控制曲霉属丝状真菌形成菌丝球的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生工程，特别涉及一种控制曲霉属丝状真菌形成菌丝球的方法。
技术背景
[0002]曲霉属丝状真菌广泛分布在谷物、空气、土壤和各种物品上。比较常见的有黑曲霉、米曲霉、构巢曲霉等。它们在生物技术发展过程中发挥了很大的作用，很多产品来自于丝状真菌的初级和次级代谢产物。黑曲霉已经用来生产柠檬酸和很多酶类，例如市场上常见淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、葡萄糖酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氧酶、半乳糖苷酶、木聚糖酶、柚苷酶、单宁酶、脂肪酶、植酸酶、蛋白酶、果胶酶等都可以从曲霉属丝状真菌中获得。曲霉属丝状真菌可以根据培养基的不同而产不同种酶的组合，如纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶。美国食品和药物管理局(FDA)已经认定多种来自曲霉属丝状真菌的产物是安全的，所以曲霉属丝状真菌的产物被广泛用于食品级产品中。
[0003]在深层培养过程中曲霉属丝状真菌在一定条件下会形成菌丝球。丝状真菌以菌丝球的形态生长有发酵液粘度低、传质好、产物产量高、菌体回收简单等优点。而且控制一定的菌丝球大小还可以进一步避免溶氧限制、提高产物产量、减低生物反应器的能耗。所以控制丝状真菌菌丝球的大小是一项重要的技术。丝状真菌菌丝球还可以吸附废水中的金属离子、染料达到处理废水的目的。丝状真菌还可以和其它单细胞微生物共成球，例如黑曲霉和多种海藻共成球后形成简单的收获方法。利用菌丝球收获的方法节约了单细胞微生物水处理在收获时所需要的大型耗能设备，降低了成本。
【发明内容】
[0004]本发明的目的，就是为了提供一种控制曲霉属丝状真菌形成菌丝球的方法。
[0005]为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案:一种控制曲霉属丝状真菌形成菌丝球的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0006]第一步、孢子的培养
[0007]将曲霉属丝状真菌接种到固体培养基上，在22°C -32°C培养箱中培养48_240h，曲霉属丝状真菌形成孢子；
[0008]第二步、孢子悬浮液的制备
[0009]利用无菌水或者磷酸缓冲液洗涤孢子，得到孢子悬浮液，分装到灭菌后的小管中，在2-6 °C下保存待用；
[0010]第三步、控制曲霉属丝状真菌形成菌丝球
[0011]将孢子悬浮液接种到察氏培养基中，接种孢子浓度为7.23X10VL?8.68 X 18/L ;然后，置于旋转式摇床中培养，培养条件为:pH 3.0?8.0，温度22-35°C，摇床转速100-200rpm ;在察氏培养基中培养48h后，曲霉属丝状真菌形成菌丝球。
[0012]所述曲霉属丝状真菌包括黑曲霉、米曲霉或构巢曲霉。
[0013]所述固体培养基包括PDA琼脂培养基、含2%琼脂的察氏培养基或YPD固体培养基。
[0014]上述第三步在察氏培养基中的培养时间为48_168h。
[0015]所述察氏培养基的制作方法如下:取glucose 25.0g、NaN033.0g、K2HPO4L 0g、KCl
0.5g、MgS04.7Η20 0.5g 和 FeSO4.7Η20 0.0lg，加去离子水至 IL ;再用 lmol/L HCl 和 ImoI/L NaOH 调节 pH 为 5.5。
