专利名称：一种黑曲霉脂肪酶及其制备方法
技术领域：
本发明涉及脂肪酶及其制备方法，尤其是微生物脂肪酶及其制备方法。
背景技术：
近年对微生物脂肪酶的研究显著增加，因为微生物脂肪酶在食品工业、面粉工业、洗涤工业、制药工业、纺织工业、饲料工业、生物化工工业及环保工业等工业中已被广泛采用，其应用发展空间相当广阔。目前，国内外已报道的微生物脂肪酶产生菌已多达65个属，其中细菌，28个属；丝状真菌，23个属；酵母菌，10个属；放线菌，4个属。丝状真菌在细胞外分泌酶，是一种优异的脂肪酶生产菌种。目前所知产酶能力最强的菌株主要集中在根霉(Rhizopas)、曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillium)、毛霉(Mucor)、须霉(Phycomyces)等属种。由黑曲霉(Aspergillus niger)制备作用最适pH值活性范围在4.5-5.5的脂肪酶曾有报道[Torossian K.and Bell A.W.(1991)Biotechnol.Appl.Biochem.13，205-211]。美国专利US6534303公开了一种制备黑曲霉脂肪酶的方法，所制得酶的作用最适pH值范围在2.0-3.0。这两种方法所制得的黑曲霉脂肪酶的作用最适pH值范围窄，且在碱性条件下不稳定。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种最适作用pH值范围宽且能在宽的pH值范围内稳定的黑曲霉脂肪酶及其制备方法。
本发明的黑曲霉脂肪酶采用黑曲霉(Aspergillns niger)单一菌株S-7749制备，菌株S-7749由筛选出的原始黑曲霉单一菌株(Aspergillns niger S-8341)经诱变育种得到。菌株S-7749已于2005年3月23日在中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏，保藏中心地址为北京市中关村中国科学院微生物所内，邮政编码为100080，保藏编号为CGMCC No.1334。
菌株S-7749经种子制备，发酵培养，发酵液经超滤，在酶保护剂作用下，通过喷雾干燥，获得产品。
本发明所使用的黑曲霉为国家卫生部和FDA公布的食品安全菌株，发酵培养基来源广泛成本低，工艺简单，所制得的黑曲霉脂肪酶活性高，适用pH值范围宽，用途广泛。
图1为黑曲霉脂肪酶的制备过程框2为菌株S-7749的的诱变系谱。
图3为本发明的黑曲霉脂肪酶作用的最适pH值及对pH值的稳定性。
图4为本发明的黑曲霉脂肪酶作用的最适温度和对热稳定性。
具体实施例方式
菌种的筛选与诱变从榕树土壤中分离筛选得到原始黑曲霉单一菌株(Aspergillns niger S-8341)，菌株S-8341在紫外线或紫外线与氯化锂作诱变剂条件下，经7代诱变获得本发明所使用的生产菌株S-7749。菌株S-7749经中国科学院微生物所鉴定为黑曲霉(Aspergillns niger)，并已于2005年3月23日在中国中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏，保藏中心地址为北京市中关村中国科学院微生物所内，邮政编码为100080，保藏编号为CGMCC No.1334。
菌种的种子制备菌株S-7749在25℃-27℃温度下，将培养好的马铃薯斜面种子扩大到马铃薯培养基的茄子瓶中培养，然后，再扩大到马铃薯培养基的K氏瓶中培养，培养时间均为80-120小时。
发酵包括一级种子罐发酵、二级种子罐发酵和发酵罐发酵，一级种子罐发酵和二级种子罐发酵的培养基2.6％的黄豆饼粉、0.5％的玉米淀粉、0.5％的硝酸钠、0.05％的柠檬酸钠和0.05％的硫酸镁，培养基pH值为6.3-6.4。发酵罐发酵培养基6.0％的黄豆饼粉、0.4％玉米淀粉、0.2％的硝酸钠、0.4％的磷酸氢钾、0.2％的碳酸钙、0.02％的硫酸镁、0.1％的柠檬酸钠，培养基pH值6.5-6.8。一级种子罐发酵温度为25℃-27℃，发酵过程中空气通气量1∶1V/V，培养周期16-18小时。二级种子罐发酵温度为25℃-27℃，发酵过程中空气通气量1∶1V/V，培养周期8-10小时，发酵罐发酵温度为24℃-25℃，过程中空气通气量在1∶1.2-1∶1.6范围内分阶段增大，保持罐压0.1Mpa，发酵周期42-44小时。
