一种产葡萄糖转苷酶的黑曲霉突变菌株的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程技术领域，具体内容涉及一种产葡萄糖转苷酶的黑曲霉突变菌株及其应用。
技术背景
[0002]葡萄糖转苷酶可专一性地切开糖类底物分子中非还原端的α-1，4糖苷键，释放出葡萄糖，或将游离出的葡萄糖残基以α_1，6糖苷键转移到另一个糖类底物上，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖(简称IMO，主要包括异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖及四糖以上的低聚糖)、糖脂或糖肽等。在低聚异麦芽糖的生产中，利用葡萄糖转苷酶的水解作用和其转苷作用是生产低聚异麦芽糖的关键。因此葡萄糖转苷酶倍受国内外食品工业界的重视。
[0003]葡萄糖转苷酶在自然界中分布广泛，种类繁多，性质各异，几乎存在于所有生物体内，在人类的糖原降解及动物、植物和微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。目前，国内葡萄糖转苷酶的用量虽然很大，但由于成本过高而难以实现工业化生产，仍然依赖进口，这些限制因素也导致国内MO的生产受到严重kj制约。本领域亟需获得高活性的葡萄糖转苷酶及其相应的稳定、高产的生产菌株。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一株高产葡萄糖转苷酶的黑曲霉突变菌株，是通过紫外诱变的方法获得葡萄糖转苷酶产量明显提升的黑曲霉突变菌株，为葡萄糖苷酶的广泛应用奠定了基础。
[0005]本发明一方面提供了一株黑曲霉突变菌株黑曲霉Su-T2(Aspergillus niger Su-T2)，已于2015年11月18日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:M2015682o
[0006]本发明还提供了上述黑曲霉突变菌株在葡萄糖转苷酶生产中的应用。
[0007]本发明还提供一种生产葡萄糖转苷酶的方法，是用上述的黑曲霉突变菌株发酵来制备的。
[0008]本发明通过紫外诱变筛选获得一株黑曲霉突变菌株SU-T2ο该菌株在摇瓶发酵条件下，产葡萄糖转苷酶活力达到4.08u/ml，比出发菌株提高了 61.9 % ;在30L发酵罐条件下，该菌株产葡萄糖转苷酶活力达到10.73u/ml，比出发菌株提高了 71.4 %。该突变菌株可广泛应用于葡萄糖转苷酶的生产，为该酶的利用奠定了基础。
【具体实施方式】
[0009]本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL，3nd Ed.(Sambrook，2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR B10L0GY(Ausubel，2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
[0010]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细描述。
[0011]实施例1出发菌株产葡萄糖转苷酶能力检测
[0012]出发菌株:黑曲霉Su-Tl(Aspergillusniger Su-Tl)，该菌株是由发明人徐晓东于2013年10月筛选自山东省青岛市崂山区林场的土壤中。
[0013]将黑曲霉Su-Tl菌株接种PDA平板，30°C培养5_7d。待菌落表面变黑，产生大量孢子时，割取2cm X 2cm大小的菌块，接种至50ml液体摇瓶培养基中发酵，32°C培养5d，每天加入适量氨水，控制PH在4.5左右。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，进行葡萄糖转苷酶酶活力检测。结果显示，黑曲霉Su-Tl发酵上清液中葡萄糖转苷酶活力为2.52u/ml。
[0014](I)葡萄糖转苷酶酶活单位的定义
[0015]在50°C、pH值为‘一的条件下’每分钟从浓度为如^丨凡的对硝基苯酚^-葡萄糖苷溶液中释放Iymol对硝基苯酚所需要的酶量即为一个酶活力单位U。
[0016](2)标准曲线绘制
[0017]5mmol/L对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷底物溶液:秤取0.0753g对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷，精确到0.0OOlg,缓慢加入0.05mol/L pH = 4.8的柠檬酸缓冲液至接近50ml，磁力搅拌约lOmin，用2mol/L的朽1檬酸或者氢氧化钠调相应的pH值，最后定容至50ml，现用现配。
[0018]秤取对硝基苯酚0.0696g，用0.05mol/L pH=4.8的柠檬酸缓冲液定容至10ml棕色容量瓶中，磁力搅拌30min至完全溶解即得5mmol/L对硝基苯酚溶液。
[0019]将5mmol/L对硝基苯酚溶液精确稀释10倍即得对硝基苯酚标准液。将对硝基苯酚标准液分别稀释2、4、6、8、1、12、16倍。
[0020]取0.5ml上述对硝基苯酚稀释液(空白对照取缓冲液)，加入2ml碳酸钠溶液，加入
0.5ml5mmol/L对硝基苯酸-a-D-葡萄糖苷底物溶液，混合均勾，以空白对照调零，以在410nm测定吸光值。以体系中对硝基苯酚含量为横坐标X，吸光值为纵坐标Y，绘制标准曲线Y=kX+
bo
[0021](3)酶活测定
[0022]取适量底物，50°C预热5min;
[0023]取4支15*150试管(I支空白管，3支样品管)，分别向4支管中准确加入已稀释好的酶液0.5mI ；
[0024]将4支试管同时置于50°C水浴中，预热2min;
[0025]准确向样品试管中加入0.5ml5mmol/L对硝基苯酚-a-D-葡萄糖苷底物溶液底物溶液，准确计时15min;
[0026]迅速向各管中加入2ml碳酸钠溶液，于空白管中加入底物溶液0.5ml，摇匀；
[0027]以空白管调零，在分光光度计波长410nm下，用1mm比色杯分别测量。
