一种常见的性病病原体，属于衣原体的一种。衣原体属于细胞内寄生物，其生长周期很独特，只能在宿主细胞内生存。细胞外的衣原体原生小体EB被摄取到细胞内后形成空泡包涵体，然后转变为网状小体RB。RB具有繁殖能力，但是没有感染能力；在细胞内繁殖的RB很快转变为EB，EB缺乏繁殖能力但具有感染能力，它穿破包涵体，破坏细胞壁，到达细胞外。据世界卫生组织估计，每年有9200万新发的沙眼衣原体感染病例。此外尚有许多无症状的病人，如不能及时发现、早期诊断，将成为主要的传染源。因此，临床上需要一种早期、快速、敏感和实用的检测方法，以实现尽早确诊，尽早治疗，有效控制传染源。
传统的沙眼衣原体诊断方法是细胞培养法，取女性子宫颈或男性尿道的标本接种到单细胞层，然后进行48-72小时培养。对单细胞层进行染色，以观察有无典型的包涵体。如需提高此法的灵敏度，可将阴性培养物接种新鲜单层细胞，继续培养48-72小时后再观察。细胞培养法因为其灵敏度高被认为是诊断CT感染的“金标准”，但该方法工作量大，周期长，要求专门的设施和专业人员操作，而且费用昂贵，实际临床应用受到一定的限制，由于细胞毒性作用尤其不适用于尿液标本的检测。
免疫荧光法将针对CT的单克隆抗体用荧光标记，与标本中的CT结合后，荧光显微镜检查就能见到发荧光的原体EB。免疫荧光法不象培养法必须存在有活力的CT，但其需要高度特异和敏感的单克隆抗体，荧光易淬灭，且判定结果带有主观性，需经验丰富者操作，临床应用麻烦。
酶免疫测定法(EIA)通过用酶标记的单克隆或多克隆抗体检测CT的LPS(G-菌细胞壁磷酸脂多糖)或MOMP(外膜蛋白)，酶反应生成有色产物，用酶标仪进行测定。EIA的优点在于方法简便、操作自动化，适于短时内大批量标本的检测。但其最大缺点在于容易与其他常见微生物产生交叉反应，如金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟菌、醋酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯菌及其他革兰阴性细菌，从而使特异性削弱；此外，本方法也不能用于CT分型。
聚合酶链反应(PCR)检测方法是一种体外DNA扩增试验方法。其基本原理是酶促DNA合成反应，用寡核苷酸指导的DNA合成的重复循环来实现对靶核酸序列的扩增，即在模板DNA、引物和脱氧核糖核酸存在下，在DNA聚合酶的作用下，使靶DNA链扩增延伸。由于试验的敏感性和特异性高，对标本采集的要求远不如培养那么严格，使它在医学领域得到了广泛的应用。PCR每个循环包含变性、退火、延伸3个步骤，在不到2小时内，经过30个循环，在理论上可将最初的靶DNA扩增109倍。最后对扩增的DNA进行检测。由于先将标本中的核酸特异成分先行扩增复制再行检出，其敏感性较直接检测核酸大大提高。PCR法较培养法和EIA法都要敏感，而且PCR对于有症状或无症状人群同样敏感。PCR技术不但能检测尿道或宫颈拭子标本，而且可以采用尿标本进行检测。但基于不同引物的PCR的敏感性仍有所不同，常规的PCR由于采用通用的CT引物不能对CT进行分型，从而无法准确判断。
以沙眼衣原体主要外膜蛋白基因序列为引物，进行PCR扩增，扩增产物以限制性内切酶酶切，分析酶切产物，即PCR-RFLP，可用于对沙眼衣原体进行分型。但目前研究认为，CTompl基因VD2区核酸序列是保守的、最具不同型间差异的核酸序列。而依据ompl基因VD2区涉及的PCR-RFLP诊断方法虽然能准确地监测每一型CT，但是不能同时检测和鉴定多种型CT混合感染，同时也存在重复步骤多、耗时长的缺点。DNA测序也不适合于鉴定多种型CT混合感染。针对现有技术存在的问题，本发明构思了一种新的沙眼衣原体PCR-RLB检测分型方法及所使用的引物、探针，可以克服现有技术的缺陷。