[0016]本发明在察氏培养基中通过控制培养条件培养曲霉属丝状真菌得到菌丝球，具有提高产量、提高传质、回收菌体简单的优点。丝状真菌是一类能形成绒毛状、网状或絮状菌丝体的真菌。曲霉属丝状真菌的菌丝在一定条件下可以在液体培养中相互缠绕，形成球状或者椭圆形的菌丝球。来自黑曲霉、米曲霉多种代谢物(有机酸等)是美国食品和药品管理局(FDA)批准的食品安全级产品。而且它在食品中有很长时间应用历史。曲霉属菌丝球在pH 4-6时吸附Cu'Zn'Ni'其中，黑曲霉以菌丝球的方式发酵有利于柠檬酸的产生和其它多种代谢物的产生。丝状真菌菌丝球的另外一个优点是有利于菌体的收获。菌丝球的直径大多数在0.5cm以上，用简单的筛子就可以收获菌丝球，降低了收获过程的成本。利用菌丝球收获的方法节约了大型耗能设备，降低了成本，而且在污水处理过程中避免使用化学絮凝剂，减少了对环境的危害。本发明采用只含有葡萄糖为有机碳源的察氏培养基为基础，对黑曲霉的孢子浓度、培养基的初始pH、葡萄糖浓度进行了优化。结果表明黑曲霉在培养24h时就可以形成清晰的菌丝球，且在随后的时间内，菌丝球一直保持稳定，没有出现菌丝球裂解的现象。在察氏培养基中，黑曲霉在孢子浓度为7.23 X 103/L?3.62X 107/L、初始pH3.5?pH7.5之间都可以形成菌丝球。降低察氏培养基的葡萄糖浓度后，黑曲霉仍然可以形成菌丝球。以上的研究结果表明黑曲霉有较宽的菌丝球形成条件，为黑曲霉的广泛应用提供了便利。
【附图说明】
[0017]图1为不同孢子浓度对黑曲霉在察氏培养基中成球的影响；
[0018]图2为孢子浓度对曲霉属丝状真菌在察氏培养基中的菌丝球的影响；
[0019]图3为不同pH值对黑曲霉在察氏培养基中成球的影响；
[0020]图4为不同孢子浓度的黑曲霉在察氏培养基中的菌丝球；
[0021]图5为黑曲霉在不同葡萄糖浓度的察氏培养基中成球；
[0022]图6为黑曲霉在不同葡萄糖浓度的察氏培养基中的菌丝球。
[0023]具体实施方法
[0024]下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明。
[0025]实施例1
[0026]将黑曲霉接种到PDA琼脂培养基上，在22°C _32°C培养箱中培养96_144h后，丝状真菌形成孢子。
[0027]利用无菌水洗涤丝状真菌孢子，将得到的孢子悬浮液经过显微镜计数后，分装到灭菌后的小管中，存于2_6°C，待用。
[0028]将制备后的孢子悬浮液接种到察氏培养基中，生物量在孢子浓度为7.23X 13/L?8.68X 106/L。培养条件是:pH 5.5，温度30°C，搅拌转速200rpm，察氏培养基经过72h培养后，孢子浓度对曲霉属丝状真菌在察氏培养基中生长的影响见图1。随着孢子浓度的增力口，生物量逐渐增加。生物量在孢子浓度为4.34X 106/L?8.68X 106/L之间获得较高的生物量(14.27g/L?15.70g/L)。培养液中的残余糖浓度在9.61g/L?7.61g/L之间波动。孢子浓度为7.23X 103/L?7.23X 104/L之间时，pH值随着孢子浓度的升高下降的更加剧。孢子浓度继续升高时，最终PH变化不明显(pH3.15?pH3.30)。黑曲霉在本实验的孢子浓度范围内均可以形成菌丝球(图2)。
[0029]实施例2
[0030]将米曲霉接种到含2%琼脂的察氏培养基上，在22°C _32°C培养箱中培养24_72h，丝状真菌形成孢子。
[0031]利用磷酸缓冲液洗涤丝状真菌孢子，将得到的孢子悬浮液经过显微镜计数后，分装到灭菌后的小管中，存于2-6°C，待用。
[0032]将制备后的孢子悬浮液接种到察氏培养基中，接种孢子浓度为7.23X10S/L。温度30°C，搅拌转速200rpm，经过72h培养后。初始pH对黑曲霉在察氏培养基中的生长情况见图3。在初始pH3.5?pH5.6之间，生物量随着初始pH值的增大而逐渐升高。而初始pH高于5.6时，生物量略有下降，说明初始pH超过5.6对细胞生长有微弱抑制。初始pH越高，PH下降的幅度越大。初始pH3.5?pH6.5时察氏培养基中残余葡萄糖的含量波动很小(8.79g/L?9.73g/L)。当初始pH7.5时，残余葡萄糖升高到11.31g/L。这和生物量下降的结果相符。图3是黑曲霉在不同初始pH的条件下，经过72h的培养形成的菌丝球。由图4可以看出黑曲霉在初始PH3.5?pH7.5之间都可以形成菌丝球。
