一种真菌菌丝总dna的提取方法
【专利摘要】本发明属于真菌的分子生物学研究领域，具体涉及一种真菌菌丝总DNA的提取方法，具有免液氮研磨又能较为彻底打破细胞壁提取真菌菌丝总DNA的优点，其步骤如下：（1）收集真菌菌丝体；（2）置于DNA提取液中，捣碎；（3）在-80℃的低温环境与65℃水浴环境中反复冻融2～3次；（4）加入蛋白酶K和溶菌酶处理；（5）去酶及纯化DNA。该处理方法简单，所需试剂常见；采用反复冻融、捣碎的方式使样品可免于使用液氮研磨，便于不易获得液氮的地方使用；未使用研钵防止了交叉污染；也避免使用苯酚、β-巯基乙醇等有毒试剂；整个提取过程温和，提取真菌菌丝总DNA质量高，可进行ITS序列PCR扩增及测序等后续分子生物学研究。
【专利说明】一种真菌菌丝总DNA的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于真菌的分子生物学研究领域，具体涉及一种真菌菌丝总DNA的提取方法。
【背景技术】
[0002]在真菌的分子生物学研究中，真菌总DNA的提取至关重要。目前常用的提取方法主要有CTAB法、SDS提取法、尿素提取法及酶解法等。提取的步骤大体相似，关键在于如何有效地破碎细胞壁，有的是通过机械来进行破碎细胞壁，有的是通过酶等物质来消化去壁。由于真菌细胞壁上富含多糖等物质，因此即使是液氮冷冻干燥研磨后也很难被普通抽提液打破，而直接用酶去消化又常常得不到好的去壁效果。事实上，目前大部分实验室所采用的破壁方法均是液氮冷冻干燥研磨，但是使用液氮研磨容易冻伤皮肤，需要强力研磨，费时费力，受研钵数量的限制容易产生交叉污染，在研磨过程中真菌菌丝也容易损失，效率也不高，特别是一些单位和机构由于液氮及干冰不易获取而使其受到严重限制。因此急需一种免液氮研磨而又能较为彻底打破细胞壁的真菌提取技术。
【发明内容】
[0003]本发明所解决的技术问题是提供一种免液氮研磨而又能较为彻底打破细胞壁提取真菌菌丝总DNA的技术。
[0004]本发明提供的真菌菌丝总DNA的提取方法的技术方案如下:
[0005](I)收集真菌菌丝体；
[0006](2)真菌菌丝体置于DNA提取液中，捣碎真菌菌丝`体；
[0007](3)在_70°C至-85°C的低温环境与60_65°C水浴环境中反复冻融2~3次；
[0008](4)加入蛋白酶K和溶菌酶处理；
[0009](5)去酶及纯化DNA。
[0010]其中，步骤(2)所述DNA提取液的各组分浓度为:80-120mmol/L Tris-HCl,80-120mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)，80-120mmol/L 磷酸钠，1.0-1.5mol/L 氯化钠，质量百分比为0.8-1% (g/g)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，pH值=7.8-8.2，溶剂为无菌蒸馏水，溶剂优选灭菌双蒸水。采用本发明DNA提取液具有毒性低、刺激性小及生物降解性高的优点。DNA提取液的添加量为:每Ig真菌菌丝体添加DNA提取液1-1.6ml，优选1.5ml。
[0011]进一步优选，步骤(2)所述DNA提取液的各组分浓度为:100mmol/L Tris-HCl,100mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA), 100mmol/L磷酸钠，1.5mol/L氯化钠,质量百分比为l%(g/g)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，pH值=8.0，溶剂为无菌蒸馏水；溶剂优选灭菌双蒸水。
[0012]其中，步骤(3)所述的具体条件是:在-70至_85°C的低温环境放置5_10min，再在60-65°C水浴环境中放置15-20min，如此反复冻融2~3次。
[0013]进一步优选，步骤(3)所述的具体条件是:在_80°C的低温环境放置5-10min，再在65°C水浴环境中放置20min，如此反复冻融2~3次。[0014]其中，步骤(4)所述蛋白酶K和溶菌酶的添加量为:
[0015]按Ig菌丝量计算，加入蛋白酶K(8-12mg/mL)40_60 μ L,溶菌酶(80_120mg/ml) 40-60 μ L，涡旋混匀后，于37°C的环境，在150_200r/min的条件下振荡15_30min。
[0016]进一步优选，按Ig菌丝量计算，加入蛋白酶K(10mg/mL) 50 μ L,溶菌酶(lOOmg/πι1)50μ L，涡旋混匀后，于37°C的环境，在200r/min的条件下振荡30min。
[0017]本发明采用的蛋白酶K能使膜蛋白降解，使与DNA结合的蛋白质降解，使DNA充分游离；溶菌酶能有效地菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β_1，4糖苷键进而破碎细胞壁，释放DNA。具有操作简便，避免使用液氮研磨而带来的劳动强度和交叉污染的优点。
[0018]其中，步骤(5)去酶及纯化DNA具体包含下述步骤:
[0019]Α、加入20% (g/g)十二烷基硫酸钠(SDS)溶液180-230 μ L，涡旋混匀后水浴，水浴条件:58-63°C、l.5-2.0h，期间每 10_30min 振荡 I 次；
[0020]B、室温条件下,5000-6000r/min离心10_15min,取上清液至离心管中待用，于上清液中加入0.4-0.6倍体积50% (g/g)聚乙二醇溶液，在4°C环境下放置过夜；所述聚乙二醇的相对分子质量为4000 - 6000 ；
[0021]C、室温条件下，6000-7000r/min、3-5°C离心25_35min,弃上清液,并于沉淀中加入TE溶液500 μ L，氯仿-异戊醇溶液(氯仿、异戊醇体积比为24:1) 450-550 μ L，涡旋混匀，11000-12000r/min、3-5°C离心4_6min，取上清液至离心管中；所述TE溶液各组分的浓度为:10mmol/L Tris-HCl, lmmol/L EDTA, pH=7.5_8.5,溶剂为无菌蒸懼水,优选为灭菌双蒸水；
[0022]D、于步骤C所得上清液中加入0.8-1.5倍体积的3mol/LNaAc溶液及0.5-0.6倍体积的异丙醇溶液，沉淀至少2-2.5h，11000-12000r/min、3-5°C离心4_6min，弃掉上清液；
[0023]E、于步骤D所得沉淀中加入预冷的70%(v/V)乙醇500-600 μ L洗漆沉淀，11000-12000r/min、3-5°C离心 4_6min,弃掉上清液；
[0024]F、沉淀低温真空干燥，即得真菌菌丝体DNA。
[0025]步骤(5)去酶及纯化DNA的优选条件为:
[0026]A、加入20% (g/g)十二烷基硫酸钠(SDS)溶液200 μ L，涡旋混匀后水浴，水浴条件:60°C、1.5h，期间每30min振荡I次；
[0027]B、室温条件下，5000r/min离心lOmin，取上清液至离心管中待用，于上清液中加Λ 0.5倍体积50% (g/g)聚乙二醇(PEG，相对分子质量在4000 — 6000)溶液，在4°C环境下放置过夜；
[0028]C、室温条件下，6000r/min、4 V离心30min，弃上清液，并于沉淀中加入TE溶液500yL，氯仿-异戊醇溶液(氯仿、异戊醇体积比为24:1)溶液500yL，涡旋混匀，12000r/min、4°C离心5min，取上清液至离心管中；所述TE溶液各组分的浓度为:10mmol/LTris-HCl，lmmol/L EDTA, pH=8.0，溶剂为无菌蒸馏水，溶剂优选灭菌双蒸水；
[0029]D、于步骤C所得上清液中加入0.1倍体积的3mol/L NaAc溶液及0.6倍体积的异丙醇溶液，沉淀至少2h, 12000r/min、4°C离心5min,`弃掉上清液；
[0030]E、于步骤D所得沉淀中加入预冷的70%乙醇500 μ L洗涤沉淀，12000r/min4°C离心5min,弃掉上清液；
[0031]F、沉淀低温真空干燥，即得真菌菌丝体DNA。[0032]所得DNA的保存方式:加入50~100 μ L灭菌双蒸水溶解沉淀，放入_20°C保存备用。
[0033]本发明的有益效果为:
[0034](I)免除了液氮研磨等费力和复杂的程序，便于不易获得液氮的地方使用；
[0035](2)避免了研钵的使用，防止交叉污染；
[0036](3)避免了以往方法中苯酚、巯基乙醇等有毒试剂的使用；
[0037](4 )提取过程温和，提取的DNA质量好；
[0038](5)经济高效，所用药品和设备均是普通实验室所常见的。
[0039]本发明处理方法简单，所需试剂常见，由于采用了反复冻融、捣碎的处理方法，使样品可免于使用液氮研磨，便于不易获得液氮的地方使用，同时避免了研钵的使用，防止交叉污染，也避免了很多方法中苯酚、β-巯基乙醇等有毒试剂的使用，整个提取过程温和，提取真菌菌丝总DNA效果好，质量高，可进行ITS序列PCR扩增及测序等后续分子生物学研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1为利 用本发明方法分别提取的不同真菌基因组DNA电泳图；
[0041]M 代表 λ /HindIII DNA Marker (从上到下 DNA 依次为:23130bp, 9416bp, 6557bp,4361bp, 2322bp, 2027bp, 564bp, 125bp)，I和2为柱状田头菇基因组总DNA, 3和4朱红硫磺菌基因组总DNA，5和6木蹄层孔菌基因组总DNA。
[0042]图2为利用本发明方法分别提取的不同真菌基因组DNA的PCR扩增真菌ITS序列的电泳图；
[0043]M 代表 D2000Marker (从下到下 DNA 依次为:2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp,IOObp)，I和2为以柱状田头菇基因组DNA为模板扩增的PCR产物，3和4为以朱红硫磺菌基因组DNA为模板扩增的PCR产物，5和6为以木蹄层孔菌基因组DNA为模板扩增的PCR产物。
【具体实施方式】
[0044]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，说明但不限制本发明。
[0045]实施例一
[0046](I)取3个2mL的灭菌离心管，分别加入DNA提取液1.3ml ；
[0047](2)分别挑取约 1.0g 的木蹄层孔菌(Fomes fomentarius (L.) J.J.Kickx)、朱红硫石黄菌(Laetiporus sulphureus var.miniatus (Jungh.) Imazeki)及柱状田头? (Agrocybecylindracea(DC.:Fr.) R.Maire)菌丝,放入离心管中，进行如下操作:
[0048](3)利用灭菌的接种棒将菌丝尽量捣碎，涡旋，混匀；
[0049](4)将样品置于-80°C冰箱中5~lOmin，取出放入65°C水浴锅20min，水浴过程中每5min取出涡旋混匀I次,重复该步反复冻融2~3次；
[0050](5)加入蛋白酶K(10mg/mL) 50 μ L,溶菌酶(100mg/ml) 50 μ L,润旋混匀后放入37°C、200r/min 的摇床振荡 30min ；[0051 ] (6 )加入20%SDS溶液200 μ L，涡旋混匀，放入60 V水浴锅中水浴1.5h，期间每30min振荡I次；
[0052](7)室温条件下，5000r/min离心lOmin，取上清液至2mL干净的离心管中待用，于上清液中加入0.5倍体积的50%PEG (PEG的相对分子质量在4000 — 6000)溶液，放入4°C冰箱中过夜；
[0053](8) 6000r/min、4°C离心30min,倒掉上清液，并于沉淀中加入TE溶液500 μ L,氯仿-异戊醇溶液(氯仿、异戊醇体积比为24:1) 500 μ L，涡旋混匀，12000r/min、4°C离心5min,取上清液至新的离心管中；
[0054](9)于上清液中加入0.1倍体积的3mol/LNaAc溶液及0.6倍体积的异丙醇溶液，沉淀至少2h, 12000r/min、4°C离心5min,弃掉上清液；
[0055](10)于沉淀中加入预冷的70%乙醇500 μ L洗漆沉淀，12000r/min、4°C离心5min,
