专利名称：制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质的方法
技术领域：
本发明属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及新型链霉亲和素标记的藻蓝蛋 白alpha亚基类荧光蛋白质的制备方法。
背景技术：
藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分。根据
其吸收光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白(phycoerythrin，简称CPE)、
藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin,简称PEC)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称CPC)和
变藻蓝蛋白(allophycocyanin，简称APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含alpha和beta亚基，
每个亚基中藻胆色素(phycobilin )通过硫醚键与藻胆蛋白脱辅基蛋白
(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸残基的巯基共价结合，其种类及其与脱辅基蛋白的相
互作用决定藻胆蛋白的光谱性质。藻胆色素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得
CPE主要吸收约560固的可见光，发射约580nm的荧光；PEC吸收约570ntn的可见光，发
射约630nm的荧光；CPC吸收约620nm的可见光，发射约640nm的荧光；APC吸收约650
660nm的可见光，发射约660 670nm的荧光。CPE结合的辅基色素为藻红胆素
(phycoerythrobilin，简称PEB); PEC的alpha亚基结合的辅基色素为藻紫胆素
(phycoviolobilin，简称PVB); PEC的beta亚基结合的辅基色素为藻蓝胆素
(phycocyanobilin，简称PCB); CPC和APC结合的辅基色素都为藻蓝胆素PCB。
链霉亲和素可以跟生物素特异结合，通过链霉亲和素-生物素系统，可以实现信号放
大作用，提高检测灵敏度。目前链霉亲和素-生物素系统已经广泛应用于生物学检测和医
疗检测等领域。目前主要是通过化学交联实现链霉亲和素对目标的标记。
CPC的alpha亚基可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产(TooleyAJ, CaiYA， Glazer
A N. Biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial C_phycocyanin holo-alpha
subunit in a heterologous host[J]. Proc Natl Acad Sci USA' 2001, 98(19):10560
10565)。 PCB生物合成基因由力o7和pc/力组成，可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产PCB
(F. T丄andgraf， C. Forreiter, et al. Recombinant holophytochrome in Echerichia
coli[J]. FEBS Letters, 2001, 508:459-462)。我们通过基因工程技术，把链霉亲和素基
因和藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于表达载体，可以在大肠杆菌内表达
得到链霉亲和素和藻蓝蛋白alpha亚基类脱辅基蛋白的融合蛋白，直接实现链霉亲和素和
藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的连接，而不需要通过化学交联等方法来实现链霉亲和素标记；把藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因、PCB生物合成基因克隆于表达载体。利用以上 表达载体，通过基因工程菌，可以直接生成链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光 蛋白质。
藻胆蛋白类荧光蛋白质可以应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域。藻蓝蛋白类 荧光蛋白质具有优良的荧光性质，通过直接实现链链霉亲和素和藻蓝蛋白alpha亚基脱辅 基蛋白的连接，可用于生物学检测以及医疗检测领域。本发明为藻蓝蛋白类色素蛋白质功 能材料应用于医药和生物工程领域，特别是检测领域奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白
质的方法。它是应用藻蓝蛋白alpha亚基裂合催化藻蓝胆素(PCB)与链霉亲和素标记的藻
蓝蛋白alpha亚基类脱辅基蛋白共价结合，从而制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚
基类荧光蛋白质。将含有藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因、链霉亲和素基因和藻蓝蛋白
alpha亚基类脱辅基蛋白基因拼接的基因、藻蓝胆素生物合成酶基因的表达质粒依次转入
宿主菌，得到相应的工程菌，通过这种方法得到的基因工程菌生产链霉亲和素标记的藻蓝
蛋白alpha亚基类荧光蛋白质。
本发明的目的是这样实现的 一种制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光
蛋白质的方法，包括下述步骤
(1) 采用基因工程方法，将alpha亚基裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中， 得到alpha亚基裂合酶表达质粒；
(2) 用基因工程方法将链霉亲和素基因和藻蓝蛋白alpha亚基类脱辅基蛋白基因或 其同源基因克隆于第二个表达载体中，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒；
(3) 用基因工程方法将PCB生物合成酶基因力o7和或其同源基因同时克隆于第 三个表达载体中或分别克隆于第三、第四个表达载体中，得到PCB合成质粒。
(4) 将beta裂合酶表达质粒、链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒、PCB生物合 成酶质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌， 应用此工程菌发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋 白alpha亚基类荧光蛋白质。
上述的制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质的方法中所述的宿 主菌为大肠杆菌。所述的alpha亚基裂合酶基因是指与A7aZ ae/7a sp. PCC7120中"cf和 c; c,基因或M ^啦7 osiAs sp. PCC7603中c;x^和c; C基因同源的基因。所述的藻蓝蛋 白alpha亚基类脱辅基蛋白基因是指与A7a6ae朋sp. PCC7120或#. 7a肌'/7o犯s sp. PCC7603中cpd同源的基因。
本发明与现有技术相比，具有以下优点
1、 不使用藻类为原料而是利用大肠杆菌生产藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质，大 肠杆菌繁殖快，可以大大缩短周期；
2、 与藻类相比，大肠杆菌细胞壁容易破碎，纯化过程中可节省能源；
3、 通过大肠杆菌生产，目标蛋白含量高，有His-tag标记，且体系中几乎没有性质 类似的蛋白，提取方便；
4、 产物中链霉亲和素与荧光藻蓝蛋白alpha亚基类色素蛋白质直接结合，不需额外 进行处理，有利于发展荧光藻胆蛋白类色素蛋白质在检测领域的应用。
图1为本发明中a^A/a^,催化下生成的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧 光蛋白质的吸收与荧光光谱；其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。 具体实施方
下面以实例对本发明作进一步详细的说明。 实施例1
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种如s6ae朋sp.PCC7120的全序列已经测定完成， J柳众as〃s sp. PCC7603部分序列已经测定。/4/ s力ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号