[0033]实施例3
[0034]将深黄被孢霉接种到YPD固体培养基上，在22°C _32°C培养箱中培养168_240h，丝状真菌形成孢子。
[0035]利用无菌水涤丝状真菌孢子，将得到的孢子悬浮液经过显微镜计数后，分装到灭菌后的小管中，存于2-6°C，待用。
[0036]将制备后的孢子悬浮液接种到豆制品废水第一次处理的上清中，接种孢子浓度为7.23X10S/L。培养条件是:pH 5.5，温度30°C，搅拌转速200rpm，经过72h培养后，丝状真菌形成菌丝球。葡萄糖含量对黑曲霉在察氏培养基中生长情况见图5。随着葡萄糖含量的升高，生物量和残余普通糖增加。葡萄糖含量为0.lg/L时，pH没有下降。葡萄糖含量由0.1g/L增加到5.0g/L时，pH下降幅度逐渐加大。葡萄糖含量高于5.0g/L后，最终pH保持恒定(3.70左右)。图5是黑曲霉在不同葡萄糖浓度时形成的菌丝球。图6表明黑曲霉可以在Og/L?30g/L葡萄糖浓度内形成菌丝球，培养液也保持澄清。
【主权项】
1.一种控制曲霉属丝状真菌形成菌丝球的方法，其特征在于，包括以下步骤: 第一步、孢子的培养 将曲霉属丝状真菌接种到固体培养基上，在22°c -32°c培养箱中培养48-240h，曲霉属丝状真菌形成孢子； 第二步、孢子悬浮液的制备 利用无菌水或者磷酸缓冲液洗涤孢子，得到孢子悬浮液，分装到灭菌后的小管中，在2-6 °C下保存待用； 第三步、控制曲霉属丝状真菌形成菌丝球 将孢子悬浮液接种到察氏培养基中，接种孢子浓度为7.23X 105/L?8.68X 18/L ;然后，置于旋转式摇床中培养，培养条件为:pH 3.0?8.0，温度22-35°C，摇床转速100-200rpm ;在察氏培养基中培养48h后，曲霉属丝状真菌形成菌丝球。2.根据权利要求1所述的控制曲霉属丝状真菌形成菌丝球的方法，其特征在于，所述曲霉属丝状真菌包括黑曲霉、米曲霉或构巢曲霉。3.根据权利要求1所述的控制曲霉属丝状真菌形成菌丝球的方法，其特征在于，所述固体培养基包括PDA琼脂培养基、含2%琼脂的察氏培养基或YPD固体培养基。4.根据权利要求1所述的控制曲霉属丝状真菌形成菌丝球的方法，其特征在于，第三步在察氏培养基中的培养时间为48-168h。5.根据权利要求1所述的控制曲霉属丝状真菌形成菌丝球的方法，其特征在于，所述察氏培养基的制作方法如下:取 glucose 25.0g、NaNO3 3.0g、K2HPO4 1.0g, KCl 0.5g、MgSO4.7Η20 0.5g 和 FeSO4.7Η20 0.0lg，加去离子水至 IL ;再用 lmol/L HCl 和 lmol/L NaOH调节pH为5.5。
【专利摘要】本发明公开了一种控制曲霉属丝状真菌形成菌丝球的方法。该方法包括孢子的培养、孢子悬浮液的制备和控制曲霉属丝状真菌形成菌丝球等步骤。丝状真菌以菌丝球方式存在有易于传质、发酵液粘度低、产物产量高等优点，而且菌丝球易于收获其它单细胞微生物。本发明中控制条件包括孢子浓度、pH、培养基中糖浓度三个方面。本发明可以有效控制菌丝球的形成条件，为丝状真菌菌丝球的广泛应用提供可靠方法。
【IPC分类】C12R1/685, C12R1/69, C12R1/66, C12N1/14
【公开号】CN105505781
【申请号】CN201410558748
【发明人】张建国, 沈建华, 黄勋娟, 傅尧娟, 李立, 袁辉
【申请人】上海理工大学, 上海清美绿色食品有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2014年10月20日