专利名称：检测egfr基因突变位点的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及ー种检测EGFR基因突变位点的试剂盒。
背景技术：
EGFR是原癌基因c-erbBl的表达产物，是表皮生长因子受体家族(HER)中的4个成员之一，HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR是分子量为170kD的 跨膜糖蛋白，由胞外区、跨膜区及胞内区3部分组成；氮末端胞外区又可分成4个亚区，是EGFR与配体(转化生长因子-α、表皮生长因子、双调节素等)结合的部位；跨膜区由ー个亲脂性多肽螺旋构成；胞内区含有保守的酪氨酸激酶磷酸化位点。EGFR在非活性状态下是单体，当受体与配体结合后可形成同源或异源ニ聚体，受体胞内区发生自我磷酸化并启始一系列胞内信号级联。与之相关的信号途径和信号传递蛋白有磷酯酶C-Y I、磷酯酰肌醇3激酶、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶等。最终激活相关核蛋白，促进细胞从G期过渡到S期。相关研究证明，EGFR对细胞衍生起重要作用，EGFR在癌症发展过程中如血管生成及肿瘤细胞转移、粘附和凋亡抑制等过程中起重要作用。转化生长因子-α和EGFR在实体瘤中过表达，往往标志着病情进ー步发展和不良预后(Yarden Y. Nat Rev Mol Ce U Biol, 2001, 2127-137)。EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、増殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常，均会引起肿瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的发生。EGFR存在于大多数细胞中，在多种肿瘤中都有表达，如结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌和非小细胞肺癌等，其中在结直肠癌的阳性表达率为25% 77% (MendelsohnJ, . J Clin Oncol, 2003, 21 (14) :2787-99)，在胃癌的阳性表达率为 38% 51. 5%.这种异常表达与肿瘤细胞的増殖、新生血管形成、侵袭、转移及抗凋亡等有关，过度表达的EGFR常常预示着无病生存期和总生存期下降、复发及远处转移的风险增加(Opdwyer PJ, Semin0ncol，2002，29)。同时表达EGFR及其配体TGF-α的胃癌预后差，5年生存率只有12%，而EGFR及TGF-α表达水平正常或者只有某ー过度表达的胃癌，5年生存率则有45%和36%(Shah MA, . Proc Am Soc Clin Oncol, 2005, 24: abstr 4025)。Radinsky 等检测了大肠癌手术后标本的EGFR表达情况，发现晚期大肠癌(Dukes’D期、肝转移)的EGFR mRNA的水平是早期病变的10 20倍。约40% 80%的非小细胞肺癌(non — small cell lungcancer. NSCLC)上调表达表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR),EGFR信号系统參与肿瘤侵袭、血管生成、凋亡障碍和化放疗抗拒，是NSCLC治疗重要靶点之一。吉非替尼是EGFR酪氨酸激酶(TK)的抑制剂，II期临床试验表明，对部分NSCLC具有较好的疗效，ニ线治疗的缓解率为10% 19%。研究表明，吉非替尼的疗效与EGFR受体基因第18、19、20和21外显子突变有夫，对吉非替尼反应患者多伴有EGFR基因的突变。其中90%以上的突变存在于第19外显子和第21外显子中。因此，建立快速检测NSCLC瘤组织EGFR基因突变的方法，有助于筛选患者进行治疗。以易瑞沙(Iressa)为代表的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，能通过抑制肿瘤发生、发展中必须的表皮生长因子受体酪氨酸激酶阻断肿瘤细胞的信号传导，从而达到抑制肿瘤细胞的增生、侵袭、转移、血管生成并促进肿瘤细胞的调亡。易瑞沙是一种ロ服的分子靶向治疗药物，是表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸酶抑制剂(TKI)，由于EGFR-TK及其信号通路在非小细胞肺癌(non- small-cell lung cancer ,NSCLC)的发生、发展中起着重要的作用，所以通过阻断它来治疗肿瘤是ー热点。易瑞沙于2005年在中国上市，是目前唯一拥有与标准ニ线化疗対照的临床数据的表面生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂。临床实践显示易瑞沙对非小细胞肺癌的疗效存在很大的个体差异，仅有8-18%的个体会有很好效果。 目前普遍应用的EGFR基因突变检测方法为限制小片段长度多态性分析法(RFLP法)和DNA直接测序等。RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法。但是该方法存在以下缺点=RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性，非闭管操作，易于污染，难以满足临床检测要求。DNA直接测序的原理是该方法存在以下缺点检测周期较长，花费昂贵，非闭管操作，难以避免交叉污染，通量不高。