专利名称：金黄短杆菌an3及其降解孔雀石绿等染料的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的金黄短杆菌G5rew'力acteri鹏a""咖)AN3菌株，以及其在降解孔雀石绿 等三苯基甲垸染料、偶氮染料染料方面的应用。
背景技术：
染料分子是一种人工合成的复杂的芳香烃类化合物。根据美国C.I. (Color Inder)统计， 目前在使用的染料达万种之多，它们不仅具有特定的颜色，而且结构复杂，生物降解性较低， 大多数具有致癌、致畸和致突变的"三致"作用。这些合成染料在多种行业广泛使用，由于 其结构复杂，自然降解速度缓慢，对水环境造成严重的污染，因此有关含环境中残留染料的 处理问题是当前研究的热点和难点之一。研究化工染料生物降解的特性，有利于正确利用微 生物降解各种环境中的残留染料，对保护环境有积极的意义。目前已发现的染料脱色菌主要 包括硫酸盐还原菌，反硝化菌，芽孢杆菌，假单胞菌，肠道细菌等。这些细菌大多数只能 在厌氧条件下对一种染料进行不完全降解。
目前还未发现金黄短杆菌有降解染料的功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能高效地降解化工染料的新菌株，另一 目的是开发该菌株降 解化工染料的应用。
本发明通过对广州某研究所处理印染废水的厌氧折流板反应器(ABR)系统的活性污泥进 行分离、纯化，得到短杆菌属中金黄短杆菌种的一个新株，能高效地降解孔雀石绿等三苯基 甲烷类染料及偶氮类染料，从而实现了本发明的目的。与文献已经报道的菌种相比较，韩国 学者发现的三苯基甲垸类染料脱色菌是以去甲基化的方式对孔雀石绿脱色，脱色产物仍然保 留生物毒性。除本发明之外，尚未发现其它能够以去苯环的方式对孔雀石绿等三苯基甲垸类 染料脱色并降解脱毒的菌种报道。
本发明是金黄短杆菌(^SrewT acteri鹏a"re鹏)AN3 CGMCC No. 2193。
本发明的金黄短杆菌(/2rew'力s"er》朋swre"忍)AN3，已于2007年10月12日保存在中 国普通微生物保藏管理中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 2193。
本发明的金黄短杆菌(5rew'6acteh鹏孤re鹏)AN3从广州某研究所处理印染废水的厌氧 折流反应器系统的活性污泥进行分离、纯化而得。其分离纯化方法如下取5mL活性污泥于 染料培养基中(每升培养基中含酵母抽提物l.Og， (NH4)2S04 2.5g， KH2P04 13. 3g ， Na2HP04 21.6g，并分别添加三苯基甲烷、偶氮两种结构染料中的一种，使培养基中的染料浓度为50mg/L，培养基其它成分是水，3(TC静置培养，观察染料的脱色情况，当培养液中的染料基 本上完全脱色时，以1/10的接种量转接至另一新鲜的同样的培养基中，如此重复几次，直至 脱色时间明显縮短，将该培养液进行适当稀释后均匀涂布于LB固体培养基上(含蛋白胨10g/L, 酵母抽提物5g/L， NaCl 10g/L，琼脂条2%， pH7.0)， 30'C培养24小时，挑取单菌落进行分离、 纯化，将分离纯化到的单菌落采用LB液体培养基(不添加琼脂条，其它分量与上一步的LB 固体培养基相同)进行活化过夜，得到菌株AN3。
本发明的菌株AN3具有如下形态和生理、生化特性
(a) 菌体形态特性
菌株AN3的细胞为革兰氏染色阳性，短杆状，不具运动性，大小为0.6他 1. lWnXl. 2陶 4.0Mm (细胞形态透射电镜观察如图1和图2所示)；
(b) 菌落形态特性
在营养琼脂平板上37'C培养24h后，菌落呈橙黄色，表面光滑，湿润，边缘整齐，菌落 大小为0- 4腦 2. 5,5
(c) 主要的生理、生化特征