为BA000019，必7a/w'/70S"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将链霉亲和素基因(简称和 力/7a6ae朋sp. PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公 司购买的pET30中，所得质粒叫pET30-s^在大肠杆菌中能表达链霉亲和素和藻蓝 蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅 基蛋白的表达质粒。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(2) 将力/ a/bae朋sp.PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因c/ c^和cpc尸克 隆于Novagen公司购买的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-cpc￡-c/ cF，在大肠杆菌中 能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶Qx^/c;x^，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质粒。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(Zw7和pc州)克隆于Novagen公司购买的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-pcyA在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。 即脱辅基蛋白基因c; c力在pET30中是在fcoRV和J力o I两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因sa在和^71I两个酶切位点之间；裂合酶基因cpcf在pETDuet中，处于 第一个多克隆位点，酶切位点是AboI和之间，裂合酶基因cpc尸在pETDuet中，处 于第二个多克隆位点，酶切位点是fcoRV和/力o I之间；PCB合成酶基因是2个(力o7和 ; c/力，它们在同一个载体pACYCDuet-l中，力o7处于第一个多克隆位点，在Afco I和 I之间，pc^在第二个多克隆位点，在7Votel和i7wI之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pETDuet-cpcf-c; cF、 pET30-sa~cpd和pACYCDuet-Ao/-/ 《W转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37'C振荡培养至0D卿为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1,1/L， 2CTC至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白A;离 心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Nr亲和层析，可提 纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白A。其吸收与 荧光光谱见图l所示，其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式如下从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21(DE3)单菌落，接种于5mL LB培养基，37'C振荡培养过夜；取100nL饱和培养物，无菌转接至5mL LB培养基，37'C振荡培养至0D6。。=0. 3 0. 4时，将菌液转移至5mL无菌离心管中，冰上放置10分钟；离心1分钟(10000g， 4。C)弃去上清，收集沉淀菌体；用lmL预冷的0. lmol/L CaCl2无菌溶液重悬菌体，离心30s(10000g, 4'C)去上清，菌体沉淀用100pL预冷的0. lmol/L CaCl2重悬，放置于冰上，加入一定量的构建好的质粒，混匀后冰浴放置30分钟，42'C热休克90s，冰浴5分钟后加入300nLLB培养基，37。C低速振荡培养45分钟，无菌涂布在含有相应抗生素的LB培养基平板上，倒置于37'C培养箱至形成可见的单克隆菌斑。提取3个左右菌落，分别接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，振荡培养至饱和；分别从中取100nL转接至5ml含相应抗生素的LB培养基中；37'C振荡培养至ODe。。-0. 5-0.7 时，冰浴约30分钟，加入IPTG诱导表达；避光、20°C、 150转/分，表达约12小时。离 心收集细胞，细胞加入缓冲液重悬；通过光谱仪测其产物荧光量，选取荧光产量高的菌株 进行大量表达。 实施例2
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种//朋6se"a sp.PCC7120的全序列已经测定完成， 脱7a/Biy7oms sp. PCC7603部分序列已经测定。/J朋力ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，尨7a/w'"os"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将链霉亲和素基因(简称m)和 力朋力ae朋sp. PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公 司购买的pET30中，所得质粒叫pET30-srcpd，在大肠杆菌中能表达链霉亲和素和藻蓝 蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅 基蛋白的表达质粒。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(2) 将Ja/w'/ o幼ssp. PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因c/ cf和cpc, 克隆于Novagen公司购买的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-c/ cf-cpc尸，在大肠杆菌 中能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶。c￡/c/7CF，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质 粒。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pc州)克隆于Novagen公司购买的 pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-pc/A在大肠杆菌中能同时表达HOI和PcyA。
即脱辅基蛋白基因c/ d在pET30中是在f RV和/力o I两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因m在《p/7l和)fe7II两个酶切位点之间；裂合酶基因cpcf在pETDuet中，处于 第一个多克隆位点，酵切位点是tVcoI和尸"I之间，裂合酶基因cpcF在pETDuet中，处 于第二个多克隆位点，酶切位点是^boRV和/力oI之间；PCB合成酶基因是2个(力W和 pc州)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，Z o7处于第一个多克隆位点，在AfcoI和尸" I之间，pcj^l在第二个多克隆位点，在y^tel和^oI之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分
别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pETDuet-cpcf-cpc,、 pET30-sa~cpc力和pACYCDuet-Z o7-p《W转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37。C振荡培养至0D,为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白A;离 心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N;T亲和层析，可提 纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白A。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例3
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种/l朋6ae朋sp.PCC7120的全序列己经测定完成， vK Ja/z i/70SiAs sp. PCC7603部分序列已经测定。勘a/ ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，M Ja肌'/70s"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将链霉亲和素基因(简称m)和
^肌'/70s"s sp. PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen 公司购买的pET30中，所得质粒叫pET30-stcpcA在大肠杆菌中能表达链霉亲和素和藻 蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基脱 辅基蛋白的表达质粒。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(2) 将^ a^e/7a sp. PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因cpcf和cpcF克 隆于Novagen公司购买的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-cpc￡-cpc尸，在大肠杆菌中 能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶Ox^/c/^F，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质粒。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(Zw7和pcW)克隆于Novagen公司购买的
pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-pc7A在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即脱辅基蛋白基因在pET30中是在fcoRV和J力o I两个酶切位点之间，链霉亲和素基因sa在vf/wl和^71I两个酶切位点之间；裂合酶基因c/x^在pETDuet中，处于 第一个多克隆位点，酶切位点是Afco I和,W I之间，裂合酶基因cpc,在pETDuet中，处 于第二个多克隆位点，酶切位点是fcoRV和// o I之间；PCB合成酶基因是2个(力o7和 pc^)，它们在同一个载体pACYCDuet-l中，力o7处于第一个多克隆位点，在AfcoI和/^t I之间，/ c/力在第二个多克隆位点，在AWeI和iT oI之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致h 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pETDuet-cpcf-c; cF、 pET30-s『cpc力和pACYCDuet-力o7-pc/zJ转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37'C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l咖ol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白A;离 心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N;T亲和层析，可提 纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白A。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例4(1)从GeneBank中可以査到，藻种j朋6訓a sp. PCC7120的全序列已经测定完成， Ja/w'/7aws sp. PCC7603部分序列已经测定。^ atee/ a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，vf/. 7a肌7 os〃ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将链霉亲和素基因(简称sa)和 M 7a肌'/7os"ssp. PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen 公司购买的pET30中，所得质粒叫pET30-sa"C/ d，在大肠杆菌中能表达链霉亲和素和藻 蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基脱 辅基蛋白的表达质粒。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893,通过全基因合成得到。(2) 将必Ja肌'/70s〃ssp. PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因cpcf和c/ c尸 克隆于Novagen公司购买的pETDuet-l中，所得质粒叫pETDuet-cpcf-cpcF，在大肠杆菌 中能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶Qjc￡/c;x^，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质 粒。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pc;^)克隆于Novagen公司购买的 pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-/ W了c/A在大肠杆菌中能同时表达HOI和PcyA。即脱辅基蛋白基因cpM在pET30中是在AcoRV和两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因m在和^^1I两个酶切位点之间；裂合酶基因cpM在pETDuet中，处于 第一个多克隆位点，酶切位点是Afco I和尸"I之间，裂合酶基因cpc,在pETDuet中，处 于第二个多克隆位点，酶切位点是化oRV和J力o I之间；PCB合成酶基因是2个(力o7和 pc/j),它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在Afco I和尸W I之间，/ c/Z在第二个多克隆位点，在WeI和J力ol之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4) 将pETDuet-c; c^"-cpc,、 pET30-s『cpc力和pACYCDuet-转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37。C振荡培养至ODeoo为0.5至0.8，加入异丙基硫代-f3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l腿ol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白A;离 心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提 纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白A。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例5(1)从GeneBank中可以査到，藻种力朋6a, sp. PCC7120的全序列已经测定完成，#. Ja/w'/70s^ sp. PCC7603部分序列已经测定。勘a/)ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019，必7a/M'"o^^sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254，可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将链霉亲和素基因(简称S3)和 ^a&e朋sp. PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公 司购买的pCOLADuet-l中，所得质粒叫pCOLADuet-sa~c/ M，在大肠杆菌中能表达链霉亲 和素和藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白 alpha亚基脱辅基蛋白的表达质粒。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893,通过全基因合成得到。(2) 将^M力ae/ a sp. PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因cpW和c/ c,克 隆于Novagen公司购买的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-c/ cf-cpcF，在大肠杆菌中 能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶^^/cpc尸，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质粒。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力W和； c州)克隆于Novagen公司购买的 pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-pc/A在大肠杆菌中能同时表达HOI和PcyA。即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因③"拼接后的片段在pC0LADuet-l中是在第 一个多克隆位点的^coR I和化t I两个酶切位点之间；裂合酶基因cpcf在pETDuet中， 处于第一个多克隆位点，酶切位点是Afeo I和尸"I之间，裂合酶基因cpcF在pETDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是fcoRV和i7 oI之间；PCB合成酶基因是2个(力o 和pcW)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在Afco I和 户"I之间，/ cy力在第二个多克隆位点，在AWeI和J力ol之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。c/ c力和pACYCDuet-Z o7-; 《W转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thiof D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l腦ol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白A;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Nr亲和 层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白A。