后处理发酵结束后，过滤发酵液，固液分离，滤液超滤浓缩，分子量截留＜30Kda，加入本领域常用的保护剂及激活剂，喷雾干燥得到成品。
酶活测定以三丁酸甘油酯为底物，采用本领域常用的方法测定发酵液的发酵酶活。在一温度36℃和pH9.4条件下，水解甘油三丁酯每分钟生成1μmol脂肪酸的酶量，即为一个单位，以U/ml或者U/g表示。
以下将结合具体的实施例对本发明的方法进行更具体的描述，但本发明并不限于具体实施例。
例1菌种黑曲霉菌株S-7749
菌种的种子制备菌株S-7749在27℃温度下，将马铃薯斜面种子扩大到茄子瓶中培养，再扩大到K氏瓶中培养，每步培养时间皆为100小时。
发酵1)一级种子罐发酵培养基(％)黄豆饼粉2.6玉米淀粉0.5NaNo30.5柠檬酸钠0.08MgSo40.04接种方法孢子接种法培养条件温度 26℃通气量1∶1V/VPH6.3-6.4培养周期 17小时2)二级种子罐发酵培养基(％)同一级种子罐发酵接种方法压差移种法培养条件温度 26℃通气量1∶1V/VpH值 6.3-6.4
培养周期9小时3)发酵工艺培养基(％)黄豆饼粉6.0玉米淀粉0.4NaNo30.2K2HPO40.4CaCo30.2MgSo40.02柠檬酸钠0.1PH 6.5-6.8种子移种量 15接种方法压差移种法培养条件pH控制 6.8-7.8温度24℃发酵周期43小时通气量发酵开始空气通气量为控制为1∶1.2V/V，发酵16小时后增加为1∶1.4V/V，发酵32小时后增加为1∶1.6V/V。
发酵过程中保持罐压0.1MPa。
发酵结束将发酵液体用40目滤布板框过滤，滤液经5m3和1m3袋滤后，再用2万分子量的中空纤维超滤膜超滤，分子量截留＜30Kda，超滤浓液加酶稳定剂和激活剂，经压力式喷雾干燥，得成品，水份＜6％。
测定酶活测定发酵罐内发酵结束后液体的酶活为3478U/ml。
例2跟例1相似，不同之处在于菌种的种子制备过程中温度为26℃，茄子瓶及K氏瓶中培养时间皆为120小时；一级种子罐中发酵温度为27℃，培养周期为18小时；二级种子罐中发酵温度为27℃，培养周期为10小时，发酵罐中发酵温度为25℃，发酵周期为44小时；发酵开始空气通气量为控制为1∶1.2V/V，发酵18小时后增加为1∶1.4V/V，发酵35小时后增加为1∶1.6V/V。
测定发酵罐内发酵结束后液体的酶活为3216U/ml。
例3跟例1相似，不同之处在于菌种的种子制备过程中温度为25℃，茄子瓶及K氏瓶中培养时间皆为80小时；一级种子罐中发酵温度为25℃，培养周期为16小时；二级种子罐中发酵温度为25℃，培养周期为8小时，发酵罐中发酵温度为25℃，发酵周期为42小时；发酵开始空气通气量为控制为1∶1.2V/V，发酵15小时后增加为1∶1.4V/V，发酵30小时后增加为1∶1.6V/V。
测定发酵罐内发酵结束后液体的酶活为3016U/ml。
例4以三丁酸甘油酯为底物用领域内常规的方法检测pH值对例1制得的黑曲霉脂肪酶活性的影响，表明所产酶作用最适pH在6.5-8.0，不但在碱性区域保持较高的酶活力，而在酸性区域也保持有相当的酶活力，具有广阔的pH作用范围，其pH稳定范围在5.8-12.0，用途广泛。检测结果见图3。
例5以三丁酶甘油酯为底物用领域内常规的方法检测例1制得的黑曲霉脂肪酶作用的最适温度及热稳定性，检测表明所制得的酶的最适作用温度为25℃-35℃；超过40℃，酶活力开始明显下降，而低于20℃，仍具有较好的酶活力，该酶属于中温偏低温酶，对热稳定性稍差。检测结果参见图4。
例6将例1中得到的黑曲霉脂肪酶经还原处理后，跟标准蛋白一起进行SDS-GAPE.，用各标准蛋白分子量的对数(纵坐标)和相迁移率(横坐标)画出标准曲线，算出该脂肪酶的相对迁移率为0.509，由标准曲线再求出该碱性脂肪酶的分子量为29.2Kda.