本发明是这样实现的一种用于沙眼衣原体PCR-RLB检测分型的引物，包括下述6个寡核苷酸引物寡聚核苷酸101(CP24b)5’-GGGATTCCTGTAACAACAAGTCAGG-3’寡聚核苷酸102(CP27b)5’-CCTCTTCCCCAGAACAATAAGAACAC-3’寡聚核苷酸103(CTSb)5’-AATATYTGGGATCGYTTTGATGT-3’寡聚核苷酸104(CTSNb)5’-TTGATGTATTYTGTACAYTRGGAGC-3’寡聚核苷酸105(CTANb)5’-GCTGCDCGAGCDCCNACRCT-3’寡聚核苷酸106(CTAb)5’-CCRCAYTCCCASARAGCTGC-3’。
-种用于沙眼衣原体PCR-RLB检测分型方法，其特征在于包括下述6个寡核苷酸引物寡聚核苷酸101(CP24b)5’-GGGATTCCTGTAACAACAAGTCAGG-3’寡聚核苷酸102(CP27b)5’-CCTCTTCCCCAGAACAATAAGAACAC-3’寡聚核苷酸103(CTSb)5’-AATATYTGGGATCGYTTTGATGT-3’寡聚核苷酸104(CTSNb)5’-TTGATGTATTYTGTACAYTRGGAGC-3’寡聚核苷酸105(CTANb)5’-GCTGCDCGAGCDCCNACRCT-3’寡聚核苷酸106(CTAb)5’-CCRCAYTCCCASARAGCTGC-3’其反应体系中还包括4×2.5mMdNTP 2-20％1.5mM MgCl24-25％。
一种用于沙眼衣原体PCR-RLB检测分型的探针，包括下述3个寡核苷酸探针寡聚核苷酸201(CTS1p)5’-TTGCGCATAATTTTAGGCTTG-3’寡聚核苷酸202(CTA2p)5’-ACACTTTGTCTCGATGAAAGACA-3’寡聚核苷酸203(CTSp)5’-AAAGGAAAYTCHGCWTCYTTCAA-3’。
一种用于沙眼衣原体PCR-RLB检测分型方法，其特征在于包括下述3个寡核苷酸探针寡聚核苷酸201(CTS1p)5’-TTGCGCATAATTTTAGGCTTG-3’
寡聚核苷酸202(CTA2p)5’-ACACTTTGTCTCGATGAAAGACA-3’寡聚核苷酸203(CTSp)5’-AAAGGAAAYTCHGCWTCYTTCAA-3’其反应体系中还包括2×SSPE0.1-0.5％SDS一种用于沙眼衣原体PCR-RLB检测分型的探针，包括下述15个寡核苷酸探针寡聚核苷酸301(Ap)5’-CAATCTTCTGGCTTTGATACAGCGAAT-3’寡聚核苷酸302(B/Bap)5’-TCAAATGGTACGTTTGTACCAA-3’寡聚核苷酸303(Cp)5’-TCTAGCTTTAATACAGCGAAGCTTAT-3’寡聚核苷酸304(D/Dap)5’-GGAGATAATGAAAATCAAAAAACG-3’寡聚核苷酸305(Ep)5’-CAAAGCACGGTCAAAACGAATT-3’寡聚核苷酸306(Fp)5’-ACGAAACCTGCTGCAGATA-3’寡聚核苷酸307(G/Gap)5’-GCCACGCAGCCTGCTGCAACA-3’寡聚核苷酸308(Hp)5’-ACAAAATCTTCTGATTTTAATACA GC-3’寡聚核苷酸309(I/Iap)5’-AAGGATGTAGCAGGCTTAGAAAA-3’寡聚核苷酸310(Jp)5’-GAATCTTTTTCCTAACACTGCTTT-3’寡聚核苷酸311(Jap)5’-GAAGCTTATTCCTAACACTGCTTT-3’寡聚核苷酸312(Kp)5’-AACACTGCTTTGGATCGAGCTGTG-3’寡聚核苷酸313(L1p)5’-GGTCAAAAAGGATGCTGTCC-3’寡聚核苷酸314(L2p)5’-GTTTCAGATAGTAAGCTTGTACCAA-3’寡聚核苷酸315(L3p)5’-ATACAGCGGGCTTATCAAACG-3’依次分别对应A、B/Ba、C、D/Da、E、F、G/Ga、H、I/Ia、J、Ja、K、L1、L2和L3共15型沙眼衣原体。
