丹参内生真菌菌丝水溶性提取物及其部位的制备和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种丹参内生真菌菌丝水溶性提取物（WSE），它是收集发酵培养9-14天的丹参内生真菌菌丝体，加入蒸馏水重悬，110-130℃灭菌30-60min，冷却，减压抽滤后得到的滤液。本发明还公开了丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖蛋白部位(PPF)和丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖部位(PSF)。本发明进一步公开了SWE、PPF和PSF在促进宿主丹参的组织培养物丹参毛状根生长，提高丹参毛状根中丹参酮类成分含量的用途。
【专利说明】丹参内生真菌菌丝水溶性提取物及其部位的制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种丹参内生真菌菌丝的水溶性提取物及其多糖蛋白部位和多糖部位，此外，本发明还涉及该丹参内生真菌菌丝水溶性提取物及其多糖蛋白部位和多糖部位的用途，用于促进丹参毛状根生长和提高丹参酮类成分含量。
【背景技术】
[0002]丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)是唇形科鼠尾草属植物,其干燥根及根莖同名入药，始载于《神农本草经》，列为上品，是我国常用传统中药，味苦，性微寒，归心、肝经，具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦等功效。临床广泛用于心脑血管疾患，是国内外现代化中药研究的热点品种之一。现代研究表明，丹参的化学成分主要分为两大类:一是以丹参素为基本结构的水溶性成分——酹酸类化合物，包括原儿茶醛、丹参素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸等；二是脂溶性成份一二萜类化合物，包括丹参酮1、丹参酮II A、II B、隐丹参酮1、二氢丹参酮I等。临床研究证实，丹参含有的多种化学成分具有广泛的生物活性，其传统药理以扩血管，活血化瘀，改善微循环为主。现代药理研究表明，丹参尚具有抗肿瘤，抗菌消炎，抗雄性激素，抑制皮脂腺增生，抗肝硬化，抗纤维化，促进组织修复和再生等多种药理活性。丹参的市场需求大，而野生资源日益减少，栽培品种退化严重。人工引种栽培存在引种困难和栽培环境制约等客观因素的影响，活性次生代谢成分的含量不稳定，药材质量得不到保证。
[0003]利用生物技术手段获得丹参有效化学成分相继成为研究热点，丹参毛状根培养技术就是其中之一。它利用发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes侵染宿主受伤部位细胞并产生大量转化不定根， 又称毛状根。与传统的细胞培养技术相比，毛状根具有生长迅速、遗传性状稳定及激素自养型等特点。目前丹参毛状根培养技术已相当成熟，但有效成分含量较低大大制约了毛状根的应用。采用生物与非生物诱导子进行刺激，能够有效地促进丹参毛状根的生长和提高丹参毛状根中次生代谢产物的含量。
【发明内容】
[0004]根据本发明的实施例，希望利用植物内生真菌资源，采用生物与非生物诱导子进行刺激，能够有效地促进丹参毛状根的生长和提高丹参毛状根中次生代谢产物的含量，并提供一种丹参内生真菌菌丝水溶性提取物(WSE)、丹参内生真菌菌丝多糖蛋白部位(PPF)和丹参内生真菌菌丝多糖部位(PSF)，进而提供丹参内生真菌菌丝水溶性提取物(WSE)、丹参内生真菌菌丝多糖蛋白部位(PPF)、丹参内生真菌菌丝多糖部位(PSF)在丹参毛状根中提高丹参酮类成分含量的应用，为新型诱导子的开发和探讨内生真菌与宿主之间的相互关系提供依据。
[0005]本发明涉及的丹参内生真菌和中国专利CN102676392A公开的丹参内生真菌相同，它的命名为深绿木霉Trichoderma atroviride,菌株代号为D16,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏登记号为CGMCC N0.4712。[0006]1.丹参内生真菌菌丝水溶性提取物(WSE)的制备。
[0007]收集发酵培养9-14天的丹参内生真菌菌丝体，加入适量蒸馏水重悬，高压锅110-130°C灭菌30-60min。待自然冷却，减压抽滤后得到的滤液，即为丹参内生真菌水溶性提取物。采用硫酸-苯酚法测定总糖浓度。
