专利名称：孔雀石绿快速检测方法及快速检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种孔雀石绿快速检测方法及快速检测试剂盒。
背景技术：
目前孔雀石绿的检测多采用高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法和气相色谱法。液相方法处理方法繁琐、花费时间较长，相对而言，气相色谱方法处理方法比较简单，但两者所用设备均比较昂贵，对实验人员的技术要求很高，不适宜现场检测，且所用试剂(乙腈)毒性很大。
现在市场上所采用的快速检测方法分为两种孔雀石绿固相萃取柱和酶联免疫试剂盒、试纸。就前者而言，多数厂家只在生产和销售用于水体中检测孔雀石绿的固相萃取柱，而水产品由于其基体成分非常复杂，前处理过程要求较高，而成为制约研发的难点。目前针对水产品进行孔雀石绿检测的厂家很少，并且操作步骤繁琐。
发明内容
本发明提供一种操作简单，分离效果好的孔雀石绿快速检测方法及快速检测试剂盒。
一种孔雀石绿快速检测方法，将待测样品与提取剂混合后静置，取上清液加入层析柱中，观察层析柱中最下层吸附剂颜色变化，若形成绿色环带，可判断样品中含有孔雀石绿；所述的提取剂为乙腈与乙酸乙酯混合液和酸性氧化铝，其中乙腈与乙酸乙酯体积比＝1∶15～30，优选1∶20。
所述的待测样品质量与乙腈与乙酸乙酯混合液的体积比为1∶3(m/v)；待测样品与酸性氧化铝的质量比为2∶1。
所述的层析柱在使用前用乙腈与乙酸乙酯混合液活化，乙腈与乙酸乙酯体积比＝1∶20。
所述的层析柱设有4块筛板，4块筛板间自下而上分别填充硅胶、衍生化剂、中性氧化铝，所述的衍生化剂为质量比1∶1的二氧化铅和硅藻土，硅胶、衍生化剂、中性氧化铝的质量比为5∶3∶3。
一种孔雀石绿快速检测试剂盒，包括提取剂1，提取剂1体积比组成为乙腈∶乙酸乙酯＝1∶20；提取剂2，酸性氧化铝；洗涤液，洗涤液体积比组成为乙腈∶乙酸乙酯＝1∶20；检测管1；检测管2；根据通常使用要求，所述的孔雀石绿快速检测试剂盒包括提取剂130mL，提取剂2，酸性氧化铝5g；洗涤液5mL，检测管150mL；检测管250mL；孔雀石绿层析柱。所述的孔雀石绿快速检测试剂盒还可以包括试剂盒类产品常配的吸耳球、1ml吸管、取样勺等。
所述的试剂盒的使用方法如下(1)取水产品可食部分充分绞碎后，准确称取10.0g于50mL检测管1中，加入提取剂1、2振摇10分钟，静置1分钟后，取上清液于检测管2中；(2)用2mL洗涤液活化层析柱，将检测管2中提取样液分次全部加入层析柱中，每次最大加液量为3mL；(3)让样液流至与层析柱最上层筛板平齐；(4)待样液全部过柱后，加入3mL洗涤液洗涤该柱；(5)观察层析柱中最下层吸附剂颜色变化，若该吸附剂逐渐形成绿色环带，可初步判断样品中含有孔雀石绿。
本发明采用乙腈-乙酸乙酯溶液提取，显著降低了所用试剂的毒性。如果只用乙酸乙酯，则所需的提取时间较长，而且乙酸乙酯极性较小，对隐色孔雀石绿的溶解性好，但对孔雀石绿的溶解性差；而添加少量的乙腈一方面可以穿透细胞膜，加快提取速度，另一方面，它对孔雀石绿的溶解性比乙酸乙酯要好，可以使水产品中的孔雀石绿提取更完全。