DNA直接测序的灵敏度较低，杂合突变、胶压縮、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据，需要多次重复测序才可能避免假阳性等，因此直接测序方法难适用于临床检测。而临床迫切需要开发ー种快速、准确、操作简便和避免交叉污染的检测EGFR基因突变的试剂盒，满足临床用药和检测诊断方面的时效性要求。Taqman探针是在Real-time PCR技术平台发展出的突光检测技术,探针的5’端含有荧光报告基团，3’端含有荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，当进行PCR扩增吋，Taq DNA聚合酶的5’端到3’端的外切酶活性将探针酶切降解，使得报告基团和淬灭基团分离，发出荧光信号，从而达到荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。Taqman-MGB探针是在3’端具有小沟结合分子(minor groove binder, MGB)的Taqman探针，提高了探针的Tm值，缩短探针长度，便于多突变位点的同时检測。扩增阻滞突变系统(amplificationrefractory mutation system,ARMS)是基于PCR技术基础上发展起来的用于检测点突变或多态性的技术。ARMS已成功应用于分析基因多态性，包括生殖细胞突变和体细胞突变，该技术可在大量野生DNA背景下分辨出低含量的突变。根据PCR扩增时使用的Taq DNA聚合酶缺乏3’端到5’端外切酶活性，不能修正引物3’端碱基错配，只要引物3’端与模板I个碱基不配对，便无法扩增出特异性产物。针对这种特性设计引物，使得突变型得到扩增，野生型无法扩增，从而放大了突变型信号，便于检測。Taqman-ARMS 该技术基于Real-time PCR平台，结合ARMS突变富集和Taqman-MGB特异性荧光检测两种技术。利用ARMS引物对突变靶序列进行PCR扩增，Taqman-MGB探针对扩增产物进行特异性位点检测，在Real-time PCR基础上鉴定特定突变。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之ー在于提供快速、准确、操作简便和防止污染的检测EGFR基因突变位点的试剂盒，解决了现有技术中进行EGFR基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和灵敏度低等问题，尤其是提供了病理组织之外的非创伤性如血清或血浆等检测。为实现上述发明目的，本发明的技术方案为
检测EGFR基因突变位点的试剂盒，所述试剂盒包含检测EGFR基因突变位点的ARMS弓丨物对和特异识别所述突变位点的Taqman-MGB探针；所述ARMS引物对的上游引物或下游引物包含EGFR基因突变位点；
所述Taqman-MGB探针特异识别ARMS引物的扩增产物正义链突变位点的Taqman探针，所述探针的3’端结合有小沟结合分子。所述突变位点为EGFR基因2235-2249位缺失、2236-2250位缺失、2236-2253位缺失、2239-2253位缺失、2240-2257位缺失、2582位突变和2573位突变中的ー种或多种。
优选的，所述试剂盒中，检测EGFR基因2235-2249位缺失的引物对由SEQ ID No 6所示的上游引物和SEQ ID No 7所示的下游引物组成，Taqman-MGB探针的核苷酸序列如SEQ ID No 21 所示；
检测EGFR基因2236-2250位缺失的引物对由SEQ ID No 8所示的上游引物和SEQ IDNo 9所示的下游引物组成，Taqman-MGB探针的核苷酸序列如SEQ ID No 23所示；
检测EGFR基因2236-2253位缺失的引物对由SEQ ID No :10所示的上游引物和SEQ IDNo 11所示的下游引物组成，Taqman-MGB探针的核苷酸序列如SEQ ID No 25所示；
检测EGFR基因2239-2253位缺失的引物对由SEQ ID No :12所示的上游引物和SEQ IDNo 13所示的下游引物组成，Taqman-MGB探针的核苷酸序列如SEQ ID No 27所示；
检测EGFR基因2240-2257位缺失的引物对由SEQ ID No : 14所示的上游引物和SEQ IDNo 15所示的下游引物组成，Taqman-MGB探针的核苷酸序列如SEQ ID No 29所示；
检测EGFR基因2582位突变的引物对由SEQ ID No 16所示的上游引物和SEQ ID No 5所示的下游引物组成，Taqman-MGB探针的核苷酸序列如SEQ ID No 33所示；
检测EGFR基因2573位突变的引物对由SEQ ID No 17所示的上游引物和SEQ ID No 4所示的下游引物组成，Taqman-MGB探针的核苷酸序列如SEQ ID No :31所示。更优选的，所述试剂盒还包括DNA质量控制位点的检测引物对和识别所得扩增子的Taqman-MGB探针，所述引物对由SEQ ID No : 18所示的上游引物和SEQ ID No:19所示的下游引物组成，所述Taqman-MGB探针的核苷酸序列如SEQ ID No 35所示。更优选的，所述试剂盒由PCR缓冲液、dNTPs、引物对、Taqman-MGB探针、MgCl2、TaqDNA聚合酶和模板DNA组成，各组分反应时终浓度为
权利要求
1.检测EGFR基因突变位点的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含检测EGFR基因突变位点的ARMS弓I物对和特异识别所述突变位点的Taqman-MGB探针；所述ARMS弓I物对的上游引物或下游弓I物包含EGFR基因突变位点； 所述Taqman-MGB探针特异识别ARMS引物的扩增产物正义链突变位点的Taqman探针，所述探针的3’端结合有小沟结合分子。