[0008]2.丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖蛋白部位(PPF)的制备。
[0009]减压浓缩丹参内生真菌水溶性提取物WSE至适当体积，加入4-7倍体积70-95%的乙醇2-8°C静置24-72小时，以2000-10000转/分的转速离心分离10-15分钟得白色沉淀，无水乙醇洗3-5次后收集沉淀，真空冷冻干燥所得白色粉末即为丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖蛋白部位PPF。
[0010]3.丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖部位(PSF)的制备。
[0011]将丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖蛋白部位PPF重新溶于适量蒸馏水中，采用Sevag法除去蛋白，加入4-7倍体积的70-95%的乙醇2_8 °C静置24-72小时，以2000-10000转/分的转速离心分离10-15分钟得白色沉淀，无水乙醇洗3_5次后收集沉淀。将沉淀用适量蒸馏水溶解，室温在蒸馏水中透析24-72h (截留分子量为1000-10000Da)，然后以2000-10000转/分的转速离心分离得到上清液，真空冷冻干燥所得白色粉末即为丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖部位PSF。
[0012]4.丹参毛状根悬浮培养特征。
[0013]培养基:1/2B5培养基(NaH2PO4.H2O:75mg/L, CaCl2:56.62mg/L, KNO3:1250mg/L,(NH4)2SO4:67mg/L, MgSO4:61.05mg/L，乙二胺四乙酸二钠:18.65mg/L，FeSO4.7H20:13.9mg/L, MnSO4.2H20:5.0mg/L, ZnSO4.7H20:1.0mg/L,硼酸:1.5mg/L, Na2MoSO4:0.125mg/L,CuSO4.5H20:0.0125mg/L, CoCl2.5H20:0.0125mg/L, K1:0.375mg/L,维生素 B1:5.0mg/L,维生素 B5:0.5mg/L，烟酸:0.5mg/L，肌醇:50mg/L，蔗糖:20000mg/L, PH (25。。):5.5)，121。。灭菌15分钟后自然冷却待用。
[0014]培养温度:25±2°C。
[0015]培养时间:20-50天不等。
[0016]摇床转速:180rpm。
[0017]培养特征:丹参毛状根聚成团向四周生长。
[0018]5.丹参内生真菌菌丝水溶性提取物(WSE)对丹参毛状根生长和丹参酮生物合成的影响。
[0019]在丹参毛状根悬浮培养第16-24天，添加总糖浓度为30_400mg/L的丹参内生真菌菌丝水溶性提取物WSE，继续悬浮培养12-30天，毛状根生物量提高了 30%-80%，二氢丹参酮I的含量提高了 15-40倍，丹参酮I的含量提高了 1-3倍，隐丹参酮的含量提高了 50-90倍，丹参酮II A的含量提高了 2-5倍，总丹参酮的含量(即二氢丹参酮1、丹参酮1、隐丹参酮和丹参酮II A含量之和)提高了 10-25倍。丹参内生真菌菌丝水溶性提取物菌丝WSE能够有效地提高丹参毛状根的生物量，促进丹参酮类成分的生物合成。
[0020]6.丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖蛋白部位(PPF)和多糖部位(PSF)对丹参毛状根生长和丹参酮生物合成的影响。
[0021]在丹参毛状根悬浮培养第16-24天，添加浓度为30_400mg/L丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖蛋白部位(PPF)或丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖部位(PSF)，继续悬浮培养12-30天，毛状根干重都提高了 10%-70%，二氢丹参酮I的含量都提高了 10-40倍，丹参酮I的含量都提高了 1-8倍，隐丹参酮的含量都提高了 20-50倍，丹参酮II A的含量都提高了 5-15倍，总丹参酮的含量(即二氢丹参酮1、丹参酮1、隐丹参酮和丹参酮II A含量之和)都提高了 10-25倍。PPF和PSF均能够有效地提高丹参毛状根的生物量，促进丹参酮类成分的生物合成。