一种用于沙眼衣原体PCR-RLB检测分型方法，其特征在于包括下述15个寡核苷酸探针寡聚核苷酸301(Ap)5’-CAATCTTCTGGCTTTGATACAGCGAAT-3’寡聚核苷酸302(B/Bap)5’-TCAAATGGTACGTTTGTACCAA-3’寡聚核苷酸303(Cp)5’-TCTAGCTTTAATACAGCGAAGCTTAT-3’
寡聚核苷酸304(D/Dap)5’-GGAGATAATGAAAATCAAAAAACG-3’寡聚核苷酸305(Ep)5’-CAAAGCACGGTCAAAACGAATT-3’寡聚核苷酸306(Fp)5’-ACGAAACCTGCTGCAGATA-3’寡聚核苷酸307(G/Gap)5’-GCCACGCAGCCTGCTGCAACA-3’寡聚核苷酸308(Hp)5’-ACAAAATCTTCTGATTTTAATACA GC-3’寡聚核苷酸309(I/Iap)5’-AAGGATGTAGCAGGCTTAGAAAA-3’寡聚核苷酸310(Jp)5’-GAATCTTTTTCCTAACACTGCTTT-3’寡聚核苷酸311(Jap)5’-GAAGCTTATTCCTAACACTGCTTT-3’寡聚核苷酸312(Kp)5’-AACACTGCTTTGGATCGAGCTGTG-3’寡聚核苷酸313(Llp)5’-GGTCAAAAAGGATGCTGTCC-3’寡聚核苷酸314(L2p)5’-GTTTCAGATAGTAAGCTTGTACCAA-3’寡聚核苷酸315(L3p)5’-ATACAGCGGGCTTATCAAACG-3’依次分别对应A、B/Ba、C、D/Da、E、F、G/Ga、H、I/Ia、J、Ja、K、L1、L2和L3共15型沙眼衣原体；其反应体系中还包括2×SSPE0.1-0.5％SDS因为采用了本发明的技术方案，不仅可以为检测CT诊断泌尿生殖道CT感染提供一种特异、敏感的方法，并可准确地进行CT分型，为CT感染的分子流行病学研究提供了一种可靠的方法。同时可能为鉴别CT感染治疗不彻底而复发，还是外源性再感染研究提供一种新的手段，为CT发病机理研究奠定基础。
图1为CT扩增图；图2为CT-多重PCR产物与探针杂交图；图3为CT-巢式PCR产物与探针杂交图。下面结合附图和实施例对本发明作进一步的阐述
1.引物和探针设计根据PCR扩增寡聚核苷酸设计的一般原则和寡聚核苷酸溶解温度Tm值相类似及相应扩增片断大小在普通琼脂糖凝胶电泳中可分辨的原则，使用WebANGIS，比较CT15种型omplVD2序列，设计3对种CT引物，3种种特异性探针和15种型特异性探针。为提高检测方法的敏感性，我们设计了3对通用引物(CP24b，CP27b；CTSb，CTSNb，CTANb，CTAb)。引物5’为端生物素标记，探针5’为氨基标记。引物的序列如下寡聚核苷酸101(CP24b)5’-GGGATTCCTGTAACAACAAGTCAGG-3’寡聚核苷酸102(CP27b)5’-CCTCTTCCCCAGAACAATAAGAACAC-3’寡聚核苷酸103(CTSb)5’-AATATYTGGGATCGYTTTGATGT-3’寡聚核苷酸104(CTSNb)5’-TTGATGTATTYTGTACAYTRGGAGC-3’寡聚核苷酸105(CTANb)5’-GCTGCDCGAGCDCCNACRCT-3’寡聚核苷酸106(CTAb)5’-CCRCAYTCCCASARAGCTGC-3’上述寡聚核苷酸1、2，寡聚核苷酸3、4，寡聚核苷酸5、6分别组成一对寡聚核苷酸，分别可以扩增出沙眼衣原体(CT)相应序列的207、203和235bp的DNA片段，在普通琼脂糖凝胶电泳中清晰可见。