[0028]3样品管中的吸光值取平均值，通过查标准曲线求出对硝基苯酚的含量。
[0029]酶活力计算公式:A=X X 1/0.5 X n/15
[0030]A--a-葡萄糖转苷酶酶活力，u/ml;
[0031 ]X——吸光值在标准曲线上查得的对硝基苯酚含量，μπιο?;
[0032]1/0.5——换算成酶液lml;
[0033]η一一酶样的稀释倍数；
[0034]15一一时间换算系数。
[0035]实施例2紫外诱变与筛选
[0036]1、确定致死率:
[0037]接种上述黑曲霉Su-Tl于PDA平板，30°C培养5_7d。待菌落表面变黑，产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，离心后用无菌水重悬，用血球计数板计数。取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为I X 17)，加入转子，并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，分别照射30s、45s、60s、75s、90s、105s、120s，取照射后的孢子液稀释10、100、1000倍，取10ul涂布TOA平板，30°C培养2-3d后计数，以未照射的孢子液为对照，计算致死率。结果显示，照射90s时，致死率为95%，选取该照射时间进行后续诱变实验。
[0038]2诱变筛选:
[0039]取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为I XlO7)，加入转子，并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，照射90s后稀释1000倍，取I OOul涂布PDA平板，30°C培养2_3d。
[0040]共涂布200块PDA平板，30°C培养2_3d后，每个平板长出30-50个菌落。先通过菌落形态，筛选短分枝的突变体，挑取菌落形态较小、菌丝致密、菌落周围绒毛较短的突变体238个，分别接种到PDA平板，30°<3培养5-7(1。每个转化子割取2(^\2(^大小的菌块，分别接种至50ml液体摇瓶培养基中发酵，32°C培养5d，每天加入适量氨水，控制pH在4.5左右。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，分别对粗酶液进行葡萄糖转苷酶酶活力检测。
[0041]酶活测定结果显示，上述通过紫外诱变获得的突变菌株中葡萄糖转苷酶产量最高的突变菌株为黑曲霉Su-T2(Aspergillus niger Su_T2)，该菌株发酵上清液中葡萄糖转苷酶酶活力达到4.08u/ml，比出发菌株提高了61.9 %。
[0042]该突变菌株已于2015年11月18日将突变菌株黑曲霉Su-T2(Aspergillus nigerSu-T2)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2015682。
[0043]实施例3发酵罐发酵验证
[0044]在30升发酵罐上进行上述突变菌株黑曲霉SU-T2和出发菌株黑曲霉Su-Tl的发酵，发酵使用的培养基配方为:麦芽糖2.5g/L、硫酸铵0.9%、磷酸氢二钠0.15g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸钾0.5g/L、硫酸镁16.4g/L、柠檬酸钠0.2g/L、磷酸二氢钾0.25%、豆粉0.5%、消泡剂0.05%。补料培养基:麦芽糖浓度为400g/L，pH调至4.0-5.0之间。
[0045]发酵生产工艺:pH值4.0、温度30°C、搅拌速率300-700rpm、通风量1.0-1.5(ν/ν)、
溶氧控制在20%以上。
[0046]整个发酵过程分为三个阶段:第一阶段为菌体培养阶段，按7%比例接入种子，30°C培养15-25h，以溶氧回升为标志;第二阶段为饥饿阶段，当底糖耗完之后，不流加任何碳源，溶氧上升至60%以上表明该阶段结束，为期约30-120min;第三阶段为产酶阶段，流加补料培养基进行产酶培养，期间保持溶氧在20%以上且维持发酵液中还原糖浓度不低于Ig/L，发酵周期在140-170h之间。发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液。
[0047]对上述获得的粗酶液分别进行葡萄糖转苷酶酶活测定，结果显示，出发菌株黑曲霉Su-TI发酵液酶活为6.26u/ml，而突变菌株黑曲霉Su_T2发酵液酶活高达10.73u/ml，比出发菌株提高了71.4%。
【主权项】
1.一株黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述的突变株的保藏号为CCTCCN0:M2015682o2.如权利要求1所述的黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述的黑曲霉突变菌株是通过紫外诱变方法获得的。3.权利要求1所述的黑曲霉突变菌株在生产葡萄糖转苷酶中的应用。4.一种生产葡萄糖转苷酶的方法，其特征在于，所述的方法是用权利要求1所述的黑曲霉突变菌株发酵来制备的。
【专利摘要】本发明的目的是提供一株高产葡萄糖转苷酶的黑曲霉突变菌株，是通过紫外诱变的方法获得的。本发明的黑曲霉突变菌株，其保藏号为CCTCCNO：M2015682。本发明通过紫外诱变筛选获得一株黑曲霉突变菌株Su-T2。该菌株在摇瓶发酵条件下，产葡萄糖转苷酶活力达到4.08u/ml，比出发菌株提高了61.9％；在30L发酵罐条件下，该菌株产葡萄糖转苷酶活力达到10.73u/ml，比出发菌株提高了71.4％。该突变菌株可广泛应用于葡萄糖转苷酶的生产，为该酶的利用奠定了基础。CCTCC NO：M201568220151118
【IPC分类】C12R1/685, C12N9/10, C12N1/14
【公开号】CN105505787
【申请号】CN201510996318
【发明人】徐晓东, 张珍珍, 刘文瑶, 刘安邦
【申请人】青岛蔚蓝生物集团有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月25日