一种诱变复合霉菌发酵制备纤溶酶的方法
【专利摘要】一种诱变复合霉菌发酵制备纤溶酶的方法属于生物发酵【技术领域】，该方法包括以下步骤：(1)将黄豆与红豆混合后进行超微粉碎，超微粉碎后与水混合得混合液；(2)将黑曲霉与米曲霉复配混合形成复合霉菌，将复合霉菌活化后进行N+离子注入诱变，将N+离子注入后的复合霉菌进行磁场二次诱变，将二次诱变的复合霉菌接种于已灭菌的混合液中进行发酵，发酵后离心分离取上清液；(3)将上清液透析后进行超滤处理，超滤后进行真空浓缩、冷冻干燥即得纤溶酶；本方法采用离子注入诱变技术结合磁场诱变技术应用于复合霉菌的诱变育种，将诱变后的复合霉菌进行发酵制备纤溶酶，该方法生产周期短，制备的纤溶酶活性高，可应用于高溶栓活性发酵食品的研发。
【专利说明】一种诱变复合霉菌发酵制备纤溶酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物发酵【技术领域】，主要涉及一种诱变复合霉菌发酵制备纤溶酶的方法。
【背景技术】
[0002]血栓栓塞性疾病主要是由于纤溶系统的异常所引起的。血栓疾病的临床治疗方法主要有外科手术、抗栓疗法、溶栓疗法，在这些疗法中，溶栓疗法效果好，费用低。目前临床已使用的溶血栓药物有链激酶(SK)、尿激酶(UK)、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)等，这些药物具有较好溶栓效果，但是还存在一些副作用，而且价格昂贵，因此，寻找发现更高溶栓特异性、更好溶栓效果、更小副作用的溶栓药物刻不容缓，而微生物由于其分布广、繁殖快，代谢产物多，且发酵工业发达，因此，从生物代谢产物中分离出溶栓代谢产物，提高发酵产酶活力对缓解血栓性疾病意义重大。
[0003]J1-Hyun Seo (2001)用NB肉汤培养基并添加碳、氮源和无机盐进行强化培养杆菌NA-1，发现摇床培养发酵72h纤溶活性达7.8unit/mL。JM Kim(2002)以葡萄糖、酵母提取物作碳源和氮源，枯草芽孢杆菌的酪蛋白裂解能力和纤维蛋白裂解能力，最高可达3473.2unit和47.4munit。加入Ca2+能增加其酪蛋白裂解能力和纤维蛋白裂解能力，可增加至4949.3unit和58.2unit/mg。刘晓兰(2003)以麸皮:豆柏=I: 2，初始pH5.0，加水量0.75ml/g物料，MnSO4.H2O和(NH4)2SO4添加量分别为0.25%和1.42%的物料为基质培养根霉72h，优化条件下的纤溶酶产量平均达791.81u/g物料。除此之外，国内外学者还从放线菌、霉菌、细菌、海洋假单孢菌等微生物的代谢产物中发现纤溶活性物质。
[0004]然而，通常从自然界分离得到的野生菌株代谢产物产量往往很低，远不能满足工业生产的需要，因此微生物应用的难题集中到如何对菌种进行改良，以获得高产高效的优良工业菌株。而微生物育种的目的就是要人为地使某些代谢产物过量积累，把生物合成的代谢途径朝着人们所希望的方向加以引导，获得所需要的高产、优质和低耗的菌种，以降低生产成本。
[0005]离子注入诱变是集物理诱变、化学诱变为一体的综合诱变方法，1986年由中科院等离子体所率先将低能离子束技术应用于诱变育种。该技术是利用离子注入设备对生物体进行离子注入，注入的离子对细胞的刻蚀可使细胞由表及里形成微孔或洞，生物分子吸收能量并引起多类活性自由基的复杂变化，从而引起染色体的畸变，导致DNA链碱基的损伤、断裂，最终导致遗传物质的永久改变，然后从变异菌株中选育优良菌株。该技术应用于微生物诱变育种时具有损伤轻、突变率高、突变谱广、变异幅度大、性状稳定等特点，其所选用的离子一般为气体单质的正离子，其中以K最多，近年来在工业微生物优良株的诱变选育或改良中取得了较大的成功。
[0006]磁场生物学效应是生物磁学领域的一个研究热点。磁场作用于生物体的最直接效应可能是影响膜内电场变化、细胞膜及跨膜信息传递活性、细胞酶活、自由基基团等，进而引起生物大分子(如DNA)造成损伤，使生物产生基因的损伤和突变等效应，从而间接影响基因的转录与表达。尽管电磁场对微生物基因表达的作用机制目前尚不清楚，但国内外已有大量关于磁场作用于微生物菌株的研究。基于磁场对微生物菌株生长和代谢产量的促进作用，使得磁场可以作为微生物菌种诱变研究中的有效手段。