由于水产品中基体非常复杂，采用乙腈-乙酸乙酯溶液作为提取液，与乙腈作为提取液相比，可以减少极性较大的物质被提取出来，但它对脂肪的提取较多，为消除或降低脂肪的干扰，另外，本发明检测方法中使用了两次氧化铝，一次在提取过程中添加酸性氧化铝，可以抑制脂肪溶出，另一次在过层析柱时首先经过中性氧化铝柱，也可将脂肪吸附，所以本发明检测方法对脂肪含量较高的产品也具有较强的适用性。
另外，采用硅胶作为吸附剂，不但降低了成本，而且不必担心水产品本身的色素成分干扰显色，因为它们具有脂溶性，在硅胶上不能吸附，随样液可以随下，用洗涤液可将其洗涤下，不影响对柱体颜色的观察。
图1为本发明检测试剂盒中层析柱的结构示意图；具体实施方式
层析柱的制作柱体直径与5mL移液枪头直径等同，可制作针筒形状，长度不可太短，可与5mL移液枪头长度差不多，有刻度。最下层安装一个筛板(筛板1)，防止所填吸附剂流下。筛板1上添加柱层析用硅胶0.5g，填入后用吸耳球轻轻敲实。加入筛板2，该筛板与柱体的密封性要求要好，防止其上的衍生化剂粉末随样液流入吸附剂层，对最终的观察显色造成干扰。筛板2上添加衍生化剂(二氧化铅∶硅藻土＝1∶1)0.3g，轻轻敲实。然后，加入筛板3，并在其上添加0.3g中型氧化铝，最后加筛板4，防止在运输和放置过程中，柱中填料撒落丢失，影响使用效果(如下图)。要求筛板材料对孔雀石绿的吸附性要小，另外，填料的用量随柱体直径的改变需适当调整。方便添加各填料和添加样液检测限可以达到4ug/kg，此限量时可观察比较明显的绿色环带。
水产品中孔雀石绿的检测(1)将待测样品与提取剂混合后静置；提取剂为乙腈与乙酸乙酯混合液和酸性氧化铝，其中乙腈与乙酸乙酯体积比＝1∶20，待测样品质量与乙腈与乙酸乙酯混合液的体积比为1∶3(m/v)，待测样品与酸性氧化铝的质量比为2∶1。取实施例1中制备的层析柱，用2mL乙腈与乙酸乙酯混合液活化，乙腈与乙酸乙酯体积比＝1∶20。取上清液加入层析柱中，观察层析柱中最下层吸附剂颜色变化，若该吸附剂逐渐形成绿色环带，可判断样品中含有孔雀石绿；
水产品中孔雀石绿的检测(2)将待测样品与提取剂混合后静置；提取剂为乙腈与乙酸乙酯混合液和酸性氧化铝，其中乙腈与乙酸乙酯体积比＝1∶15，待测样品质量与乙腈与乙酸乙酯混合液的体积比为1∶3(m/v)，待测样品与酸性氧化铝的质量比为2∶1。取实施例1中制备的层析柱，用2mL乙腈与乙酸乙酯混合液活化，乙腈与乙酸乙酯体积比＝1∶20。取上清液加入层析柱中，观察层析柱中最下层吸附剂颜色变化，若该吸附剂逐渐形成绿色环带，可判断样品中含有孔雀石绿；试剂盒的使用试剂盒的组成为提取剂1 30mL，提取剂1体积比组成为乙腈∶乙酸乙酯＝1∶20；提取剂2，酸性氧化铝5g；洗涤液5mL，洗涤液体积比组成为乙腈∶乙酸乙酯＝1∶20；检测管150mL；检测管250mL；孔雀石绿层析柱；吸耳球。
