孔雀石绿残留快速检测试纸条的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种孔雀石绿残留快速检测试纸条。试纸条包括微孔试剂和试纸，微孔试剂中冻干有金标记抗孔雀石绿单克隆抗体，试纸底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护膜固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联孔雀石绿的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“‖”。试纸条具有以下优点：特异性强、敏感性高、操作简便、快速，结果显示形象、直观、准确，并且成本低，应用范围广，易于推广应用。
【专利说明】孔雀石绿残留快速检测试纸条
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种检测兽药的器具，特别是涉及一种孔雀石绿残留快速检测试纸条。
【背景技术】
[0002]孔雀石绿(Malachite Green, MG)又名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿和中国绿，为带有金属光泽的绿色结晶体，化学名称为四甲基代二氨基三苯甲烷，分子式为C23H25N2Cl，分子量为364.92，易溶于水、甲醇和乙醇，溶液呈蓝绿色。孔雀石绿是一种人工合成的三苯基甲烷类工业染料，主要用于制陶、纺织、皮革和食品等产业上的颜色剂和细胞化学上的染色剂等。孔雀石绿具有抗菌、杀虫等功效，是药用染料中抗菌效力较强的一类，被广泛用作驱虫剂和杀虫剂，以杀灭水产动物体外的寄生虫，原生动物和鱼卵中的霉菌等。孔雀石绿对防治水霉病等有特效，在水产养殖中曾大量使用。但近年来国内外的研究表明，孔雀石绿为潜在的致癌、致畸、致突变物质，而其代谢物无色孔雀石绿被确证具有高毒、高残留和三致作用，因此，孔雀石绿的使用污染水环境，其代谢物无色孔雀石绿对水生物及人体健康造成极大危害。美国、加拿大、日本、欧盟等许多国家都将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物，欧盟规定水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿总量不得超过2 μ g/kg，我国于2002年5月也将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中。
[0003]目前，测定孔雀石绿的主要方法是色谱分析方法(包括高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法)以及酶联免疫吸附(ELISA)法等。色谱技术是非常有效、准确、敏感的方法，但是待检样品需经一系列的预处理，繁琐费时，从样品预处理到得出检验结果至少需2?3天时间，检测费用很高；另一方面这种检测方法还必须有昂贵的仪器设备，只有特定的专业人员才能应用，而且每次检测的样品有限，不适应大批样品的筛查，严重阻碍了该检测方法的推广应用，更不适合于现场检验。ELISA也是一种常用的检测技术，它是以竞争性酶联反应为检测原理，检测全过程约需I?2小时。由于ELISA是一种敏感性很强的检测方法，不同的操作者往往会出现不同的结果，所以该方法常常造成人为的误检和漏检。因此在实际生产中亟需一种快速检测孔雀石绿的方法。目前各级食品检验部门，尤其是外贸出口单位，加强了孔雀石绿的检测力度，以确保人民群众的动物性食品安全。因此研制灵敏、快速、准确的孔雀石绿检测方法有着十分重要的意义。
实用新型内容
[0004]本实用新型的目的是提供一种特异、敏感、快速、简便的孔雀石绿残留快速检测试纸条。
[0005]本实用新型的技术方案:
[0006]一种孔雀石绿残留快速检测试纸条，包括微孔试剂和试纸，其特征在于:微孔试剂中冻干有金标记抗孔雀石绿单克隆抗体，试纸底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护膜固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联孔雀石绿的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“ Il ”，检测印迹位于距离测试端纤维层一侧5-8mm处，对照印迹位于距离检测印迹4_7mm处。
[0007]支撑层是用不吸水的硬质塑胶条或硬纸条制成，测试端纤维层用玻璃棉、尼龙膜、聚偏二氯乙烯膜或聚酯膜制成，纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成，吸水材料层用吸水纸制成，在测试端纤维层上覆盖有保护膜，保护膜上印制有样品标记线，微孔试剂上具有微孔塞。
[0008]本实用新型的孔雀石绿残留快速检测试纸条具有以下优点:
[0009](I)特异性强、灵敏度高。该试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率；另一方面金标记抗孔雀石绿单克隆抗体冻干在微孔试剂中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。因此，本实用新型试纸条具有较高的特异性和灵敏度，对孔雀石绿的检测灵敏度为2 μ g/L。