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例6(1) 从GeneBank中可以査到，藻种sp. PCC7120的全序列已经测定完成， 必Ja/M'/JOS"s sp. PCC7603部分序列已经测定。力朋tee/ a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，i/. h/z i/70S〃ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将链霉亲和素基因(简称和 力朋&e朋sp. PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公 司购买的pCOLADuet-1中，所得质粒叫pC0LADuet-sa"C/ c力，在大肠杆菌中能表达链霉亲 和素和藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白 alpha亚基脱辅基蛋白的表达质粒。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(2) 将J/. ^yw'/70s^sp. PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因和c/ c尸 克隆于Novagen公司购买的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-c; cf-c/ cF，在大肠杆菌 中能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶0^《cpc尸，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质 粒。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pc州)克隆于Novagen公司购买的 pACYCDuet-1中，所得质粒叫口八[￥〔01161-/ 07-;^//}，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即链霉亲和素基因幼和脱辅基蛋白基因cp"拼接后的片段在pC0LADuet-l中是在第 一个多克隆位点的^boR I和I两个酶切位点之间；裂合酶基因c/ c^在pETDuet中， 处于第一个多克隆位点，酶切位点是Wco I和尸"I之间，裂合酶基因cpc尸在pETDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是fcoRV和/力o1之间；PCB合成酶基因是2个(力o7 和/7cy力)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在Afco I和 At I之间，pc;^在第二个多克隆位点，在We I和J力o I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pETDuet-c/ cf-cpc尺pCOLADuet-^-cpd和pACYCDuet-力o7-pc州转入大肠 杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的 LB培养基中，37'C振荡培养至0D,为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝 蛋白A;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过^2+亲和 层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白A。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例7(1) 从GeneBank中可以查到，藻种A atee/ a sp. PCC7120的全序列已经测定完成， Ja/w770s"s sp. PCC7603部分序列已经测定。^/7a/ ae/ a sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019，i/. ^肌'/7owssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将链霉亲和素基因(简称幼)和 必7a/w'/70幼s sp. PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen 公司购买的pC0LADuet-1中，所得质粒叫pCOLADuet-sa~cpcA在大肠杆菌中能表达链霉 亲和素和藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白 alpha亚基脱辅基蛋白的表达质粒。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893,通过全基因合成得到。(2) 将」朋6朋朋sp.PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因c/ c^"和cpcF克 隆于Novagen公司购买的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-cpcf-cpcF，在大肠杆菌中 能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶Q;ci5/Q^A得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质粒。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pc/J)克隆于Novagen公司购买的 pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-pcj^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因cp"拼接后的片段在pC0LADuet-l中是在第一个多克隆位点的I和尸"I两个酶切位点之间；裂合酶基因在pETDuet中，处于第一个多克隆位点，酶切位点是I和尸"I之间，裂合酶基因c/ c,在pETDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是fcoRV和之间；PCB合成酶基因是2个(力W 和pcW)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在；Vco I和 At I之间，/ c州在第二个多克隆位点，在Ato I和J力o I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pETDuet-c/ cf-c; c尸、pCOLADuet-sa^c; "和pACYCDuet_/w7-pc/力转入大肠 杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的 LB培养基中，37。C振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (is叩r叩hyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝 蛋白A;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni"亲和 层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白A。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例8(1)从GeneBank中可以查到，藻种七a力ae/7a sp.PCC7120的全序列已经测定完成， #. 7柳i/70卯s sp. PCC7603部分序列已经测定。如a6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，必^yw'/Kw"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将链霉亲和素基因(简称和 必7a啦'/70^;ssp. PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen 公司购买的pCOLADuet-l中，所得质粒叫pC0LADuet-stc/ cA在大肠杆菌中能表达链霉 亲和素和藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白 alpha亚基脱辅基蛋白的表达质粒。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(2) 将M Zg历j'/70s"ssp. PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因cpcf和cpc, 克隆于Novagen公司购买的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-cpcf-c/ c尸，在大肠杆菌 中能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶a ^/"c,，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质 粒。