操作步骤如下(1)取水产品可食部分充分绞碎后，准确称取10.0g于50mL检测管1中，加入提取剂1和提取剂2振摇10分钟，静置1分钟后，取上清液于检测管2中；(2)用2mL洗涤液活化层析柱，将检测管2中提取样液分次全部加入层析柱中，每次最大加液量为3mL，用吸耳球从上口加压，加快流速，3mL样液通过柱子的时间为0.5分钟；(3)让样液流至与层析柱最上层筛板平齐；(4)待样液全部过柱后，加入3mL洗涤液洗涤该柱；(5)观察层析柱中最下层吸附剂颜色变化，若该吸附剂逐渐形成绿色环带，可判断样品中含有孔雀石绿。
权利要求
1.一种孔雀石绿快速检测方法，其特征在于将待测样品与提取剂混合后静置，取上清液加入层析柱中，观察层析柱中最下层吸附剂颜色变化，若形成绿色环带，可判断样品中含有孔雀石绿；所述的提取剂为乙腈与乙酸乙酯混合液和酸性氧化铝，其中乙腈与乙酸乙酯体积比＝1∶15～30，所述的待测样品质量与乙腈与乙酸乙酯混合液的体积比为1∶3；待测样品与酸性氧化铝的质量比为2∶1。
2.如权利要求1所述的孔雀石绿快速检测方法，其特征在于所述的提取剂中乙腈与乙酸乙酯体积比＝1∶20。
3.如权利要求1或2所述的孔雀石绿快速检测方法，其特征在于所述的层析柱在使用前用乙腈与乙酸乙酯混合液活化，乙腈与乙酸乙酯体积比＝1∶20。
4.如权利要求1所述的孔雀石绿快速检测方法，其特征在于所述的层析柱设有4块筛板，4块筛板间自下而上分别填充硅胶、衍生化剂、中性氧化铝，所述的衍生化剂为质量比1∶1的二氧化铅和硅藻土，硅胶、衍生化剂、中性氧化铝的质量比为5∶3∶3。
5.一种孔雀石绿快速检测试剂盒，其特征在于包括提取剂1，提取剂1体积比组成为乙腈∶乙酸乙酯＝1∶20；提取剂2，酸性氧化铝；洗涤液，洗涤液体积比组成为乙腈∶乙酸乙酯＝1∶20；检测管1；检测管2；孔雀石绿层析柱。
6.如权利要求5所述的孔雀石绿快速检测试剂盒，其特征在于还包括吸耳球、吸管、取样勺。
7.如权利要求5或6所述的孔雀石绿快速检测试剂盒的使用方法(1)取水产品可食部分充分绞碎后，称取10.0g于50mL检测管1中，加入提取剂1、2振摇10分钟，静置1分钟后，取上清液于检测管2中；(2)用2mL洗涤液活化层析柱，将检测管2中提取样液分次全部加入层析柱中，每次最大加液量为3mL；(3)让样液流至与层析柱最上层筛板平齐；(4)待样液全部过柱后，加入3mL洗涤液洗涤该柱；(5)观察层析柱中最下层吸附剂颜色变化，若该吸附剂逐渐形成绿色环带，可初步判断样品中含有孔雀石绿。
全文摘要
本发明公开了一种孔雀石绿快速检测方法，将待测样品与提取剂混合后静置，取上清液加入层析柱中，观察层析柱中最下层吸附剂颜色变化，若形成绿色环带，可判断样品中含有孔雀石绿；提取剂为乙腈与乙酸乙酯混合液和酸性氧化铝，其中乙腈与乙酸乙酯体积比＝1∶15～30，所述的待测样品质量与乙腈与乙酸乙酯混合液的体积比为1∶3；待测样品与酸性氧化铝的质量比为2∶1。本发明采用乙腈－乙酸乙酯溶液提取，使水产品中的孔雀石绿提取更完全并且显著降低了所用试剂的毒性，对脂肪含量较高的产品也具有较强的适用性。
文档编号G01N30/00GK101067619SQ200710068348
公开日2007年11月7日 申请日期2007年4月27日 优先权日2007年4月27日
发明者沈建福, 张岳, 李蕾蕾, 陈秋平 申请人:浙江大学, 杭州安达生物科技有限公司