三种种特异性探针的序列如下寡聚核苷酸201(CTS1p)5’-TTGCGCATAATTTTAGGCTTG-3’寡聚核苷酸202(CTA2p)5’-ACACTTTGTCTCGATGAAAGACA-3’寡聚核苷酸203(CTSp)5’-AAAGGAAAYTCHGCWTCYTTCAA-3’15种型特异性探针的序列如下寡聚核苷酸301(Ap)5’-CAATCTTCTGGCTTTGATACAGCGAAT-3’寡聚核苷酸302(B/Bap)5’-TCAAATGGTACGTTTGTACCAA-3’寡聚核苷酸303(Cp)5’-TCTAGCTTTAATACAGCGAAGCTTAT-3’寡聚核苷酸304(D/Dap)5’-GGAGATAATGAAAATCAAAAAACG-3’寡聚核苷酸305(Ep)5’-CAAAGCACGGTCAAAACGAATT-3’寡聚核苷酸306(Fp)5’-ACGAAACCTGCTGCAGATA-3’寡聚核苷酸307(G/Gap)5’-GCCACGCAGCCTGCTGCAACA-3’寡聚核苷酸308(Hp)5’-ACAAAATCTTCTGATTTTAATACA GC-3’
寡聚核苷酸309(I/Iap)5’-AAGGATGTAGCAGGCTTAGAAAA-3’寡聚核苷酸310(Jp)5’-GAATCTTTTTCCTAACACTGCTTT-3’寡聚核苷酸311(Jap)5’-GAAGCTTATTCCTAACACTGCTTT-3’寡聚核苷酸312(Kp)5’-AACACTGCTTTGGATCGAGCTGTG-3’寡聚核苷酸313(L1p)5’-GGTCAAAAAGGATGCTGTCC-3’寡聚核苷酸314(L2p)5’-GTTTCAGATAGTAAGCTTGTACCAA-3’寡聚核苷酸315(L3p)5’-ATACAGCGGGCTTATCAAACG-3’CT种特异性探针中，各型CT探针序列之间均有2个以上的碱基差别，且相隔距离在10以下，以保证其特异性。15种型特异性探针寡聚核苷酸301(Ap)至315(L3p)依次分别对应A、B/Ba、C、D/Da、E、F、G/Ga、H、I/Ia、J、Ja、K、L1、L2和L3共15种CT型号。
2.临床样品模板DNA制备(1)取所检分泌物标本悬浮于500μl超纯水中，混匀后37℃孵浴30min，13000g离心15min，弃上清；(2)沉淀溶于250μl CT裂解液中，60℃孵育45min。
(3)加入250μl平衡液，混匀。保存于-20℃，备用。
裂解液配制10mmol/L Tris-HCl(PH8.3)50mmol/L KCl0.45％NP400.45％Tween202.5mmol/L MgCl23.多重PCR-RLB(Reverse Line Blot Hybridization Assay，反向线点杂交技术)快速检测CT所使用的引物为寡聚核苷酸103(CTSb)、104(CTSNb)、105(CTANb)和106(CTAb)四种，所使用的探针为寡聚核苷酸203(CTSp)。
临床样品检测使用25-50μlPCR反应体积。
多重PCR扩增反应含10×PCR缓冲液2.5-5.0μl4×2.5mM dNTP1-5μl1.5mM MgCl22-6μl50pmol引物(四个寡聚核苷酸) 各0.1-1μlHotstart Taq酶 0.1-1μl模板DNA 10-20μl加水 至25-50μl多重PCR反应扩增条件95℃ 15min 预变性94℃ 0.5-1min 变性，60℃0.5-1min退火72℃ 1-2min链延伸，共反应35-50个循环72℃ 10min 延伸，结束整个反应10×PCR缓冲液配制100mmol/L Tris-HCl(PH9.0)500mmol/L KCl1％ Triton X 1000.1％ 明胶15mmol/L MgCl210％ DMSO2％ Tween 20PCR扩增产物的RLB过程(1)取1-10μlPCR扩增产物和150μl2×SSPE/0.1％SDS混匀加入EP管中(2)置99℃10min后，迅速冰浴(3)用60℃预温的2×SSPE/0.1％SDS洗已标记探针的膜1-10min，置于Miniblotter(微型吸水纸)中，吸除液体(4)在Miniblotter槽中分别依次加入140-170μl稀释的PCR扩增产物，50-60℃杂交20-60min