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pcj^)克隆于Novagen公司购买的 pACYCDuet-l中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-/ c/A在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。即链霉亲和素基因幼和脱辅基蛋白基因^M拼接后的片段在pCOLADuet-1中是在第 一个多克隆位点的^coR I和I两个酶切位点之间；裂合酶基因cpcf在pETDuet中， 处于第一个多克隆位点，酶切位点是I和尸W I之间，裂合酶基因cpc尸在pETDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是feoRV和化ol之间；PCB合成酶基因是2个(力W 和pc/力)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在Afco I和 尸stl之间，pcj^在第二个多克隆位点，在A^el和J力ol之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4) 将pETDuet-，f-cpc,、 pC0LADuet-s";x^和pACYCDuet-/ a -p一转入大肠 杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的 LB培养基中，37'C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝 蛋白A;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和 层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白A。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例9(1)从GeneBank中可以查到，藻种/l朋te朋s sp. PCC7120的全序列已经测定完成，M〗a/w'/70s〃s sp. PCC7603部分序列已经测定。/)朋/^e朋sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019，尨Ja啦'/70s^ sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将链霉亲和素基因(简称和力朋tee朋sp. PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公 司购买的pET30中，所得质粒叫pET30-stcpc力，在大肠杆菌中能表达链霉亲和素和藻蓝 蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅 基蛋白的表达质粒。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893,通过全基因合成得到。(2) 将^朋fee朋sp.PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因cpcf和c; c尸克 隆于Novagen公司购买的pETDuet-l中，所得质粒叫pETDuet-cpcf-c/ cf，在大肠杆菌中 能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶0 c^/cpcF，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质粒。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o厶在大肠杆菌中能表达H01 。将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pCDFDuet-pcW，在大肠杆菌中能表达PcyA。即脱辅基蛋白基因cpd在pET30中是在5boRV和两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因sa在yrp"I和^^1I两个酶切位点之间；裂合酶基因cpcf在pETDuet中，处于 第一个多克隆位点，酶切位点是vVcoI和P"I之间，裂合酶基因cpc,在pETDuet中，处 于第二个多克隆位点，酶切位点是^boRV和J力ol之间；PCB合成酶基因是2个(hoi和 pcyA)， hoi在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在 pETDuet-1中第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4) 将pETDuet-c; t^-cpc尸、pET30-sa~c/ c/I和pACYCDuet-ho1、 pETDuet-pcyA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于PH 7. 0的LB培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-卩-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l腿ol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝 蛋白A;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和 层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白A。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例10
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种勘s6a, sp.PCC7120的全序列已经测定完成， 必J柳i/ os"s sp. PCC7603部分序列已经测定。如a力ae/7a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，i/. Ja/w'/70幼s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将链霉亲和素基因(简称幼)和 力"3力s朋a sp. PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公 司购买的pET30中，所得质粒叫pET30-s『cpcA在大肠杆菌中能表达链霉亲和素和藻蓝 蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅 基蛋白的表达质粒。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(2) 将M J柳i/ os"ssp. PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因cpcf和 克隆于Novagen公司购买的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-cpcf-c/ c尸，在大肠杆菌 中能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶Q ^/cpcF，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质 粒。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o厶在大肠杆菌中能表达H01。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pCDFDuet-pc/A在大肠杆菌中能表达PcyA。
即脱辅基蛋白基因在pET30中是在fcoRV和J力o I两个酶切位点之间，链霉亲
和素基因sa在A>/7l和《WII两个酶切位点之间；裂合酶基因cpcf在pETDuet中，处于
第一个多克隆位点，酶切位点是Afco I和尸"I之间，裂合酶基因c/ c,在pETDuet中，处
于第二个多克隆位点，酶切位点是&oRV和J力ol之间；PCB合成酶基因是2个(hol和
pcyA)， hoi在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在
pETDuet-1中第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pETDuet-cpcf-cpc尸、pET30-和pACYCDuet-hol、 pETDuet-pcyA转入 大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0 的LB培养基中，37'C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代_(3-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝 蛋白A;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N:T亲和 层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白A。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例11