[0022]本发明首次从丹参内生真菌菌丝中制备了水溶性提取物(WSE)、多糖蛋白部位(PPF)和多糖部位(PSF)，发现WSE、PPF和PSF均能有效促进丹参毛状根生长，同时显著性地提高毛状根中丹参酮类成分的含量，从而有效提高了丹参毛状根中丹参酮类成分的产量。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1是丹参内生真菌在1/2B5平板培养基上的形态图。
[0024]图2是丹参内生真菌在1/2B5液体培养基中的形态图。
[0025]图3是丹参毛状根液体悬浮培养形态图。
[0026]图4是丹参内生真菌菌丝水溶性提取物及其多糖蛋白部位和多糖部位作用丹参毛状根12天的形态图(A为对照，B为菌丝水溶性提取物处理，C为多糖蛋白部位处理，D为多糖部位处理)。
【具体实施方式】 [0027]下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。
[0028]实施例1:内生深绿木霉菌D16的发酵
[0029]将丹参内生真菌D16接种至1/2B5固体培养基上室温培养3_5天(见图1);然后采用打孔器打孔的方式将固体培养基上的D16菌丝接种至250ml三角瓶(内含100ml 1/2B5培养液)中，26°C、180rpm培养3_5天即得培养种子液(见图2);最后将培养种子液接种至5L三角瓶(内含4L 1/2B5培养液)中，26°C、160rpm培养10天。
[0030]实施例2:丹参内生真菌菌丝水溶性提取物(WSE)的制备
[0031]通过减压抽滤收集培养10天的D16菌丝体，并用蒸馏水洗涤3次；然后加入适量蒸馏水将D16菌丝体重悬，121°C高温高压处理40分钟。待自然冷却，减压抽滤所得滤液适当浓缩即为内生深绿木霉菌D16菌丝WSE。
[0032]采用硫酸-苯酚法测定内生深绿木霉菌D16菌丝WSE中总糖浓度。以葡萄糖绘制标准曲线，获得线性回归方程:y=0.0136Χ - 0.0151，相关系数R2=0.9989，葡萄糖浓度范围10_50ug/ml。[0033]实施例3:丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖蛋白部位(PPF)的制备
[0034]减压浓缩内生深绿木霉菌D16菌丝WSE溶液(30L)至适当体积，加入5倍体积95%的乙醇4°C静置48小时，以5000转/分的转速离心分离10分钟得白色沉淀，无水乙醇洗3次后收集沉淀，真空冷冻干燥所得白色粉末即为内生深绿木霉菌D16菌丝PPF。
[0035]实施例4:丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖部位(PSF)的制备[0036]将内生深绿木霉菌D16菌丝PPF重新溶于适量蒸馏水中，采用Sevag法除去蛋白，加入5倍体积的95%的乙醇4°C静置48小时，以5000转/分的转速离心分离10分钟得白色沉淀，无水乙醇洗3次后收集沉淀。将沉淀用适量蒸馏水溶解，室温在蒸馏水中透析48小时(截留分子量为2000Da)，然后通过5000转/分的转速离心分离得到上清液，真空冷冻干燥所得白色粉末即为内生深绿木霉菌D16菌丝PSF。
[0037]实施例5:丹参毛状根悬浮培养特征
[0038]本发明采用的是摇床培养，250ml体积的三角瓶中盛1/2B5培养液100ml，将预先液体培养好的丹参毛状根接种至已灭菌的培养基中，每瓶接种lg，在25°C、180rpm下暗培养20天-50天不等，每周更换一次培养液(见图3)。丹参毛状根收获时，倒掉培养液，蒸馏水洗3次后滤纸吸干残留水分。50°C烘干至恒重后，按实施例6中描述方法测定丹参酮类成分的含量。
[0039]实施例6:丹参毛状根中丹参酮类成分含量的测定
[0040]采用高效液相色谱法(HPLC)分析丹参毛状根中丹参酮类成分的含量，主要定量检测二氢丹参酮1、丹参酮1、隐丹参酮和丹参酮II A的含量。具体步骤如下:
[0041]丹参毛状根HPLC进样样品的制备:精密称量烘干至恒重的毛状根，记录干重后研成粉末。精密称取毛状根粉末0.15g，加入5ml甲醇超声提取3次，每次40分钟。所得提取溶液过0.45um微孔滤膜即得HPLC进样样品溶液。
[0042]HPLC色谱分析条件:色谱柱:Z0RBAX-C18反相柱(4.6X 250mmX 5 μ m);流动相:Η20(+0.5%HC00H)-HCN，梯度洗脱:[time(min): D(HCN)] = [0.0: 20% ]-[20.0: 40%]-[21.0: 80%]-[40.0: 90%]-[45.0: 20%];柱温:30°C;流速:0.8ml/min ;检测波长280nm。