(5)用50-60℃预温的2×SSPE/0.5％SDS洗膜两次，每次10min(6)加入2×SSPE/0.5％SDS和1/5000链亲和素-过氧化物酶接合物混合液10ml，40-50℃孵育20-60min(7)用40-50℃预温的2×SSPE/0.5％SDS洗膜两次，每次10min(8)室温下用2×SSPE洗膜两次，每次1-10min加入化学发光增强(Enhanced chemiluminescence，ECL)显影剂20ml于膜上，室温1-5min，最后将膜于暗盒中显影、曝光和洗片，标记有CT特异性探针对应的底片位置上出现黑点，表示结果为阳性。无黑点表示结果为阴性。
4.巢式PCR-RLB快速检测CT所使用的引物为寡聚核苷酸101(CP24b)、102(CP27b)、103(CTSb)、104(CTSNb)、105(CTANb)和106(CTAb)六种，所使用的探针为寡聚核苷酸201(CTS1p)、202(CTA2p)和203(CTSp)三种。
临床样品检测使用25-50μlPCR反应体积。
巢式PCR扩增反应含10×PCR缓冲液 2.5-5.0μl4×2.5mM dNTP 1-5μl1.5mM MgCl23μl50pmol引物(寡聚核苷酸103、106两种)各1-3μlTaq酶 1-2μl模板DNA 10-20μl加水 至25-50μl巢式PCR扩增反应条件95℃ 5min 预变性94℃ 0.5-2min 变性，55℃0.5-2min退火72℃ 1-2min延伸，共反应30-50个循环72℃ 10min 延伸，结束整个反应取10μlPCR产物进行第二次PCR反应，除CTSNb和CTANb代替CTSb和CTAb，其余同前。
PCR扩增产物的RLB过程(1)取1-10μlPCR扩增产物和150μl2×SSPE/0.1％SDS混匀加入EP管中(2)置99℃10min后，迅速冰浴(3)用50-60℃预温的2×SSPE/0.1％SDS洗已标记探针的膜5min，置于Miniblotter中，吸除液体(4)在Miniblotter槽中分别依次加入140-170μl稀释的PCR产物，50-60℃杂交20-60min(5)用50-60℃预温的2×SSPE/0.5％SDS洗膜两次，每次10min(6)加入2×SSPE/0.5％SDS和1/5000链亲和素-过氧化物酶接合物混合液10ml，40-50℃孵育45min(7)用40-50℃预温的2×SSPE/0.5％SDS洗膜两次，每次10min(8)室温下用2×SSPE洗膜两次，每次5min加入ECL20ml于膜上，室温1-2min，最后将膜于暗盒中显影、曝光和洗片，标记有CT特异性探针对应的底片位置上出现黑点，表示结果为阳性。无黑点表示结果为阴性。
5.巢式PCR-RLB快速对CT分型所使用的引物为寡聚核苷酸103(CTSb)、104(CTSNb)、105(CTANb)和106(CTAb)四种，所使用的特异性探针为寡聚核苷酸203(CTSp)，型特异性探针寡聚核苷酸301至315共15种。
临床样品检测使用25-50μlPCR反应体积。
巢式PCR反应含10×PCR缓冲液 2.5-5.0μl4×2.5mM dNTP 1-5μl1.5mM MgCl23μl50pmol引物，CTAb和CTSb各1-3μlTaq酶 1-2μl
模板DNA 10-20μl加水至25-50μl巢式PCR反应条件95℃5min 预变性94℃0.5-2min 变性，55℃0.5-2min退火72℃1-2min 延伸，共反应30-50个循环72℃10min延伸，结束整个反应取10μlPCR产物进行第二次PCR，除CTSNb和CTANb代替CTSb和CTAb，其余同前。