例7用氨基酸序列测定仪测定例1制得的黑曲霉脂肪酶的N端氨基酸序列为ATADAAAFPDLHRAAKLSSA。
例8在日本广岛大学生物生产学部实验室采用专用酯键位置特异性测定仪测定例1制得的黑曲霉脂肪酶作用酯键位置特异性是一种水解Sn-1和Sn-3位置脂肪酶，适宜于食品用酶。
权利要求
1.一种黑曲霉脂肪酶，其酶学特性为以三丁酸甘油酯为底物，酶作用的最适pH值范围为6.5-8.0，在pH值5.8-12.0范围内稳定；以三丁酸甘油酯为底物，酶作用的最适温度在25℃-35℃，热稳定温度低于40℃；酶的分子量为29.2Kda；酶N端氨基酸序列为ATADAAAFPDLHRAAKLSSA；酶作用酯键位置特异性是一种水解Sn-1和Sn-3位置脂肪酶。
2.一种黑曲霉脂肪酶的制备方法，主要包括菌株的筛选与诱变育种、菌种的种子制备、发酵及后处理，其特征在于所使用的菌种是黑曲霉(Aspergillns niger)单一菌株S-7749。
3.权利要求2所述的黑曲霉脂肪酶制备方法，其中菌种的种子制备包括斜面种子的茄子瓶培养和斜面种子的K氏瓶培养，每步培养时间皆为80-120小时，培养温度为25℃-27℃。
4.权利要求3所述的黑曲霉脂肪酶制备方法，其中的培养时间皆为100小时，培养温度为27℃。
5.权利要求2或3所述的黑曲霉脂肪酶制备方法，其中发酵过程包括一级种子罐发酵、二级种子罐发酵和发酵罐发酵。
6.权利要求5所述的黑曲霉脂肪酶制备方法，其中一级种子罐发酵的培养基为2.6％的黄豆饼粉、0.5％的玉米淀粉、0.5％的硝酸钠、0.08％的柠檬酸钠和0.04％的硫酸镁，培养基pH值为6.3-6.4，温度为25℃-27℃，空气通量为1∶1v/v，培养周期为16-18小时；二级种子罐发酵的培养基、pH值、温度及空气通量同一级种子罐发酵，培养周期为8-10小时；发酵罐发酵的培养基为6.0％的黄豆饼粉、0.4％的玉米淀粉、0.2％的硝酸钠、0.4％的磷酸氢二钾、0.2％的碳酸钙、0.02％的硫酸镁和0.1％的柠檬酸钠，培养基pH值为6.5-6.8，温度24℃-25℃，空气通量分阶段在1∶1.2-1∶1.6V/V范围内增大，发酵周期42-44小时。
7.权利要求6所述的黑曲霉脂肪酶制备方法，其中发酵罐中发酵过程中空气通量根据发酵进行的时间分阶段增大，发酵开始空气通量为1∶1.2V/V，发酵15-18小时后空气通量增加为1∶1.4V/V，发酵30-35小时后空气通量增加为1∶1.6V/V。
8.权利要求6所述的黑曲霉脂肪酶制备方法，其中一级种子罐发酵温度为26℃，培养周期为17小时；二级种子罐发酵温度为26℃，培养周期为9小时；发酵罐发酵温度为24℃，发酵周期为43小时。
9.权利要求6所述的黑曲霉脂肪酶制备方法，其中发酵过程保持罐压为0.1Mpa。
全文摘要
本发明属于微生物技术领域，涉及黑曲霉脂肪酶及其制备方法。从自然界中分离筛选出黑曲霉(Aspergillus niger)野生型菌株S－8341，采用工业微生物诱变育种得到优良的生产菌株S－7749，该菌株经过扩大培养和低温高氧发酵工艺制得黑曲霉脂肪酶。所制得黑曲霉脂肪酶的酶学特性酶作用的最适pH值范围为6.5－8.0，在pH值5.8－12.0范围内稳定；酶作用的最适温度为25℃－35℃，热稳定温度低于40℃；酶的分子量为29.2Kda；酶N端氨基酸序列为ATADAAAFPDLHRAAKLSSA；酶作用酯键位置特异性是一种水解Sn－1和Sn－3位置脂肪酶。本发明的制备方法简单、成本低，所制得的黑曲霉脂肪酶活性高、作用pH值范围宽，用途广泛。
文档编号C12N1/14GK1730653SQ200510035099
公开日2006年2月8日 申请日期2005年6月2日 优先权日2005年6月2日
发明者吴松刚, 施巧琴, 王剑英, 张清辉, 赵燕玉 申请人:深圳市绿微康生物工程有限公司