专利名称：一种控制黄孢原毛平革菌菌丝生长形态的方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及一种控制黄孢原毛平革菌菌丝生长形态的方法。
背景技术：
黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)是一类丝状担子菌白腐真菌，含有一套优秀的木质素分解系统。这套优秀的木质素分解系统由系列胞外过氧化物酶组成，典型的酶系如木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶。这些胞外过氧化物酶对底物的氧化具有高度非特异性的特点，可以降解多种有机物，包括天然高聚物、还原性化合物、氧化性化合物、有毒化合物等。因此黄孢原毛平革菌在许多生物科技领域中有着广泛的应用价值，如危险废弃物的处理、污染土地的生物修复、生物燃料的制备、生物制浆和生物漂白等。液态沉浸式发酵是培养丝状真菌和生产胞外酶最经济的一种生产方式。在菌丝球发酵生产过程中，丝状真菌的形态会直接影响发酵体系中物性参数、基质传递等，所以菌丝球的形态对发酵产品的生成，发酵过程的控制至关重要。丝状真菌——黄孢原毛平革菌发酵周期较长，随着发酵时间的增加，菌丝球形态和数量的变化及胞外代谢产物的积累，引起发酵过程中溶氧和传质速率降低，进而影响有用代谢产物的产率和活性。这严重制约了黄孢原毛平革菌的应用。近年来，黄孢原毛平革菌在印染废水处理方面已逐渐成为国内外研究的热点，其研究主要涉及黄孢原毛平革菌的产酶特性及菌丝球的吸附特性。菌丝球的吸附性能与其比表面积相关，因此黄孢原毛平革菌的发酵产率以及菌丝球的形态将直接影响其在处理工业印染废水中的应用效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种控制黄孢原毛平革菌菌丝生长形态的方法，该方法能高效便捷的控制黄孢原毛平革菌菌丝形态，获得球状菌丝团体，该菌丝团体在染料脱色方面具有较佳的应用效果。一种控制黄孢原毛平革菌菌丝生长形态的方法，添加无机纳米粒子至黄孢原毛平革菌液体培养基中进行发酵培养，获得球状黄孢原毛平革菌菌丝团体。上述方案中，所述球状黄孢原毛平革菌菌丝团体内部分布有所述无机纳米粒子。上述方案中，所述发酵培养的具体步骤为:将活化后的黄孢原毛平革菌菌种制备成孢子悬浮液，接种到添加有所述无机纳米粒子的液体培养基中，每升添加有无机纳米粒子的液体培养基中孢子接种量为2.0X IO6 3.0X IO6个，于3(T33°C下摇床培养，摇床转速140 150rpm，培养5 7天。
上述方案中，所述无机纳米粒子采用高温高压蒸汽灭菌，所述液体培养基中的组分采用过滤除菌，将所述无机纳米粒子在无菌条件下添加至所述液体培养基中与所述液体培养基中的组分混合。上述方案中，过滤除菌中所用过滤器为0.22微米的微滤膜。
上述方案中，所述液体培养基的组分包括:葡萄糖10g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.lg/L，藜芦醇0.lg/L，酒石酸铵0.2g/L，及痕量元素溶液70ml/L ；所述痕量元素溶液配方为:硫酸镁3g/L，硫酸锰0.5g/L，氯化钠1.0g/L，七水硫酸亚铁
0.lg/L，氯化钴0.lg/L，硫酸铜0.lg/L，七水硫酸锌0.lg/L，十二水硫酸铝钾10mg/L，硼酸10mg/L, 二水钥酸钠10mg/L,及氨三乙酸1.5g/L。上述方案中，所添加的无机纳米粒子为氧化物。上述方案中，所述氧 化物为A1203、SiO2、或TiO2。上述方案中，以IL所述液体培养基为基准，所述无机纳米粒子在所述液体培养基中的添加量为0.0l-1Ogo上述方案中，所述无机纳米粒子的粒径为10-1000nm。本发明所选用的黄孢原毛平革菌菌种来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC 14076。本发明的基本原理:黄孢原毛平革菌生长初期，通过纳米粒子与孢子和菌丝之间的相互作用来影响菌丝球的大小和数量；生长中后期，通过纳米粒子与菌丝球的相互作用，同时纳米粒子进入到菌丝球的内部使其形态和致密度发生变化。纳米粒子与孢子和菌丝球相互作用示意图见图1。本发明有益的效果在于:
(I)添加无机纳米粒子至液体培养基中，能有效的控制菌丝生长形态，同时由于纳米粒子进入菌丝球的内部，有利于将菌丝球内部更多的活性位点暴露出来，从而提高黄孢原毛平革菌发酵产率及其对染料的降解率，该方法成本低廉，简单易行，效果显著。(2)该方法培养获得的菌丝球比表面积大，能有效的提高黄孢原毛平革菌对染料的吸附率。