PCR扩增产物的RLB过程(1)取1-10μlPCR扩增产物和150μl2×SSPE/0.1％SDS混匀加入EP管中(2)置99℃10min后，迅速冰浴(3)用60℃预温的2×SSPE/0.1％SDS洗已标记探针的膜5min，置于Miniblotter中，吸除液体(4)在Miniblotter槽中分别依次加入150μl稀释的PCR产物，50-60℃杂交20-60min(5)用50-60℃预温的2×SSPE/0.5％SDS洗膜两次，每次10min(6)加入2×SSPE/0.5％SDS和1/5000链亲和素-过氧化物酶接合物混合液10ml，40-50℃孵育20-40min(7)用40-50℃预温的2×SSPE/0.5％SDS洗膜两次，每次10min(8)室温下用2×SSPE洗膜两次，每次5min加入ECL20ml于膜上，室温1-2min，最后将膜于暗盒中显影、曝光和洗片，标记有CT特异性探针对应的底片位置上出现黑点，表示结果为阳性。无黑点表示结果为阴性。标记有15种CT型特异性探针对应的底片位置上出现黑点，表示所检的CT属于何种类型。
图1至图3是应用本发明进行检测的结果。经COBAS AMPLICOR检测的355份标本，其中277份尿液，2份男性直肠试子和78份女性宫颈试子，进行PCR-RLB检测CT并分型，结果192份COBAS AMPLICOR阳性标本中175份PCR-RLB阳性，93.1％(163/175)的CT感染可被正确分型，其分型结果与DNA测序结果一致。163份COBAS扩增器阴性标本中6份巢式PCR-RLB阳性。63.3％(103/163)为单一型CT感染，最常见的CT是F(28.5％)，D(18.2％)和E(16.3％)。36.8％(60/163)为CT混合感染，混合感染以D和E为主。可见PCR-RLB检测CT是一种简单、快速、特异和敏感的方法，并可准确地进行CT分型。
3对PCR引物的特异性及敏感性3对引物PCR扩增所检测CT菌株，经琼脂糖凝胶电泳后均可见一条约202-235bp DNA带(CP24和CP27、CTS和CTSN、CTA和CTAN扩增片段分别为207、203和235bp)，而其它泌尿生殖道常见病原体均未见扩增带，见图1，其中1、阴性对照，2、CT，3、淋球菌，4、脲原体，5、生殖支原体，6、人型支原体、7、阴道加特菌，8-16、临床标本，M、Hinf I DNA(24，40，66，82，118，140，151，200，249，311，，413，417，427，500，553，713，726)。表明用CP24和CP27、CTS和CTSN、CTA和CTAN扩增CT有较好的属特异性。取经定量的CT血清型D株DNA依次稀释为100pg、10pg、1pg、100fg、10fg及1fg/μlDNA，取1μlDNA扩增，分别检测其敏感性，结果P24和P27分别为100fg。质粒PCR检测结果显示，敏感性为10-2，相当于0.01IFU，高于VD2-PCR。
CT寡核苷酸探针特异性CT ompl和10型CT株PCR扩增后RLB结果见图2和图3。图2中，从上至下分别为探针CTS1p(1，2，3)*，CP24p(1，2)，CP27p(1，2)，Ap(1，2)，Bp(1，2)，Cp(1，2)，Dp(1，2，3)，Ep(1，2，3)，Fp(1，2，3)，Gp(1，2，3)，Hp(1，2，3)，Ip(1，2，3)，Jp(1，2，3)和Kp(1，2，3)杂交信号。1为阴性对照，9、12、23、36和39为CTS1p，P24p和P27p阳性。括号内1，2和3表示探针浓度分别为1.25、0.625和0.3125pmol。图3中，从上至下分别为探针CTS1p(1，2，3)，P24p(1，2)，P27p(1，2)，Ap(1，2)，Bp(1，2)，Cp(1，2)，Dp(1，2，3)，Ep(1，2，3)，Fp(1，2，3)，Gp(1，2，3)，Hp(1，2，3)，Ip(1，2，3)，Jp(1，2，3)和Kp(1，2，3)杂交信号。括号内1，2和3表示探针浓度分别为1.25、0.625和0.3125pmol。图中可见，探针Ap、Cp、D/Dap、Ep、Fp、G/Gap、Hp、I/Iap、Jp、Jap和Kp只与相应菌种杂交。
