一种产n-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用。其中所述工程菌是通过将编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶基因引入枯草芽孢杆菌中表达，同时加强枯草芽孢杆菌自身的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶表达，在枯草芽孢杆菌中构建成从葡萄糖或甘油到N-乙酰神经氨酸的完整代谢通路，从而能利用葡萄糖或甘油为底物进行发酵培养生成N-乙酰神经氨酸。本发明所采用的枯草芽孢杆菌在食品工业上已得到广泛的应用，已被证明安全无害，适合于生产食品和保健品所需的N-乙酰神经氨酸。
【专利说明】一种产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用，属生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]唾液酸，又称燕窝酸，广泛存在于自然界的各种生物体内，唾液酸是一系列含有9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖的统称，其中最主要的组分是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)。
[0003]N-乙酰神经氨酸目前的应用主要有两个领域，一个是作为医药中间体，用于合成抗流感药物扎那米韦；另一个是作为食品添加剂，用于婴幼儿奶粉中，以使其接近母乳，促进婴儿神经系统的发育。
[0004]作为医药中间体的N-乙酰神经氨酸，可以用生物催化法和发酵法生产，其中生物催化法是以N-乙酰氨基葡萄糖和丙酮酸钠为原料，以高表达神经氨酸醛缩酶和N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶的大肠杆菌菌体或细菌破碎液为催化剂，转化生成N-乙酰神经氨酸。发酵法生产N-乙酰神经氨酸是对大肠杆菌进行代谢工程改造，使其能从葡萄糖或甘油直接合成N-乙酰神经氨酸。
[0005]用作食品添加剂的N-乙酰神经氨酸目前主要还是从含有N-乙酰神经氨酸的天然原料(如鸡蛋、乳清、燕窝等)中直接提取，该方法生产的产品为天然来源，安全可靠，但由于含量太低和成分复杂导致提取工艺复杂，成本高昂。而目前生物转化法和发酵法都是以大肠杆菌进行生产，大肠杆菌由于发酵过程中会有内毒素产生，对于其生产出的终产品可能会有不利的影响，因此，大肠杆菌生产出的N-乙酰神经氨酸在食品添加剂领域的应用尚未得到权威认可。
[0006]枯草芽孢杆菌及其代谢产品已在人类食品和保健品中得到广泛的应用，目前尚未发现毒副作用，被美国食品药品管理局(Food and Drug Administration,FDA)认证为一般认为安全(Generally Recognized as Safe,GRAS)类微生物,具有安全无害的优点,可用于人类食品保健品领域的生产。但相比大肠杆菌，枯草芽孢杆菌的遗传改造比较复杂，代谢背景不清晰，尚未见改造后用于N-乙酰神经氨酸合成生产的报道。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是提供一种产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用。
[0008]本发明选择枯草芽孢杆菌作为生产N-乙酰神经氨酸的出发菌株，但分析枯草芽孢杆菌的代谢途径可知，其从葡萄糖开始可以合成到UDP-N-乙酰氨基葡萄糖，但缺乏从UDP-N-乙酰氨基葡萄糖合成到N-乙酰神经氨酸的途径，无法达到以葡萄糖为底物，发酵法直接合成N-乙酰神经氨酸的目的。[0009]为解决上述技术问题，本发明在枯草芽孢杆菌中外源表达编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶编码基因neuC和N-乙酰神经氨酸合成酶编码基因neuB，补足从UDP-N-乙酰氨基葡萄糖到N-乙酰神经氨酸合成所需的酶，架构起从葡萄糖到N-乙酰神经氨酸的完整代谢途径，从而实现利用葡萄糖直接发酵合成N-乙酰神经氨酸的目的。
[0010]为进一步提高N-乙酰神经氨酸的产量，本发明高表达枯草芽孢杆菌自身编码6-磷酸氨基葡萄糖合成酶的glmS基因，打通从葡萄糖或甘油到N-乙酰神经氨酸合成的瓶颈，增加代谢流量，从而增加N-乙酰神经氨酸的产量。
[0011]为此，本发明提供了一种产N-乙酰神经氨酸枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌是通过将m)P-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因、N-乙酰神经氨酸合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因导入枯草芽孢杆菌中进行外源表达而构建得到的。
[0012]本发明所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因neuC和N-乙酰神经氨酸合成酶基因neuB来源于空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)或能表达相同功能酶的微生物，基因的获得可根据GenBank N0.AF400048中neuB和neuC基因序列全基因合成，或利用空肠弯曲菌(如菌株ATCC43438)的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或采用过类似手段从其他生物体获得。由于来源于空肠弯曲菌的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因neuC和N-乙酰神经氨酸合成酶基因neuB连锁在一起，因此外源表达是可以将两个基因一起表达,也可以将两个基因分开表达。[0013]所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因来源于枯草芽孢杆菌或能表达相同功能酶的微生物，基因的获得可根据枯草芽孢杆菌168菌株基因组序列GenBank N0.AL009126.3中的glmS基因及其上游的SD序列全基因合成，或利用枯草杆菌168菌株的基因组DNA为模板PCR扩增获得，或采用过类似手段从其他生物体获得。