[0010](2)操作简便、快速。使用试纸条检测时无需任何其它试剂，只要将待检样品溶液滴加于微孔试剂中，混勻后，室温(20-25) °C孵育5min,将试纸标有样品标记线的一端向下，插入孵育后的微孔试剂中，室温(20-25) °C孵育5min，观察结果。
[0011](3)结果显示形象、直观、准确。检测试纸以显示红色“ I ”、“ Il ”印迹及两条红色“ I ”印迹深浅比较作为阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条红色“ I ”印迹或红色的检测印迹“ I ”弱于红色的对照印迹“ I ”，表示被检测样本液中孔雀石绿的含量高于或等于试纸条对孔雀石绿的最低检测限，红色的检测印迹“ I ”强于红色的对照印迹“ I ”或两条红色“ I ”印迹无差异，表示被检测样本中不含孔雀石绿或其含量低于试纸条对孔雀石绿的最低检测限，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不易出现误判。
[0012](4)成本低、投资少。使用本实用新型试纸条，不需另配仪器设备及其它试剂，随时随地进行检测，费用低廉，可节省大量贵重仪器及设备费用。
[0013](5)应用范围广，便于推广应用。试纸条操作简单，能较好满足不同层次人员的需要，如专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、水产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为本实用新型试纸结构示意图；
[0015]图2为本实用新型试纸俯视图；
[0016]图3为本实用新型微孔试剂图；
[0017]图4为本实用新型试纸条检测结果判定图。
【具体实施方式】
[0018]一、孔雀石绿残留快速检测试纸条的结构
[0019](I)试纸(图1、图 2)
[0020]图中I为测试端纤维层，用玻璃棉制成，2为纤维素膜层，采用硝酸纤维素膜，3为吸水材料层，用吸水纸制成，6为支撑层，用塑胶条制成，将编号1、2、3各层从左至右依次粘贴固定在支撑层6上，测试端纤维层I的末端与纤维素膜层2的始端相连，纤维素膜层2的末端与吸水材料层3相连，测试端纤维层I的始端与支撑层6的始端对齐，吸水材料层3的末端与支撑层6的末端对齐。在纤维素膜层2上，4为用偶联孔雀石绿的载体蛋白溶液印上检测印迹“ I ”，5为用羊抗鼠IgG溶液印上对照印迹“ I ”，两印记平行排列形成组合印迹带“ Il ”。7为覆盖在测试端纤维层上的保护膜，保护膜上印有箭头及MAX字样。
[0021](2)微孔试剂(图3)
[0022]图中8为微孔试剂，其中冻干有金标记抗孔雀石绿单克隆抗体，9为微孔塞。
[0023]二、检测样品液的制备
[0024]( I)用均质器均质组织样本；
[0025](2)称取1.0g±0.05g均质物至15ml新聚苯乙烯离心管中，加入Iml孔雀石绿提取剂I (3%氯化钠溶液)，加入100 μ I提取剂2 (0.lmol/L盐酸溶液)，加入100 μ I孔雀石绿提取剂3 (0.lmol/L硫酸溶液),润动Imin,,加入4ml孔雀石绿提取剂4 (分析纯乙腈)，涡动2min，再加入4g孔雀石绿净化剂(无水硫酸钠)，立即拧紧盖子，轻轻敲打，上下振荡，lmin，3000g 以上，室温(20_25°C /68-77 °F)离心 5min ；
[0026](3)取Iml上清液至IOml新聚苯乙烯离心管中，加入100 μ I孔雀石绿氧化剂[11倍浓缩的3%过氧化氢溶液，现加现配，用孔雀石绿提取剂4将11 X浓缩氧化剂按1:10体积比进行稀释(或按需量稀释)(I份IlX浓缩氧化剂+10孔雀石绿提取剂4，加入到2ml聚苯乙烯离心管中，混匀)]。涡动5s，于50?60°C水浴氮气流下吹干；
[0027](4)加入0.4ml复溶工作液(0.02mol/L磷酸缓冲液)涡动溶解2min，取100 μ I用于分析。
[0028]三、检测操作方法
[0029]从原包装(若低温存放需要预先平衡至室温)中取出所需数目的微孔试剂和试纸，并做好标记；用微量移液器吸取100 μ I待检水产样本溶液于微孔中，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀；室温(20-25°C)孵育5min后，将标记好的试纸插入微孔中——印有“MAX”线端朝下，使之充分浸入溶液中；再次室温(20-25°C)孵育5min，取出试纸，判定结果。
[0030]四、检测结果判断
[0031]孔雀石绿在样本中的含量高于或等于试纸条对其的最低检测限时，金标记抗孔雀石绿单克隆抗体与孔雀石绿结合，进而封闭金标抗体上的抗原结合位点，阻止金标抗体与纤维素膜层上偶联孔雀石绿的载体蛋白的检测印迹结合，不能显示检测印迹或检测印迹显色弱于对照印迹，而羊抗鼠IgG则可与金标抗体结合，形成对照印迹。阴性样本在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，检测印迹显色将会强于对照印迹或两者无差异，同样羊抗鼠IgG也与金标抗体结合,形成对照印迹。如图4所示。
[0032]阳性:对照印迹(C)显示一条红色条带，而检测印迹(T)显色明显弱于对照印迹(C)或不显色，判为阳性，如图4a、4b所示。