图1给出了纳米粒子与孢子和菌丝球相互作用示意图。图2给出了实施例1所获得的菌丝球扫描电镜图。图3给出了实施例1的发酵液的蛋白电泳图。图4给出了实施例1所获得的菌丝球与染料作用后的形态图。图5给出了实施例2所获得的菌丝球与染料作用后的形态图。图6给出了实施例3所获得的菌丝球与染料作用后的形态图。图中，1，4_纳米粒子，2-孢子，3-菌丝球，M-蛋白分子量标记，泳道1_对照，泳道2-添加了纳米粒子的发酵结果。
具体实施例方式以下结合附图和实施例进一步对本发明进行说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。实施例1:
一种控制黄孢原毛平革菌菌丝生长形态的方法，其包括如下步骤:
(O菌种活化:将黄孢原毛平革菌接种在平板培养基上进行活化培养，培养温度为37°C，待培养2 3天后转入室温下培养至菌丝铺满平板；
(2)添加无机纳米粒子:以IL液体培养基为基准，添加0.0lg的TiO2纳米粒子，该纳米粒子的粒径为10nm，以不添加该TiO2纳米粒子的培养基作为对比例；
(3)菌体的培养:将步骤(I)所得的活化后的菌种制备成孢子悬浮液，接种到步骤(2)所得到的添加有TiO2纳米粒子的液体培养基，每升添加有TiO2纳米粒子的液体培养基中孢子接种量为2.0X 106 3.0X IO6个，于30°C下摇床培养，摇床转速150rpm，培养5 7天，得到黄孢原毛平革菌菌丝球的发酵液。其中，步骤(I)中的平板培养基配方为:麦芽粉10g/L，葡萄糖10g/L，胰蛋白胨2g/L，酵母浸膏2g/L，天冬酰胺lg/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁lg/L，琼脂20g/L。步骤(2)中的液体培养基配方为:葡萄糖10g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙
0.lg/L,藜芦醇0.lg/L,酒石酸铵0.2g/L,及痕量元素溶液70ml/L ;该痕量元素溶液配方为:硫酸镁3g/L，硫酸锰0.5g/L，氯化钠1.0g/L，七水硫酸亚铁0.lg/L，氯化钴0.lg/L，硫酸铜0.lg/L，七水硫酸锌0.lg/L，十二水硫酸铝钾10mg/L，硼酸10mg/L，二水钥酸钠10mg/L,及氨三乙酸1.5g/L。其中步骤(2)的TiO2纳米粒子采用高温高压蒸汽灭菌，液体培养基中的组分采用过滤除菌，将无机纳米粒子与液体培养基中的组分在无菌条件下混合。过滤除菌中所用过滤器为0.22微米的微滤膜。采用这种灭菌方法可以有效的降低TiO2纳米粒子的团聚。对步骤(3)所得到的发酵液中的菌丝球做扫描电镜(SEM)测试，菌丝球的微观结构见图2。由图2可以看出，纳米粒子与菌丝互相作用，纳米粒子进入菌丝球的内部，使菌丝球的致密度降低，从而增大了菌丝球的比表面积，故菌丝球的吸附能力增强。同时，添加了纳米粒子的培养基，发酵结束后菌丝球的数量明显增多，结果如表I所示，进一步增加了菌丝球总的比表面积。表I添加纳米粒子后菌丝球数量和大小变化
_数量/个平均直径/mm
对照 240 3.259'
实施例 l|477 11.9651
同时，由于纳米粒子进入菌丝球的内部,使得菌丝球内部更多的活性位点暴露出来,有
利于胞外酶合成及分泌，提高其降解能力。因此，对步骤(3)所得到的发酵液进行SDS-PAGE
蛋白凝胶电泳实验，得到的蛋白电泳结果见图3。由图3可以看出，添加无机纳米粒子后发
酵产物的总蛋白量增加。为进一步验证其降解和吸附能力，将上述发酵液直接中加入结晶紫染料，震荡培养。如图4所示，加入结晶紫染料至发酵液后，发酵液中的黄孢原毛平革菌菌丝球会吸附染料，使得黄孢原毛平革菌菌丝球的外表面延伸有若干毛刺的球状形态清晰可见。每隔一定的时间取样，将样品离心后，取上清，在染料最大吸收波长下检测染料吸光值的变化，同时采用丙酮抽提法将菌体吸附的染料洗脱下来，分光光度计测定最大吸收波长下的吸收值。计算黄孢原毛平革菌对染料的脱色率和吸附率。结果显示，与对照相比，在6小时内，染料的脱色率从21%提高到59%，增加了约3倍；在I小时内染料的吸附率从15%提高到58%，增加了约4倍。实施例2:
本实施例的控制黄孢原毛平革菌菌 丝生长形态的方法与实施例1大致相同，不同之处在于:1)以1L液体培养基为基准，添加5g的SiO2纳米粒子，该纳米粒子的粒径为500nm ；
2)发酵培养的条件为:于32°C下摇床培养，摇床转速145rpm，培养5 7天。按照与实施例1相同的方法进行染料脱色率和吸附率的测试。如图5所示，加入结晶紫染料至发酵液后，使得本实施例中的黄孢原毛平革菌菌丝球的球状形态清晰可见。6小时内，染料的脱色率从21%提高到70%，增加了约3.5倍；在I小时内染料的吸附率从15%提高到70%，增加量约4.5倍。实施例3:
本实施例的控制黄孢原毛平革菌菌丝生长形态的方法与实施例1大致相同，不同之处在于:1)以1L液体培养基为基准，添加IOg的Al2O3纳米粒子，该纳米粒子的粒径为800nm ；
2)发酵培养的条件为:于33°C下摇床培养，摇床转速140rpm，培养5 7天。按照与实施例1相同的方法进行染料脱色率和吸附率的测试。如图6所示，加入结晶紫染料至发酵液后，使得本实施例中的黄孢原毛平革菌菌丝球的球状形态清晰可见。6小时内，染料的脱色率从21%提高到49%，增加了约2.3倍；在I小时内染料的吸附率从15%提高到48%，增加量约3.3倍。由实施例1至实施例3可知，通过添加纳米粒子至液体培养基中进行黄孢原毛平革菌菌丝生长形态的控制，可以使黄孢原毛平革菌菌丝球的比表面积增大，暴露在外的活性位点增多，从而提高其降解能力和吸附能力。同时，通过纳米粒子的种类、粒径、以及浓度的选择可以实现黄孢原毛平革菌菌丝球表面的形态和大小可调，使其能够适应各类特性的待吸附物质。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，例如纳米粒子还可以选用其他种类的氧化物，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
权利要求
1.一种控制黄孢原毛平革菌菌丝生长形态的方法，其特征在于，添加无机纳米粒子至黄孢原毛平革菌液体培养基中进行发酵培养，获得球状黄孢原毛平革菌菌丝团体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述球状黄孢原毛平革菌菌丝团体内部分布有所述无机纳米粒子。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的具体步骤为:将活化后的黄孢原毛平革菌菌种制备成孢子悬浮液，接种到添加有所述无机纳米粒子的液体培养基中，每升添加有无机纳米粒子的液体培养基中孢子接种量为2.0X IO6 3.0X IO6个，于30 33°C下摇床培养，摇床转速14(Tl50rpm，培养5 7天。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述无机纳米粒子采用高温高压蒸汽灭菌，所述液体培养基中的组分采用过滤除菌，将所述无机纳米粒子在无菌条件下添加至所述液体培养基中与所述液体培养基中的组分混合。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，过滤除菌中所用过滤器为0.22微米的微滤膜。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体培养基的组分包括:葡萄糖10g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.lg/L，藜芦醇0.lg/L，酒石酸铵0.2g/L，及痕量元素溶液70ml/L;所述痕量元素溶液配方为:硫酸镁3g/L，硫酸锰0.5g/L，氯化钠1.0g/L，七水硫酸亚铁0.lg/L，氯化钴0.lg/L，硫酸铜0.lg/L，七水硫酸锌0.lg/L，十二水硫酸招钾10mg/L,硼酸10mg/L, 二水钥酸钠10mg/L,及氨三乙酸1.5g/L。
7.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所添加的无机纳米粒子为氧化物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述氧化物为A1203、SiO2、或Ti02。
9.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，以IL所述液体培养基为基准，所述无机纳米粒子在所述液 体培养基中的添加量为0.0l-1Ogo
10.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述无机纳米粒子的粒径为lO-lOOOnm。
全文摘要
本发明涉及一种控制黄孢原毛平革菌菌丝生长形态的方法，属于生物工程领域。本发明将无机纳米粒子添加至黄孢原毛平革菌液体培养基中进行发酵培养，通过无机纳米粒子与孢子和菌丝之间的作用，同时纳米粒子进入菌丝球内部，获得球状黄孢原毛平革菌菌丝团体，该菌丝团体在染料脱色方面具有较佳的应用效果。
文档编号C12R1/645GK103160456SQ20131006772
公开日2013年6月19日 申请日期2013年3月4日 优先权日2013年3月4日
发明者苏宝连, 李其昌, 李昱, 谢浩 申请人:武汉理工大学