菌株AN3能在2(TC 4(TC的温度下生长，其最适生长温度范围为20。C 35。C，其生长 pH范围为pH 5. 5 10. 5，最适生长pH为6. 5 8. 5;金黄短杆菌AN3为化能异养菌，呼吸 代谢，接触酶为阳性，液化明胶，葡萄糖发酵产酸。
上述结果表明本发明菌株AN3与短杆菌属的生理生化特性很相似。
本发明菌株AN3的分子分类地位
采用SDS-蛋白酶K，氯仿-异戊醇(体积比24:1)抽提，0. 6体积异丙醇沉淀的方法提取 细菌总DNA，采用细菌16S rDNA通用引物27f / 1522r PCR扩增细菌的16S rDNA基因，将 PCR扩增产物直接进行序列测定，将获得的DNA序列输入Genbank，以Blastn程序对数据库 中的所有序列进行比较分析，结果发现菌株AN3的16S rDNA序列与GenBank中的金黄短杆菌 (5rew'tecteri咖卵re鹏)具有较高的同源性，同源性为96%。
结合菌株AN3的生理生化特性、16S rDNA序列的结果，菌株AN3应归属于短杆菌属金黄 短杆菌种，是该菌种的一个新株，命名为金黄短杆菌05rew'力acte/^M awre〃/z )AN3。
本发明的金黄短杆菌(^reW&"eri鹏a"re鹏)AN3可以用于降解三苯基甲烷类染料和偶 氮类染料。
本发明的金黄短杆菌(5rew力acteri柳awe"历)AN3可以在25 37°C ， pH6. 0 8. 5，兼性 厌氧条件下降解三苯基甲烷类染料，而且是以去苯环脱毒的方式对其进行降解，对目前造成 水产品污染严重、以杀菌剂形式使用的孔雀石绿等三苯基甲垸类染料和偶氮类染料都有显著 的降解能力，对浓度为50 mg/L的三苯基甲垸染料孔雀石绿8 h内去除率为61. 4%, 16 h内去除率为97. 3%，其最高耐受浓度达到500 mg/L;对浓度为50 mg/L的三苯基甲烷染料结晶 紫12 h内去除率为65. 2%， 24 h后脱色率已高达89. 3%，最高耐受浓度为200 mg/L;对浓度 为50mg/L的三苯基甲烷染料灿烂绿14 h内的去除率达到93. 4%，最高耐受浓度为300 mg/L; 对浓度为50 mg/L的三苯基甲垸染料碱性品红经14 h后的去除率达到90. 1%，最高耐受浓度 为300 mg/L;对浓度为50mg/L的偶氮类染料酸性大红经24h后的去除率达到85. 1%，最高 耐受浓度为400 mg/L;对浓度为50 mg/L的偶氮类染料酸性苋菜红经12 h后的去除率达到 93.4%，最高耐受浓度为400 mg/L。因此本发明能提高常规废水处理的效率，有效改善养殖 水生态环境质量，因而具有良好的市场应用前景。
图1:金黄短杆菌(^"ew'6acz^r&y77 a『e柳)AN3透射电子显微图片(放大IO, OOO倍)。 图2:金黄短杆菌(5rew'力ac^ri鹏AN3透射电子显微图片(放大20， 000倍)。
具体实施例方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。 实施例1:
取5 mL广州某研究所处理印染废水的厌氧折流反应器系统的活性污泥于50 mL染料培养 基中(每升培养基中含酵母抽提物1. 0 g， (NH4)2S04 2 . 5 g, KH2P04 13. 3 g , Na2HP04 21, 6 g， 并添加三苯基甲垸，使培养基中的染料浓度为50mg/L，其余是水)，3(TC静置培养，观察染 料的脱色情况，当培养液中的染料基本上完全脱色时，以10%的接种量转接至另一新鲜的同 样的培养基中，如此重复几次，直至脱色时间明显縮短，将该培养液进行适当稀释后均匀涂 布于LB固体培养基上(含蛋白胨10 g/L,酵母抽提物5 g/L， NaCl 10 g/L，琼脂条2%， pH7. 0)， 3(TC培养24h，挑取单菌落进行分离、纯化，将分离纯化到的单菌落采用LB液体培养基(不 添加琼脂条，其它分量与上一步的LB固体培养基相同)进行活化过夜,得到的菌株经菌体形 态特征，菌落形态特征和生理生化特征分析，证实是短杆菌AN3。