[0033]阴性:对照印迹(C)显示一条红色条带，检测印迹(T)显色强于对照印迹(C)或与对照印迹(C)显色无差异，判为阴性，如图4c、4d所示。
[0034]无效:对照印迹(C)不显示出红色条带，则无论检测印迹(T)显示出红色条带与否，该试纸均判为无效，如图4e、4f所示。[0035]五、检测试纸条中用到的材料制备方法
[0036]1、孔雀石绿与载体蛋白的偶联
[0037]孔雀石绿是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。
[0038](I)孔雀石绿半抗原的制备
[0039]取0.5g间羧基苯甲醒、1.3g无水氯化锌于干燥的圆底烧瓶中，加40ml无水乙醇，充分搅拌后，加入1.5ml N，N-二甲基苯胺，向装置内充入氮气，油浴加热，回流过夜。停止反应，冷却到室温，加lmol/L盐酸调节pH值到6，此时有大量沉淀物析出，抽滤，得绿色固体，用甲醇溶解，旋蒸浓缩，上硅胶柱，石油醚:乙酸乙酯=1:1洗脱得产品0.46g，经氢谱实验鉴定，结构正确。
[0040](2)免疫原的制备——孔雀石绿与牛血清白蛋白(BSA)的偶联
[0041]取13mg半抗原,溶解于Iml 二甲基甲酰胺(DMF)中；取20mg碳化二亚胺(EDC)用
0.2ml水充分溶解后加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A ;称取BSA30mg，使之充分溶解在2.8ml0.lmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.01mol/L PBS4°C透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20°C保存备用。
[0042](3)包被原的制备——孔雀石绿与卵清蛋白(OVA)的偶联
[0043]取13mg半抗原，溶解于Iml DMF中；取20mg EDC用0.2ml水充分溶解后加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A ;称取0VA30mg，使之充分溶解在
2.8ml0.lmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h,用0.01mol/L PBS4O透析3d,每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于_20°C保存备用。
[0044](4)孔雀石绿与载体蛋白偶联物的鉴定
[0045]将孔雀石绿半抗原、载体蛋白、孔雀石绿与载体蛋白的偶联物用PH7.4的PBS配成
0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L pH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200?800nm范围内扫描，得到孔雀石绿半抗原、载体蛋白、孔雀石绿与载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明孔雀石绿与载体蛋白偶联成功。
[0046]2、孔雀石绿单克隆抗体的制备
[0047]( I)动物免疫
[0048]将步骤I得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150 μ g/只，使其产生
抗血清。
[0049](2)细胞融合和克隆化
[0050]取免疫Balb/c小鼠脾细胞,按8:1 (数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选得到稳定分泌孔雀石绿单克隆抗体的孔雀石绿单克隆杂交瘤细胞株。
[0051](3)细胞冻存和复苏
[0052]将杂交瘤细胞用冻存液制成IX IO6个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37 °C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
[0053](4)单克隆抗体的制备与纯化
[0054]增量培养法:将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37°C条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，_20°C保存。
[0055]所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20% (质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为
0.2% (质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7.4。
[0056]3、羊抗鼠IgG的制备
[0057]以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠IgG0
[0058]4、金标记抗孔雀石绿单克隆抗体的制备
[0059](I)胶体金的制备