弃掉上清液；
[0056](11)低温真空干燥，加入50~ΙΟΟμ L灭菌双蒸水溶解沉淀，即得。
[0057]为了验证上述方法所提真菌基因组DNA是否适用于分子生物学后续研究，继续实施以下步骤以予验证:
[0058](I)取DNA样品各5 μ L加上样缓冲液(0.25%溴酚蓝，40%蔗糖)2 μ L进行混合，然后经1.2%的琼脂糖凝胶电泳15min, GelStain(1000X)染色,于凝胶成像仪下检测并拍照记录；
[0059](2)以总 DNA 为模板，采用引物 ITS4(5’ - TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ )及ITS5(5’ -GGA AGT A AA AGT CGT AAC AAG G-3’ )扩增其 ITS 序列。反应体系(50 μ L):
2XPCR Mix (天根，北京)25 μ L ;正向引物 ITS4 (20pmol L-1) 0.5 μ L ;反向引物 ITS5 (20pmolL-1)。.5 μ L ;模板DNA(50ng mL—1) 2.0 μ L ;双蒸水补足至50 μ L ;矿物油覆盖。PCR反应条件:94°C预变性5min ;94°C变性30s ;55°C退火45s; 72°C延伸Imin ；40个循环；72°C最终延伸7min，4°C 保存；
[0060](3)扩增产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，并进行测序分析。
[0061]结果显示,所提取的3种真菌基因组DNA条带清晰，大小约2300bp,拖尾现像不严重，见图1。利用真菌通用引物ITS4和ITS5扩增得到的PCR产物条带也较为清晰，大小约在750bp，见图2。经测序，发现3个真菌的序列波峰图谱均没有杂合、双峰，经基因库比对3种真菌分别为柱状田头燕(Agrocybe cylindracea(DC.:Fr.)R.Maire)、朱红硫石黄菌(Laetiporus sulphureus var.miniatus (Jungh.) Imazeki)及木蹄层孔菌(Fomesfomentarius (L.) J.J.Kickx)。
[0062]DNA样品含量测定
[0063]用紫外分光光度计测定波长260nm和280nm处的光吸收值，检测如实施例1所述方法提取的DNA样品纯度，结果如表1。
[0064]表1
【权利要求】
1.真菌菌丝总DNA的提取方法，其特征在于:包括如下步骤: (O收集真菌菌丝体； (2)真菌菌丝体置于DNA提取液中，捣碎真菌菌丝体； (3)在-70°C至-85°C的低温环境与60-65°C水浴环境中反复冻融2~3次； (4)加入蛋白酶K和溶菌酶处理； (5)去酶及纯化DNA。
2.根据权利要求1所述的真菌菌丝总DNA的提取方法，其特征在于:步骤(2)所述DNA提取液各组分浓度为:80-120mmol/LTris-HCl，80-120mmol/L 乙二胺四乙酸，80-120mmol/L磷酸钠，1.0-1.5mol/L氯化钠，0.8-1%(g/g)十六烷基三甲基溴化铵，pH值=7.8-8.2，溶剂为无菌蒸馏水；优选溶剂为灭菌双蒸水。
3.根据权利要求2所述的真菌菌丝总DNA的提取方法，其特征在于:步骤(2)DNA提取液的各组分浓度为:100mmol/LTris-HCl, 100mmol/L乙二胺四乙酸,100mmol/L磷酸钠，1.5mol/L氯化钠，l%(g/g)十六烷基三甲基溴化铵，pH值=8.0，溶剂为无菌蒸馏水；优选溶剂为灭菌双蒸水。
4.根据权利要求1-3任一项所述的真菌菌丝总DNA的提取方法，其特征在于:步骤(2)DNA提取液的添加量为:每Ig真菌菌丝体添加DNA提取液1-1.6ml，优选1.5ml。
5.根据权利要求1所述的真菌菌丝总DNA的提取方法，其特征在于:步骤(3)所述的具体条件是:在_70°C至_8`5°C的低温环境放置5-10min，再在60_65°C水浴环境中放置15-20min，如此反复冻融2~3次。