实施例2:
200 mL去离子水中添加Na2HP04 7H20 2 . 56 g， KH2P04 0. 6 g, NaCl 0. 1 g， NH4C1 0. 2 g，孔雀石绿GR (C. 1.42000) 0.01 g， 211。C条件下灭菌20分钟作为染料培养液。把实施例 1得到的菌株AN3斜面接种至LB液体培养基中，于30'C， 150 r/min条件下摇床活化菌体， 使细菌数达到108数量级，以1/10的接种量接种活化菌液于染料培养液中，3(TC静置培养， 观察培养液的颜色变化情况，每隔30分钟取10 mL染料培养液于6 000 r/min离心去菌体， 采用叫640紫外分光光度计(BECKMAN)在617 nm处测定染料培养液中孔雀石绿GR(C, I. 42000) 的吸光值，并以不加菌的染料培养液为对照，计算染料降解率，得到的菌株AN3对浓度为50 mg/L的三苯基甲垸染料孔雀石8 h内去除率为61. 4%， 16 h内去除率为97. 3%。实施例3:
200 mL去离子水中添加Na2HP04 7H20 2.56 g， KH2P04 0 . 6 g ， NaCl 0.1 g， NH4C1 0.2 g，结晶紫(C.I. 42555) O.Olg， 2lrC条件下灭菌20分钟作为染料培养液。把实施例1得到 的菌株AN3斜面接种至LB液体培养基中，于3(TC， 150 r/min条件下摇床活化菌体，使细菌 数达到108数量级，以1/10的接种量接种活化菌液于各染料培养液中，3CTC静置培养，观察 各培养液的颜色变化情况，每隔30分钟分别取10 mL染料培养液于6 000 r/min离心去菌体， 采用DU640紫外分光光度计(BECKMAN)在590 nm处测定染料培养液中结晶紫(C. I. 42555) 的吸光值，并以相应的不加菌的染料培养液为对照，计算染料降解率。得到菌株AN3对浓度 为50 mg/L的三苯基甲烷染料结晶紫12 h内去除率为65. 2%， 24 h后脱色率已高达89. 3%。
实施例3:
200 mL去离子水中添加Na2HP04 7H20 2 . 56 g， KH2P04 0. 6 g ， NaCl 0. 1 g， NH4C1 0. 2 g，灿烂绿(C.I. 42040) 0.01 g， 2lrc条件下灭菌20分钟作为染料培养液。把实施例1得 到的菌株AN3斜面接种至LB液体培养基中，于3(TC， 150 r/min条件下摇床活化菌体，使细 菌数达到108数量级，以1/10的接种量接种活化菌液于各染料培养液中，3(TC静置培养，观 察各培养液的颜色变化情况，每隔30分钟分别取10 mL染料培养液于6 000 r/min离心去菌 体，采用DU640紫外分光光度计(BECKMAN)在580nm处测定染料培养液中灿烂绿(C. I. 42040) 的吸光值，并以相应的不加菌的染料培养液为对照，计 算染料降解率。得到菌株AN3对浓度 为50 mg/L的三苯基甲垸染料灿烂绿14 h内的去除率达到93. 4%。
实施例4:
200 mL去离子水中添加Na2HP04 7H20 2. 56 g, KH2P04 0. 6 g ， NaCl 0. 1 g， NH4C1 0. 2 g，碱性品红(C. 1.42510) O.Olg， 211'C条件下灭菌20分钟作为染料培养液。把实施例1得 到的菌株AN3斜面接种至LB液体培养基中，于3(TC， 150 r/min条件下摇床活化菌体，使细 菌数达到108数量级，以1/10的接种量接种活化菌液于染料培养液中，3(TC静置培养，观察 培养液的颜色变化情况，每隔30分钟取10mL染料培养液于6 000 r/min离心去菌体，采用 DU640紫外分光光度计(BECKMAN)在580 nm处测定染料培养液中碱性品红(C. I. 42510)的 吸光值，并以不加菌的染料培养液为对照，计算染料降解率。得到菌株AN3对于浓度为50 mg/L 的碱性品红经14 h后的去除率达到90. 1%。