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种力朋6朋朋sp.PCC7120的全序列已经测定完成， M Ja肌7 oms sp. PCC7603部分序列已经测定。力/ a/ ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019,必Ja/z i"om5 sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将链霉亲和素基因(简称幼)和 必Ja肌'朋siAssp. PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen 公司购买的pET30中，所得质粒叫pET30-srcpcA在大肠杆菌中能表达链霉亲和素和藻 蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基脱 辅基蛋白的表达质粒。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893,通过全基因合成得到。
(2) 将^7a6se朋sp.PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因c;x^和c/ c,克 隆于Novagen公司购买的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-cpc^-cpc尸，在大肠杆菌中 能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶Q^f/c;x^，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质粒。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o/克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得质粒叫pACYCDuet-力o厶在大肠杆菌中能表达H01。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pCDFDuet-pc;v!，在大肠杆菌中能表达PcyA。
即脱辅基蛋白基因在pET30中是在化oRV和I两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因sa在f/wl和5Wn两个酶切位点之间；裂合酶基因cpcf在pETDuet中，处于 第一个多克隆位点，酶切位点是/^oI和尸"I之间，裂合酶基因cpc尸在pETDuet中，处 于第二个多克隆位点，酶切位点是&oRV和i7wl之间；PCB合成酶基因是2个(hol和 pcyA)， hoi在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在 pETDuet-1中第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pETDuet-c/ cf-c/ c尸、pET30-sa"Cpc/f和pACYCDuet-hol、 pETDuet-pcyA转入 大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0 的LB培养基中，37'C振荡培养至0D咖为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside,简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 2CTC至37。C振荡 表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝 蛋白A;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N:T亲和 层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白A。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例12
(1)从GeneBank中可以查到，藻种力朋6朋朋sp.PCC7120的全序列己经测定完成，
M 7湖u'"as"s sp. PCC7603部分序列已经测定。勘a&e朋sp. PCC7120在GeneBank中编号
为BA000019，必7a迈i/7oms sp, PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254，
可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将链霉亲和素基因(简称幼)和
必h/w'/70犯s sp. PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen
公司购买的pET30中，所得质粒叫pET30-s『c/^/f，在大肠杆菌中能表达链霉亲和素和藻
蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的表达质粒。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(2) 将M Zg/7 i/ws"ssp. PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因cpcf和c/ c尸 克隆于Novagen公司购买的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-c/ cf-cpcf，在大肠杆菌 中能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶0 ci5/c;x^，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质 粒。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o/克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o厶在大肠杆菌中能表达HOl。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pc州克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pCDFDuet-pc/A在大肠杆菌中能表达PcyA。
即脱辅基蛋白基因cpd在pET30中是在fcoRV和/力o I两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因幼在和5^n两个酶切位点之间；裂合酶基因c; cf在pETDuet中，处于 第一个多克隆位点，酶切位点是Afco I和尸W I之间，裂合酶基因cpc尸在pETDuet中，处 于第二个多克隆位点，酶切位点是fcoRV和//wl之间；PCB合成酶基因是2个(hol和 pcyA)， hoi在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在 pETDuet-1中第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pETDuet-cpc￡-c; c尺pET30-sa"C/ d和pACYCDuet-hoi、 pETDuet-pcyA转入
大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于PH7.0
的LB培养基中，37。C振荡培养至0D,为0.5至0.8，加入异丙基硫代_(3-D-半乳糖苷
(is叩r叩hyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡
表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝
蛋白A;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N;T亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白A。 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例13
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种力朋力細sp. PCC7120的全序列已经测定完成， 尨Zg则'/705"s sp. PCC7603部分序列已经测定。勘atee朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019,vK 7a/w'/ os"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254, 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将链霉亲和素基因(简称和
sp. PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公 司购买的pC0LADuet-l中，所得质粒叫pCOLADuet-sfcpcA在大肠杆菌中能表达链霉亲 和素和藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白 alpha亚基脱辅基蛋白的表达质粒。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(2) 将勘a力ae朋sp. PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因c/ cf和cpcF克 隆于Novagen公司购买的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-c/ cf-cpC在大肠杆菌中 能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶Ox^/cpcF，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质粒。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o厶在大肠杆菌中能表达H01。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pc^克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pCDFDuet-; cj^，在大肠杆菌中能表达PcyA。