本发明检测过程中每一种CT被标记2-3种浓度的特异性探针在尼龙膜上，提高了CT检测方法的敏感性和特异性，同时使用ECL(Enhancedchemiluminescence)检测系统使发光底物3一氨基苯二甲酰肼(luminol)在H2O2的作用下，氧化后发出蓝光，再加入发光增强剂使发光强度增强1000倍，显示杂交信号的灵敏度比显色底物高100倍，提高检测敏感性。标记CT种特异性探针的尼龙膜每次可同时检测45个样本，大大降低了每一个样本的检测成本。在观察结果方面，CT可凭肉眼直接在曝光的底片上观察结果，不需要特殊仪器设备读取结果，便于临床操作。因此对于检测和分型，RLB优于PCR的其他方法。
权利要求
1.一种用于沙眼衣原体PCR-RLB检测分型的引物，包括下述6个寡核苷酸引物寡聚核苷酸101(CP24b)5’-GGGATTCCTGTAACAACAAGTCAGG-3’寡聚核苷酸102(CP27b)5’-CCTCTTCCCCAGAACAATAAGAACAC-3’寡聚核苷酸103(CTSb)5’-AATATYTGGGATCGYTTTGATGT-3’寡聚核苷酸104(CTSNb)5’-TTGATGTATTYTGTACAYTRGGAGC-3’寡聚核苷酸105(CTANb)5’-GCTGCDCGAGCDCCNACRCT-3’寡聚核苷酸106(CTAb)5’-CCRCAYTCCCASARAGCTGC-3’。
2.一种用于沙眼衣原体PCR-RLB检测分型方法，其特征在于包括下述6个寡核苷酸引物寡聚核苷酸101(CP24b)5’-GGGATTCCTGTAACAACAAGTCAGG-3’寡聚核苷酸102(CP27b)5’-CCTCTTCCCCAGAACAATAAGAACAC-3’寡聚核苷酸103(CTSb)5’-AATATYTGGGATCGYTTTGATGT-3’寡聚核苷酸104(CTSNb)5’-TTGATGTATTYTGTACAYTRGGAGC-3’寡聚核苷酸105(CTANb)5’-GCTGCDCGAGCDCCNACRCT-3’寡聚核苷酸106(CTAb)5’-CCRCAYTCCCASARAGCTGC-3’其反应体系中还包括4×2.5mMdNTP2-20％1.5mM MgCl24-25％。
3.一种用于沙眼衣原体PCR-RLB检测分型的探针，包括下述3个寡核苷酸探针寡聚核苷酸201(CTS1p)5’-TTGCGCATAATTTTAGGCTTG-3’寡聚核苷酸202(CTA2p)5’-ACACTTTGTCTCGATGAAAGACA-3’寡聚核苷酸203(CTSp)5’-AAAGGAAAYTCHGCWTCYTTCAA-3’。
4.一种用于沙眼衣原体PCR-RLB检测分型方法，其特征在于包括下述3个寡核苷酸探针寡聚核苷酸201(CTS1p)5’-TTGCGCATAATTTTAGGCTTG-3’寡聚核苷酸202(CTA2p)5’-ACACTTTGTCTCGATGAAAGACA-3’寡聚核苷酸203(CTSp)5’-AAAGGAAAYTCHGCWTCYTTCAA-3’其反应体系中还包括2×SSPE0.1-0.5％SDS。