实施例5:
200 mL去离子水中添加Na2HP04 7H20 2. 56 g， KH2P04 0. 6 g ， NaCl 0. 1 g， NH4C1 0. 2 g，酸性大红(C. 1.27290) 0.01 g， 2lrc条件下灭菌20分钟作为染料培养液。把实施例1 得到的菌株AN3斜面接种至LB液体培养基中，于3(TC， 150 r/min条件下摇床活化菌体，使 细菌数达到108数量级，以1/10的接种量接种活化菌液于染料培养液中，3(TC静置培养，观察培养液的颜色变化情况，每隔30分钟取10 mL染料培养液于6 000 r/min离心去菌体，采 用DU640紫外分光光度计(BECKMAN)在503 nm处测定染料培养液中酸性大红(C. I. 27290) 的吸光值，并以不加菌的染料培养液为对照，计算染料降解率。得到菌株AN3对于浓度为50 mg/L的酸性大红经24 h后的去除率达到85. 1%。 实施例6:
200 mL去离子水中添加Na2HP04 7H20 2.56 g， KH2P04 0. 6 g ， NaCl 0.1 g， NH4C1 0.2 g，酸性苋菜红(C.I. 16185) 0.2 g， 2lrC条件下灭菌20分钟作为染料培养液。把实施例 1得到的菌株AN3的斜面接种至LB液体培养基中，于30'C， 150 r/min条件下摇床活化菌体， 使细菌数达到108数量级，以1/10的接种量接种活化菌液于各染料培养液中，3(TC静置培养， 观察各培养液的颜色变化情况，每隔30分钟分别取10 mL染料培养液于6 000 r/min离心去 菌体，采用DU640紫外分光光度计(BECKMAN)在477 nm处测定染料培养液中酸性苋菜红(C. I. 16185)的吸光值，并以相应的不加菌的染料培养液为对照，计算染料降解率。得到菌株AN3 对于浓度为50 rag/L的酸性苋菜红经12 h后的去除率达到93. 4%。
权利要求
1. 金黄短杆菌(Brevibacterium aureum)AN3 CGMCC No.2193。
2. 权利要求1所述的金黄短杆菌認3在降解三苯基甲垸染料和偶氮染料的应用。
3. 根据权利要求2所述的金黄短杆菌AN3在降解三苯基甲烷染料和偶氮染料的应用，所 述的三苯基甲烷染料是孔雀石绿、结晶紫、灿烂绿或碱性品红，所述的偶氮染料是酸性大红 GR或酸性苋菜红。
全文摘要
本发明涉及新菌株金黄短杆菌(Brevibacterium aureum)AN3 CGMCC No.2193，以及其在降解孔雀石绿等三苯基甲烷染料、偶氮染料方面的应用。本发明的金黄短杆菌AN3从广州某研究所处理印染废水的厌氧折流反应器系统的活性污泥进行分离、纯化而得，可以在25～37℃，pH 6.0～8.5，兼性厌氧条件下以去苯环脱毒的方式降解三苯基甲烷类染料，对目前造成水产品污染严重、以杀菌剂形式使用的孔雀石绿等三苯基甲烷类染料和偶氮类染料方都有显著的降解能力，其中对浓度为50mg/L的孔雀石绿8h内去除率为61.4％，16h内去除率为97.3％，其最高耐受浓度达到500mg/L，能有效解决水产养殖环境的孔雀石绿等的污染净化问题。
文档编号C12R1/13GK101412974SQ20071003087
公开日2009年4月22日 申请日期2007年10月17日 优先权日2007年10月17日
发明者任随周, 卫晋波, 孙国萍, 张培培, 曾国驱, 亮 陈, 陈进林 申请人:广东省微生物研究所