即链霉亲和素基因^和脱辅基蛋白基因cp"拼接后的片段在pCOLADuet-l中是在第 一个多克隆位点的I和尸W I两个酶切位点之间；裂合酶基因c/jW在pETDuet中， 处于第一个多克隆位点，酶切位点是Afc0 I和尸"I之间，裂合酶基因cpcF在pETDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是fcoRV和i7 oI之间；PCB合成酶基因是2个(hoi 和pcyA)， hoi在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA 在pETDuet-1中第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分
别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，
把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pETDuet-c/^-c/ c,、 pC0LADuet-,cpc力和pACYCDuet-hol、 pETDuet-pcyA 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于 pH7.0的LB培养基中，37'C振荡培养至OD6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖 苷(isoprophyl thiof D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 2(TC至37。C振 荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白A;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过NP 亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋 白A。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例14(1) 从GeneBank中可以査到，藻种^7a力ae朋sp, PCC7120的全序列已经测定完成， 必sp. PCC7603部分序列已经测定。勘a力ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，必Jaw'/ o^^sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将链霉亲和素基因(简称sa)和 ^ja6ae朋sp. PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公 司购买的pC0LADuet-1中，所得质粒叫pCOLADuet-sa^cpcA在大肠杆菌中能表达链霉亲 和素和藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白 alpha亚基脱辅基蛋白的表达质粒。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893,通过全基因合成得到。(2) 将Uawj'y owssp. PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因c; cf和c; c尸 克隆于Novagen公司购买的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-cpcf-cpc尸，在大肠杆菌 中能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶CpC￡/c/x^，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质 粒。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力W克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7，在大肠杆菌中能表达H01。将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pcy/l克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pCDFDuet-pc/A在大肠杆菌中能表达PcyA。即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因卬M拼接后的片段在pCOLADuet-1中是在第 一个多克隆位点的￡boR I和尸"I两个酶切位点之间；裂合酶基因cpcf在pETDuet中， 处于第一个多克隆位点，酶切位点是Afco I和At I之间，裂合酶基因c; cA在pETDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是fcoRV和///ol之间；PCB合成酶基因是2个(hoi 和pcyA)， hoi在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA 在pETDuet-1中第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致h 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pETDuet—cpcf-cpc尺pCOLADuet-sa~cpc^和pACYCDuet-hoi、 pETDuet-pcyA 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于 pH7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至ODe。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖 苷(is叩rophyl thiof D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l腿ol/L， 20。C至37。C振 荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白A;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过^2+ 亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋 白A。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例15(1)从GeneBank中可以查到，藻种如Wae朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， M 7a/wV7osiAS sp. PCC7603部分序列已经测定。」朋tee/7a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，M ^/w'/7owssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将链霉亲和素基因(简称幼)和 髮h/w'/7o幼ssp. PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen 公司购买的pC0LADuet-1中，所得质粒叫pCOLADuet-sa-cpcA在大肠杆菌中能表达链霉亲和素和藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的表达质粒。根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893,通过全基因合成得到。(2) 将^7aZw朋a sp. PCC7120中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因cpcf和c; c尸克 隆于Novagen公司购买的pETDuet-l中，所得质粒叫pETDuet-c/ cf-cpc,，在大肠杆菌中 能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶07^/^c尸，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质粒。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o 克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o厶在大肠杆菌中能表达H01。