[0007]本发明采用离子注入诱变技术结合磁场诱变技术应用于复合霉菌的诱变育种，将诱变后的复合霉菌进行发酵制备纤溶酶，降低了成本，提高了纤溶酶活性和产量，为今后高纤溶酶活性物质的开发奠定基础。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种诱变复合霉菌发酵制备纤溶酶的方法，达到提高诱变效率、缩短生产周期、提高纤溶酶活性的目的，为临床上溶栓药物的开发提供新的可能。
[0009]本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的:
[0010]一种诱变复合霉菌发酵制备纤溶酶的方法，该方法包括以下步骤:(I)将黄豆与红豆混合形成混合豆，所述的黄豆与红豆的质量比为1: 1-3，将混合豆用QLM扁平式超音速气流粉碎系统进行超微粉碎，所述的进料气流为0.6MPa，粉碎气流为0.6MP，超微粉碎后与水混合得到混合液；(2)将黑曲霉与米曲霉以1:1的复配比例混合形成复合霉菌，将复合霉菌活化后进行N+离子注入诱变，所述的注入能量为5-25keV，注入剂量为20 X IOi4-1OOX 1014ionS/cm2，将N+离子注入后的复合霉菌进行磁场二次诱变，所述的磁场强度为0.2-1.0A/m，磁场作用时间为0.5-2.5h，将二次诱变的复合霉菌接种于已灭菌的混合液中进行发酵，所述的接种量为混合液质量的8-16%，发酵温度为28-36°C，发酵时间为10-30h，发酵后离心分离 取上清液；(3)将上清液透析后进行超滤处理，超滤后进行真空浓缩、冷冻干燥即得纤溶酶。
[0011]所述的优选黄豆与红豆的质量比为1: 2。
[0012]所述的N+离子注入诱变优选参数为:注入能量IOkeV,注入剂量80X 1014ions/
2
cm ο
[0013]所述的磁场二次诱变优选参数为:磁场强度0.6A/m,磁场作用时间为lh。
[0014]所述的发酵工艺优选参数为:接种量为混合液质量的10%，发酵温度为32°C，发酵时间为20h。
[0015]本方法采用离子注入诱变技术结合磁场诱变技术应用于复合霉菌的诱变育种，将诱变后的复合霉菌霉菌接种于混合豆类发酵培养基中进行发酵制备纤溶酶，该方法所需要的工艺设备简单、成本低，具有诱变效率高、生产周期短、纤溶酶活性高等特点，该技术成果可应用于研发高溶栓活性食品及进一步提纯纤溶酶粉。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]附图本发明总工艺路线图。
【具体实施方式】
[0017]下面结合附图对本发明具体实施例进行详细描述，
[0018]一种诱变复合霉菌发酵制备纤溶酶的方法，该方法包括以下步骤:(I)将黄豆与红豆混合形成混合豆，所述的黄豆与红豆的质量比为1: 1-3，将混合豆用QLM扁平式超音速气流粉碎系统进行超微粉碎，所述的进料气流为0.6MPa，粉碎气流为0.6MP，超微粉碎后与水混合得到混合液；(2)将黑曲霉与米曲霉以1:1的复配比例混合形成复合霉菌，将复合霉菌活化后进行N+离子注入诱变，所述的注入能量为5-25keV，注入剂量为20 X IOi4-1OOX 1014ionS/cm2，将N+离子注入后的复合霉菌进行磁场二次诱变，所述的磁场强度为0.2-1.0A/m，磁场作用时间为0.5-2.5h，将二次诱变的复合霉菌接种于已灭菌的混合液中进行发酵，所述的接种量为混合液质量的8-16%，发酵温度为28-36°C，发酵时间为10-30h，发酵后离心分离取上清液；(3)将上清液透析后进行超滤处理，超滤后进行真空浓缩、冷冻干燥即得纤溶酶。
[0019]所述的优选黄豆与红豆的质量比为1: 2。
[0020]所述的N+离子注入诱变优选参数为:注入能量IOkeV,注入剂量80X 1014ions/
cm2[0021]所述的磁场二次诱变优选参数为:磁场强度0.6A/m,磁场作用时间为lh。
[0022]所述的发酵工艺优选参数为:接种量为混合液质量的10%，发酵温度为32°C，发酵时间为20h。
[0023]实施例1:
[0024]将黄豆与红豆以质量比为1: 2的比例混合形成混合豆，在进料气流为0.6MPa、粉碎气流为0.6MP条件下，将混合豆用QLM扁平式超音速气流粉碎系统进行超微粉碎，超微粉碎后与水混合得到混合液，将黑曲霉与米曲霉以1:1的复配比例混合形成复合霉菌，将复合霉菌活化后在注入能量为lOkeV、注入剂量为80X 1014ionS/cm2条件下进行N+离子注入诱变，在磁场强度为0.6A/m条件下将N+离子注入后的复合霉菌进行磁场二次诱变lh，在接种量为10%、发酵温度为32°C条件下，将二次诱变的复合霉菌接种于已灭菌的混合液中进行发酵20h，发酵后离心分离取上清液，将上清液透析后进行超滤处理，超滤后进行真空浓缩、冷冻干燥即得纤溶酶。
[0025]实施例2:
[0026]将黄豆与红豆以质量比为1:1的比例混合形成混合豆，在进料气流为0.6MPa、粉碎气流为0.6MP条件下，将混合豆用QLM扁平式超音速气流粉碎系统进行超微粉碎，超微粉碎后与水混合得到混合液，将黑曲霉与米曲霉以1:1的复配比例混合形成复合霉菌，将复合霉菌活化后在注入能量为15keV、注入剂量为60X 1014ionS/cm2条件下进行N+离子注入诱变，在磁场强度为0.4A/m条件下将N+离子注入后的复合霉菌进行磁场二次诱变1.5h，在接种量为12%、发酵温度为32°C条件下，将二次诱变的复合霉菌接种于已灭菌的混合液中进行发酵15h，发酵后离心分离取上清液，将上清液透析后进行超滤处理，超滤后进行真空浓缩、冷冻干燥即得纤溶酶。
[0027]实施例3:
[0028]将黄豆与红豆以质量比为1: 3的比例混合形成混合豆，在进料气流为0.6MPa、粉碎气流为0.6MP条件下，将混合豆用QLM扁平式超音速气流粉碎系统进行超微粉碎，超微粉碎后与水混合得到混合液，将黑曲霉与米曲霉以1:1的复配比例混合形成复合霉菌，将复合霉菌活化后在注入能量为lOkeV、注入剂量为100X1014ionS/Cm2条件下进行N+离子注入诱变，在磁场强度为0.8A/m条件下将N+离子注入后的复合霉菌进行磁场二次诱变lh，在接种量为8%、发酵温度为30°C条件下，将二次诱变的复合霉菌接种于已灭菌的混合液中进行发酵25h，发酵后离心分离取上清液，将上清液透析后进行超滤处理，超滤后进行真空浓缩、冷冻干燥即得纤溶 酶。
【权利要求】
1.一种诱变复合霉菌发酵制备纤溶酶的方法，其特征在于该方法包括以下步骤:(1)将黄豆与红豆混合形成混合豆，所述的黄豆与红豆的质量比为1: 1-3，将混合豆用QLM扁平式超音速气流粉碎系统进行超微粉碎，所述的进料气流为0.6MPa，粉碎气流为0.6MP，超微粉碎后与水混合得到混合液；(2)将黑曲霉与米曲霉以1:1的复配比例混合形成复合霉菌，将复合霉菌活化后进行N+离子注入诱变，所述的注入能量为5-25keV，注入剂量为20 X IOi4-1OOX 1014ionS/cm2，将N+离子注入后的复合霉菌进行磁场二次诱变，所述的磁场强度为0.2-1.0A/m，磁场作用时间为0.5-2.5h，将二次诱变的复合霉菌接种于已灭菌的混合液中进行发酵，所述的接种量为混合液质量的8-16%，发酵温度为28-36°C，发酵时间为10-30h，发酵后离心分离取上清液；(3)将上清液透析后进行超滤处理，超滤后进行真空浓缩、冷冻干燥即得纤溶酶。
2.根据权利要求1所述的一种诱变复合霉菌发酵制备纤溶酶的方法，其特征在于所述的优选黄豆与红豆的质量比为1: 2。
3.根据权 利要求1所述的一种诱变复合霉菌发酵制备纤溶酶的方法，其特征在于所述的N+离子注入诱变优选参数为:注入能量IOkeV,注入剂量80X 1014ions/cm2。
4.根据权利要求1所述的一种诱变复合霉菌发酵制备纤溶酶的方法，其特征在于所述的磁场二次诱变优选参数为:磁场强度0.6A/m,磁场作用时间为lh。
5.根据权利要求1所述的一种诱变复合霉菌发酵制备纤溶酶的方法，其特征在于所述的发酵工艺优选参数为:接种量为混合液质量的10%，发酵温度为32°C，发酵时间为20h。
【文档编号】C12N9/68GK104004741SQ201410249253
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】吴非, 孙楚, 赵城彬, 周媛媛, 姚子鹏, 李秋, 刘瑶, 董兴叶, 刘金阳, 盛慧 申请人:东北农业大学