5.一种用于沙眼衣原体PCR-RLB分型的探针，包括下述15个寡核苷酸探针寡聚核苷酸301(Ap)5’-CAATCTTCTGGCTTTGATACAGCGAAT-3’寡聚核苷酸302(B/Bap)5’-TCAAATGGTACGTTTGTACCAA-3’寡聚核苷酸303(Cp)5’-TCTAGCTTTAATACAGCGAAGCTTAT-3’寡聚核苷酸304(D/Dap)5’-GGAGATAATGAAAATCAAAAAACG-3’寡聚核苷酸305(Ep)5’-CAAAGCACGGTCAAAACGAATT-3’寡聚核苷酸306(Fp)5’-ACGAAACCTGCTGCAGATA-3’寡聚核苷酸307(G/Gap)5’-GCCACGCAGCCTGCTGCAACA-3’寡聚核苷酸308(Hp)5’-ACAAAATCTTCTGATTTTAATACA GC-3’寡聚核苷酸309(I/Iap)5’-AAGGATGTAGCAGGCTTAGAAAA-3’寡聚核苷酸310(Jp)5’-GAATCTTTTTCCTAACACTGCTTT-3’寡聚核苷酸311(Jap)5’-GAAGCTTATTCCTAACACTGCTTT-3’寡聚核苷酸312(Kp)5’-AACACTGCTTTGGATCGAGCTGTG-3’寡聚核苷酸313(L1p)5’-GGTCAAAAAGGATGCTGTCC-3’寡聚核苷酸314(L2p)5’-GTTTCAGATAGTAAGCTTGTACCAA-3’寡聚核苷酸315(L3p)5’-ATACAGCGGGCTTATCAAACG-3’依次分别对应A、B/Ba、C、D/Da、E、F、G/Ga、H、I/Ia、J、Ja、K、L1、L2和L3共15型沙眼衣原体。
6.一种用于沙眼衣原体PCR-RLB分型方法，其特征在于包括下述15个寡核苷酸探针寡聚核苷酸301(Ap)5’-CAATCTTCTGGCTTTGATACAGCGAAT-3’寡聚核苷酸302(B/Bap)5’-TCAAATGGTACGTTTGTACCAA-3’寡聚核苷酸303(Cp)5’-TCTAGCTTTAATACAGCGAAGCTTAT-3’寡聚核苷酸304(D/Dap)5’-GGAGATAATGAAAATCAAAAAACG-3’寡聚核苷酸305(Ep)5’-CAAAGCACGGTCAAAACGAATT-3’寡聚核苷酸306(Fp)5’-ACGAAACCTGCTGCAGATA-3’寡聚核苷酸307(G/Gap)5’-GCCACGCAGCCTGCTGCAACA-3’寡聚核苷酸308(Hp)5’-ACAAAATCTTCTGATTTTAATACA GC-3’寡聚核苷酸309(I/Iap)5’-AAGGATGTAGCAGGCTTAGAAAA-3’寡聚核苷酸310(Jp)5’-GAATCTTTTTCCTAACACTGCTTT-3’寡聚核苷酸311(Jap)5’-GAAGCTTATTCCTAACACTGCTTT-3’寡聚核苷酸312(Kp)5’-AACACTGCTTTGGATCGAGCTGTG-3’寡聚核苷酸313(L1p)5’-GGTCAAAAAGGATGCTGTCC-3’寡聚核苷酸314(L2p)5’-GTTTCAGATAGTAAGCTTGTACCAA-3’寡聚核苷酸315(L3p)5’-ATACAGCGGGCTTATCAAACG-3’依次分别对应A、B/Ba、C、D/Da、E、F、G/Ga、H、I/Ia、J、Ja、K、L1、L2和L3共15型沙眼衣原体；其反应体系中还包括2×SSPE0.1-0.5％SDS。
全文摘要
本发明公开了一种沙眼衣原体PCR－RLB检测分型方法及所使用的引物、探针。针对各型沙眼衣原体的DNA序列特点，设计了三对寡聚核苷酸引物，3种种特异性探针和15种型特异性探针，通过PCR－RLB检测分型方法，不仅可以为检测CT诊断泌尿生殖道CT感染提供一种特异、敏感的方法，并可准确地进行CT分型，诊断CT混合感染，为CT感染的分子流行病学研究提供了一种可靠的方法。同时还是外源性再感染研究提供一种新的手段，为CT发病机理研究奠定基础。
文档编号C12Q1/68GK1724690SQ200510035129
公开日2006年1月25日 申请日期2005年6月14日 优先权日2005年6月14日
发明者熊礼宽, 程锦泉, 周华, 孔繁荣, 玲.格伯特 申请人:深圳市慢性病防治院