[0060]用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01% (质量百分含量)，取IOOml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5mll%柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4°C保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。
[0061](2)金标记抗孔雀石绿单克隆抗体的制备
[0062]在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入20?50 μ g的标准向胶体金溶液中加入上述孔雀石绿单克隆抗体，搅拌混匀，室温静置IOminJPA 10%BSA，使其在胶体金溶液中的终浓度为1% (体积百分含量)，静置IOmin0 12000r/min, 4°C离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4°c备用。
[0063]复溶缓冲液:含牛血清白蛋白0.1%?0.3%(体积百分含量)、吐温-800.05%?0.2%(质量百分含量)、PH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
[0064]5、将金标记抗孔雀石绿单克隆抗体冻干到微孔中
[0065]向微孔试剂微孔中加入100 μ I金标记抗孔雀石绿单克隆抗体，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50°C条件下，预冻3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到冻干有金标记抗孔雀石绿单克隆抗体的微孔试剂，密封保存。
[0066]6、测试端纤维层的制备
[0067]将玻璃棉置于含0.5%牛血清白蛋白(体积百分含量)、pH7.2,0.lmol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37°C烘2h备用。
[0068]7、纤维素膜层的制备
[0069]包被过程:用磷酸缓冲液将孔雀石绿与卵清蛋白的偶联物稀释到10mg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测印迹(T)，包被量为l.0yg/cm2;用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠IgG稀释到200 μ g/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的对照印迹(C)，包被量为l.0yg/cm2。将包被好的纤维素膜置于37°C条件下干燥2h，备用。
【权利要求】
1.一种孔雀石绿残留快速检测试纸条，包括微孔试剂和试纸，其特征在于:微孔试剂中冻干有金标记抗孔雀石绿单克隆抗体，试纸底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护膜固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联孔雀石绿的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“ Il ”。
2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于:检测印迹位于距离测试端纤维层一侧5-8mm处,对照印迹位于距离检测印迹4_7mm处。
3.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于:支撑层是用不吸水的硬质塑胶条或硬纸条制成。
4.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于:测试端纤维层用玻璃棉、尼龙膜、聚偏二氯乙烯膜或聚酯膜制成。
5.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于:纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。
6.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于:吸水材料层用吸水纸制成。
7.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于:在测试端纤维层上覆盖有保护膜，保护膜上印制有样品标记线。
8.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于:微孔试剂上具有微孔塞。
【文档编号】G01N33/577GK203502416SQ201320148188
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年3月28日 优先权日:2013年3月28日
【发明者】何方洋, 万宇平, 付军权, 聂雯莹, 杨昌松, 崔廷婷, 崔海峰, 冯月君 申请人:北京勤邦生物技术有限公司