将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pcjv/克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pCDFDuet-/ c^，在大肠杆菌中能表达PcyA。即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因"d拼接后的片段在pCOLADuet-1中是在第 一个多克隆位点的I和尸"I两个酶切位点之间；裂合酶基因cpcf在pETDuet中， 处于第一个多克隆位点，酶切位点是餘o I和At I之间，裂合酶基因c/^F在pETDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是fcoRV和J力ol之间；PCB合成酶基因是2个(hoi 和pcyA)， hoi在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA 在pETDuet-1中第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4) 将pETDuet-cpc￡-c/)c,、 pC0LADuet-sa~cpc^和pACYCDuet-hol、 pETDuet-pcyA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37'C振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l,ol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白A;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过NP亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白A。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例16(1) 从GeneBank中可以查到，藻种細6細a sp. PCC7120的全序列已经测定完成， 必Ja/w'/70SiAS sp. PCC7603部分序列已经测定。^ a6ae/ a sp. PCC7120在GeneBank中编号 为BA000019，M 7a历/y o^sYA sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254， 可从所査到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将链霉亲和素基因(简称M)和 M 7a/w'"o^ssp. PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于Novagen 公司购买的pC0LADuet-1中，所得质粒叫pC0LADuet-stc; c力，在大肠杆菌中能表达链霉 亲和素和藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的藻蓝蛋白 alpha亚基脱辅基蛋白的表达质粒。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。(2) 将尨7a啦'77omssp. PCC7603中的藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因c/ cf和c/ cF 克隆于Novagen公司购买的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-wc￡-cpc尸，在大肠杆菌 中能表达藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶Qx^/"c尸，得到藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶表达质 粒。(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o厶在大肠杆菌中能表达H01。将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pCDFDuet-pc/A在大肠杆菌中能表达PcyA。即链霉亲和素基因sa和脱辅基蛋白基因cp"拼接后的片段在pC0LADuet-1中是在第 一个多克隆位点的fcoR I和两个酶切位点之间；裂合酶基因cpc^在pETDuet中， 处于第一个多克隆位点，酶切位点是/feo I和尸"I之间，裂合酶基因"cF在pETDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是fcoRV和/力oI之间；PCB合成酶基因是2个(hoi 和pcyA)， hoi在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA 在pETDuet-1中第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(4)将pETDuet-c/ C-，、pCOLADueHcpd和pACYCDuet-hol、 pETDuet-pcyA 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于 pH7.0的LB培养基中，37t:振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代_(3-D-半乳糖 苷(isoprophyl thiof D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l腿ol/L， 20。C至37。C振 荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白A;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni" 亲和层析，可提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋 白A。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 上述制备方法适用于采用各种蓝藻中的alpha亚基裂合酶、藻蓝蛋白alpha亚基类脱 辅基蛋白和PCB生物合成酶基因或其同源基因以及链霉亲和素基因及其同源基因来制备 链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质，但涉及到微生物菌种公开的问题， 本发明只选用了 GenBank中已公开全序列的蓝藻勘a6ae朋sp. PCC7120和已公开部分序列 的蓝藻Mh肌'/70s"ssp. PCC7603为例对本发明方法加以说明，本领域的技术人员可以根 据上述公开的内容采用其它原料实施本发明。
权利要求
1.一种制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质的方法，其特征在于包括下述步骤(1)采用基因工程方法，将alpha亚基裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到alpha亚基裂合酶表达质粒；(2)用基因工程方法将链霉亲和素基因和藻蓝蛋白alpha亚基类脱辅基蛋白基因或其同源基因克隆于第二个表达载体中，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒；(3)用基因工程方法将PCB生物合成酶基因ho1和pcyA或其同源基因同时克隆于第三个表达载体中或分别克隆于第三、第四个表达载体中，得到PCB合成质粒。(4)将beta裂合酶表达质粒、链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒、PCB生物合成酶质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的宿主菌为大肠杆菌。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的alpha亚基裂合酶基因是指与 力朋6ae/7a sp. PCC7120中c/7cf和cpcF基因或M sp. PCC7603中c; cf和c; c尸 基因同源的基因。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的藻蓝蛋白alpha亚基类脱辅基 蛋白基因是指与A a6ae/ a sp. PCC7120或尨J柳i/ os^ sp. PCC7603中cpd同源的基因。
全文摘要
本发明公开了一种制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质的方法，通过应用藻胆蛋白alpha亚基裂合酶催化藻蓝胆素与链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类脱辅基蛋白共价结合，制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质。本发明的方法应用生物过程生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类alpha亚基荧光蛋白质，是一种环境友好的生产方法。链霉亲和素标记的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质能应用于生物学和医药功能材料领域，特别是应用为生物学和医学检测领域的荧光探针。
文档编号C12N15/09GK101407806SQ20071003077
公开日2009年4月15日 申请日期2007年10月9日 优先权日2007年10月9日
发明者佟顺刚, 明 周, 坤 夏, 赵开弘 申请人:广州天宝颂原生物科技开发有限公司;华中科技大学