[0014]在一个实施方案中，所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因、N-乙酰神经氨酸合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因在同一个载体中一起克隆表达。作为本领域的科研人员，利用常规的分子克隆技术，也可以将三个基因在不同载体中分开克隆表达或以类似方式完成外源表达，从而达到同样目的。
[0015]在一个实施方案中,所述枯草芽孢杆菌宿主为枯草芽孢杆菌164或枯草芽孢杆菌168，并且所得到的基因工程菌已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉大学，保藏号分别为 CCTCC NO:M2013731 和 CCTCC N0:M2014038，保藏号为 CCTCC N0:M2013731 的分类号为:枯草芽孢杆菌CASOV — 3Bacillus subtilis CASOV — 3，CCTCC N0:M2014038 的分类号为:枯草芽孢杆菌CASOV — 4Bacillus subtilis CASOV — 4。本实施方案也可以选择其他枯草芽孢杆菌菌株，达到类似的实验目的。
[0016]本发明还公开了一种产N-乙酰神经氨酸枯草芽孢杆菌的应用，即利用上述工程菌以葡萄糖或甘油进行发酵，生产N-乙酰神经氨酸，所述应用包括以下步骤:
[0017]I)活化培养工程菌种子；
[0018]2)将培养好的种子逐级放大，并在相应的发酵罐中进行好气培养；以及补充合适的碳氮源；
[0019]3)加入异丙基_β-D-硫代吡喃半乳糖苷，诱导相关蛋白的表达。本发明通过基因工程技术对枯草芽孢杆菌进行改造，使其可以以葡萄糖或甘油直接合成N-乙酰神经氨酸，具有生产工艺简单，环境友好的优点。同时本发明采用的枯草芽孢杆菌作为生产N-乙酰神经氨酸的宿主，所生产的N-乙酰神经氨酸没有内毒素污染的威胁，安全可靠，可用于食品保健品领域，具有工业化生产的价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]下面结合附图与【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明:
[0021]图1是枯草芽孢杆菌中葡萄糖或甘油到N-乙酰神经氨酸的合成改造途径。
【具体实施方式】
[0022]以下实施例中使用的质粒、PCR试剂等采用商业产品，具体操作按照说明书进行。其他未注明的实验操作按照常规分子操作方法进行。
[0023]实施例1:neuBC和glmS基因串联表达载体的构建
[0024]一、neuBC基因表达载体pHTOl-neuBC的构建
[0025]I)根据neuBC的基因序列(GenBank N0.AF400048)全基因合成neuBC基因，两端加BamHI和XbaI位点，具体序列如下所示(SEQ ID N0.1)。
【权利要求】
1.一种产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌是通过将UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因、N-乙酰神经氨酸合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因导入枯草芽孢杆菌中进行外源表达而构建得到的。
2.如权利要求1所述的产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因和N-乙酰神经氨酸合成酶基因来源于空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)或能表达相同功能酶的微生物。
3.如权利要求1所述的产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因来源于枯草芽孢杆菌或能表达相同功能酶的微生物。
4.如权利要求1至3任一项所述的产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因、N-乙酰神经氨酸合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因在同一个载体中一起克隆表达，或克隆在不同的载体后转入同一菌株后中分开表达。
5.如权利要求1所述的产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于所述枯草芽孢杆菌宿主为枯草芽孢杆菌164或枯草芽孢杆菌168或其他类似菌株。
6.如权利要求5所述的产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌是保藏号为CCTCC N0:M2013731或CCTCC N0:M2014038的菌株。
7.如权利要求1所述的产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌工程菌的用途，其特征在于利用所述工程菌生产N-乙酰神经氨酸，其步骤包括: 1)活化培养工程菌种子； 2)将培养好的种子逐级放大，并在相应的发酵罐中进行好气培养；培养过程中补充合适的碳氮源；以及 3)加入异丙基_β-D-硫代吡喃半乳糖苷，诱导相关蛋白的表达。
8.权利要求7的产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌工程菌的用途，其特征在于利用葡萄糖或甘油作为碳源进行发酵。
【文档编号】C12R1/125GK103923869SQ201410102633
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年3月19日 优先权日:2014年3月19日
【发明者】柳鹏福, 孙立洁, 王纪, 袁丽霞, 刘洋, 吴金勇, 陈祥松, 史吉平, 姚建铭 申请人:武汉中科光谷绿色生物技术有限公司