2.根据权利要求I所述检测EGFR基因突变位点的试剂盒，其特征在于所述突变位点为EGFR基因2235-2249位缺失、2236-2250位缺失、2236-2253位缺失、2239-2253位缺失、2240-2257位缺失、2582位突变和2573位突变中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述检测EGFR基因突变位点的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中，检测EGFR基因2235-2249位缺失的引物对由SEQ ID No 6所示的上游引物和SEQ IDNo 7所示的下游引物组成，Taqman-MGB探针的核苷酸序列如SEQ ID No 21所示； 检测EGFR基因2236-2250位缺失的引物对由SEQ ID No 8所示的上游引物和SEQ IDNo 9所示的下游引物组成，Taqman-MGB探针的核苷酸序列如SEQ ID No 23所示； 检测EGFR基因2236-2253位缺失的引物对由SEQ ID No :10所示的上游引物和SEQ IDNo 11所示的下游引物组成，Taqman-MGB探针的核苷酸序列如SEQ ID No 25所示； 检测EGFR基因2239-2253位缺失的引物对由SEQ ID No :12所示的上游引物和SEQ IDNo 13所示的下游引物组成，Taqman-MGB探针的核苷酸序列如SEQ ID No 27所示； 检测EGFR基因2240-2257位缺失的引物对由SEQ ID No :14所示的上游引物和SEQ IDNo 15所示的下游引物组成，Taqman-MGB探针的核苷酸序列如SEQ ID No 29所示； 检测EGFR基因2582位突变的引物对由SEQ ID No 16所示的上游引物和SEQ ID No 5所示的下游引物组成，Taqman-MGB探针的核苷酸序列如SEQ ID No 33所示； 检测EGFR基因2573位突变的引物对由SEQ ID No 17所示的上游引物和SEQ ID No 4所示的下游引物组成，Taqman-MGB探针的核苷酸序列如SEQ ID No :31所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述检测EGFR基因突变位点的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括DNA质量控制位点的检测引物对和识别所得扩增产物的Taqman-MGB探针，所述引物对由SEQ ID No 18所示的上游引物和SEQ ID No 19所示的下游引物组成，所述Taqman-MGB探针的核苷酸序列如SEQ ID No 35所示。
5.根据权利要求4所述所述检测EGFR基因突变位点的试剂盒，其特征在于所述试剂盒由PCR缓冲液、dNTPs、引物对、Taqman-MGB探针、MgCl2、TaqDNA聚合酶和模板DNA组成，各组分反应时终浓度为 PCR缓冲液终浓度0. 5 2. 5 X ; dNTPs0. I 0. 75mM ； 弓I物对终浓度分别为150 350nM ； 模板 DNA0. 01 10ng/ii L ; TaqDNA 聚合酶0. 01 I. OU/ ii L ; MgCl2终浓度为I. 5 3. 5mM ; Taqman-MGB探针终浓度为50 200nM。
6.根据权利要求5所述检测EGFR基因突变位点的试剂盒，其特征在于所述PCR缓冲液、dNTPs、引物对、Taqman-MGB探针、MgCl2、TaqDNA聚合酶和模板DNA终浓度组成为PCR缓冲液终浓度I X ； dNTPs0. 25mM ； 弓I物对终浓度分别为250nM ； 模板 DNA0. 05 I. 5ng/ u L ； TaqDNA 聚合酶0. 01 I. OU/ ii L ; MgCl2终浓度为2. 0 2. 5mM ; Taqman-MGB探针终浓度为50nM。
7.根据权利要求6所述检测EGFR基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述dNTP混合液包括 10 mM dATP、10 mM dCTP、10 mM dTTP、10 mM dGTP 的混合液；所述 PCR 缓冲液包括Tris Cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；-20°C下pH值在8. 0-9. 0间。
8.根据权利要求6所述检测EGFR基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述模板DNA从外周血、冰冻切片、新鲜组织、石蜡切片中提取。
全文摘要
本发明公开了检测EGFR基因突变位点的试剂盒，本发明的试剂盒采用ARMS特异突变富集技术与Taqman-MGB探针特异检测技术相结合，检测EGFR基因突变位点，试剂盒中包括检测EGFR基因突变位点的ARMS引物对和相应的Taqman-MGB探针；本发明公开的试剂盒灵敏度高、同时可以检测多个样本，成本低，为临床医生用药提供指导，实现肿瘤病人的个体化治疗，降低治疗风险以及患者负担，具有广泛的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK102808027SQ20121029181
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月16日 优先权日2012年8月16日
发明者王弢, 秦勇 申请人:苏州工业园区为真生物医药科技有限公司