6.根据权利要求5所述的真菌菌丝总DNA的提取方法，其特征在于:步骤(3)所述的具体条件是:在_80°C的低温环境放置5-10min，再在65°C水浴环境中放置20min，如此反复冻融2~3次。
7.根据权利要求1所述的真菌菌丝总DNA的提取方法，其特征在于:步骤(4)所述蛋白酶K和溶菌酶的添加量为: 按Ig菌丝量计算，加入8-12mg/mL蛋白酶K40-60 μ L, 80-120mg/ml溶菌酶40-60 μ L,涡旋混匀后，于37°C的环境，在150-200r/min的条件下振荡15_30min。
8.根据权利要求7所述的真菌菌丝总DNA的提取方法，其特征在于:步骤(4)所述蛋白酶K和溶菌酶的添加量为: 按Ig菌丝量计算，加入10mg/mL蛋白酶K50 μ L，100mg/ml溶菌酶50 μ L，涡旋混匀后，于37°C的环境,在200r/min的条件下振荡30min。
9.根据权利要求1所述的真菌菌丝总DNA的提取方法，其特征在于:步骤(5)去酶及纯化DNA包括如下步骤: A、加入20%(g/g)十二烷基硫酸钠溶液180-230 μ L，涡旋混匀后水浴，水浴条件:58-63。。、1.5-2.0h，期间每 10_30min 振荡 I 次； B、室温条件下，5000-6000r/min离心10_15min，取上清液至离心管中待用，于上清液中加入0.4-0.6倍体积50%(g/g)聚乙二醇溶液，在4°C环境下放置过夜；所述聚乙二醇的相对分子质量为4000 — 6000 ； C、室温条件下，6000-7000r/min、3-5°C离心25_35min，弃上清液，并于沉淀中加入TE溶液500 μ L，氯仿-异戊醇体积比为24:1的溶液450-550 μ L，涡旋混匀，11000-12000r/11^11，3-51:离心4-61^11，取上清液至离心管中；所述TE溶液各组分的浓度为:10mmol/LTris-HCl, lmmol/L EDTA, pH=7.5-8.5,溶剂为无菌蒸懼水,优选为灭菌双蒸水； D、于步骤C所得上清液中加入0.8-1.5倍体积的3mol/LNaAc溶液及0.5-0.6倍体积的异丙醇溶液，沉淀至少2-2.5h，11000-12000r/min，3-5°C离心4_6min，弃掉上清液； E、于步骤D所得沉淀中加入预冷的70%(v/v)乙醇500-600μ L洗漆沉淀，11000-12000r/min, 3_5°C离心 4_6min,弃掉上清液； F、沉淀低温真空干燥，即得真菌菌丝体DNA。
10.根据权利要求9所述的真菌菌丝总DNA的提取方法，其特征在于:步骤(5)去酶及纯化DNA包括如下步骤: A、加入20%(g/g)十二烷基硫酸钠溶液200μ L，涡旋混匀后水浴，水浴条件:60°C、，1.5h,期间每30min振荡I次； B、室温条件下，5000r/min离心IOmin,取上清液至离心管中待用，于上清液中加入0.5倍体积50%(g/g)聚乙二醇溶液，在4°C环境下放置过夜； C、室温条件下，6000r/min、4°C离心30min,弃上清液,并于沉淀中加入TE溶液500μ L,氯仿-异戊醇体积比为24:1的溶液500 μ L，涡旋混匀，12000r/min、4°C离心5min，取上清液至离心管中；所述TE溶液各组分的浓度为:10mmol/L Tris-HCl, lmmol/L EDTA,pH=8.0,溶剂为无菌蒸馏水；优选为灭菌双蒸水； D、于步骤C所得上清液中加入0.1倍体积的3mol/LNaAc溶液及0.6倍体积的异丙醇溶液，沉淀至少2h, 12000r/min、4°C离心5min,弃掉上清液； E、于步骤D所得沉淀中加入 预冷的70%乙醇500μ L洗涤沉淀，12000r/min、4°C离心5min,弃掉上清液； F、沉淀低温真空干燥，即得真菌菌丝体DNA。
【文档编号】C12N15/10GK103820434SQ201410102771
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月19日 优先权日:2014年3月19日
【发明者】李小林, 郑林用, 李昕竺, 曾先富, 黄羽佳 申请人:四川省农业科学院土壤肥料研究所, 成都市农林科学院, 四川省技术创新促进会