[0043]标准曲线的确定 :(1)准确称取二氢丹参酮I 2mg溶于IOml甲醇中，精密稀释得到浓度为2.5、5、10、20、40ng/ml的二氢丹参酮I标准品HPLC进样溶液。(2)准确称取丹参酮I Img溶于IOml甲醇中，精密稀释得到浓度为2、4、6、8、10ng/ml的丹参酮I标准品HPLC进样溶液。(3)准确称取隐丹参酮Img溶于IOml甲醇中，精密稀释得到浓度为1、5、25、50、100ng/ml的隐丹参酮标准品HPLC进样溶液。(4)准确称取丹参酮II A Img溶于IOml甲醇中，精密稀释得到浓度为0.5、1.0,2.0,4.0,8.0ng/ml的丹参酮II A标准品HPLC进样溶液。将所有标准品溶液按上述HPLC色谱条件进样分析。以HPLC的峰面积为Y，以进样标准品溶液浓度(mg/ml)为X，获得4种丹参酮线性回归方程(见表1)。
[0044]丹参毛状根样品中丹参酮的含量测定:取上述制备的样品溶液20ul进样，按上述H PLC色谱条件进行丹参酮类成分的分析，根据回归方程进行定量计算。
[0045]表1四种丹参酮的线性回归方程
【权利要求】
1.一种丹参内生真菌菌丝水溶性提取物，其特征是，它是收集发酵培养9-14天的丹参内生真菌菌丝体，加入蒸馏水重悬，110-130°C灭菌30-60min，冷却，减压抽滤后得到的滤液。
2.一种丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖蛋白部位，其特征是，减压浓缩权利要求1所述的丹参内生真菌菌丝水溶性提取物，加入4-7倍体积量体积浓度为70-95%的乙醇，在2-8°C静置24-72小时，以2000-10000转/分的转速离心分离10-15分钟得白色沉淀，用无水乙醇洗脱3-5次后收集沉淀，真空冷冻干燥所得白色粉末即为丹参内生真菌菌丝多糖水溶性提取物蛋白部位。
3.一种丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖部位，其特征是，将权利要求2所述的丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖蛋白部位溶于蒸馏水中，采用Sevag法除去蛋白，加入4-7倍体积量体积浓度为70-95%的乙醇，在2-8°C静置24-72小时，以2000-10000转/分的转速离心分离10-15分钟得白色沉淀，用无水乙醇洗脱3-5次后收集沉淀；将沉淀用蒸馏水溶解，室温下在蒸馏水中透析24-72h，截留分子量为1000-10000Da，以2000-10000转/分的转速离心分离得到上清液，真空冷冻干燥所得白色粉末即为丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖部位。
4.丹参内生真菌菌丝水溶性提取物用于促进丹参毛状根生长和/或提高丹参毛状根中丹参酮类成分含量。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征是，在丹参毛状根悬浮培养第16-24天，添加总糖浓度为30-400mg/L的丹参内生真菌菌丝水溶性提取物，继续悬浮培养12-30天。
6.丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖蛋白部位用于促进丹参毛状根生长和/或提高丹参毛状根中丹参酮类成分含量。
7.根据权利要求6所 述的用途，其特征是，在丹参毛状根悬浮培养第16-24天，添加总糖浓度为30-400mg/L的丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖蛋白部位，继续悬浮培养12-30 天。
8.丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖部位用于促进丹参毛状根生长和/或提高丹参毛状根中丹参酮类成分含量。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征是，在丹参毛状根悬浮培养第16-24天，添加总糖浓度为30-400mg/L的丹参内生真菌菌丝水溶性提取物多糖部位，继续悬浮培养12-30 天。
【文档编号】A01G7/06GK103798293SQ201210441649
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月7日 优先权日:2012年11月7日
【发明者】明乾良, 秦路平, 韩婷, 张巧艳, 郑承剑, 张宏, 贾敏 申请人:中国人民解放军第二军医大学