专利名称：一种电化学发光检测孔雀石绿的方法
技术领域：
本发明属于一种高灵敏电化学发光检测领域，具体涉及一种电化学发光检测孔雀 石绿(无色孔雀石绿)的方法。
背景技术：
孔雀石绿是有毒的三苯甲烷类化学物，既是染料，也是杀菌剂。孔雀石绿可致癌， 很多国家已经禁用。孔雀石绿价格低廉，治疗鱼病效果好，尤其是对治疗水霉病和小瓜虫病 有特效，而在其病防领域没有合适的替代药物出现，因此，仍有渔民在防治鱼类感染真菌时 使用，也有运输商用作消毒，以延长鱼类在长途贩运中的存活时间等，加上使用者对孔雀石 绿的危害认识不足，所以导致孔雀石绿禁而不止。研究表明，孔雀石绿的代谢物无色孔雀石 绿在鱼体内存留的时间更长。因此，开发一种简单、高效的孔雀石绿(无色孔雀石绿)的检 测方法具有十分重要的意义。目前孔雀石绿(无色孔雀石绿)的检测方法主要以理化检测法和免疫学检测法 为主(刘海新，张农，钱卓真，福建水产，2007(1)，42 45)。理化检测法包括以下几种 高效液相色谱法(HPLC)可以检测生物体内及其他复杂基质中的孔雀石绿和无色孔雀石 绿(如饲料原料、化工原料等)，此方法的特点是灵敏度较高。高效液相色谱串联质谱法 (HPLC-MS-MS)是近年来发展起来的新的检测技术，该方法兼具定性功能、灵敏度高，但仪器 价格昂贵。还有薄层色谱法(侯云龙，中国刑警学院，1997 (4)，19 20)，普通分光光度法 (Safarik I. ,Kova M. ,Water Research，2000，36，196 200)等。薄层色谱法虽然具有简 便快速的特点，但是不能同时检测孔雀石绿的代谢物无色孔雀石绿。分光光度法普通分光 光度法检测限较高，灵敏度较低，准确性较差，也不能用于代谢物无色孔雀石绿的检测，而 且仅仅局限于水样的检测，尚未见该方法在复杂样品基质中的应用，仅可用于孔雀石绿原 料药等的测定。免疫学检测法是指酶联免疫法(ELISA)，可分为间接竞争抑制法、抗体/抗 原包被直接竞争法和夹心法。采用酶联免疫试剂盒检测水产品中孔雀石绿的特点是检测 速度快，2 3小时就可检测一批样品；灵敏度高，该方法特别适合大批量样品的筛选。虽 然ELISA法的抗原和抗体结合有较强的选择性，但水产品的种类繁多，基质复杂，检测结果 的假阳性几率高。因此，用该方法检出的阳性样还需用高压液相色谱法或液相色谱质谱联 用法进行定量和确证。三联吡啶钌Ru(bpy)32+ 电化学发光(Electrochemiluminescence，简称 ECL)具有 原位响应、检测灵敏度高、线性范围宽和仪器简单等优点，在药物分析、氨基酸分析、DNA探 针分析、酶生物传感器领域得到了广泛应用。但目前还没有任何将电化学发光用于孔雀石 绿(无色孔雀石绿)检测的相关报道。我们采用的电化学发光法检测孔雀石绿(无色孔雀 石绿)能达到更低的检测限和更宽的检测范围，操作比较简单，检测速度快。
发明内容
本发明的目的是针对现有的孔雀石绿检测方法，提出一种全新的检测限更低、检测线性范围更宽、灵敏度更高的电化学发光检测孔雀石绿(无色孔雀石绿)的方法。本发明的原理是本发明使用联吡啶钌类化合物作为发光物质，孔雀石绿(无色 孔雀石绿)作为共反应物之一，同时也是被检测物。将它们分别溶于磷酸或硼酸缓冲溶液 中，用电化学方法在0-1. 8V电位范围内对其进行扫描；同时利用光检测器采集产生的光信 号，经数据处理得到检测结果。由于联吡啶钌类化合物具有很高的发光效率，即使被测物孔 雀石绿(无色孔雀石绿)的浓度很低，该方法仍可检测到明显电化学发光响应，并且孔雀石 绿(无色孔雀石绿)加入前后体系电化学发光强度的变化与体系中孔雀石绿(无色孔雀石 绿)浓度的对数值呈现良好的线性关系，通过计算可以确定体系中孔雀石绿(无色孔雀石 绿)的含量。为达到上述目的，本发明的技术方案是一种电化学发光检测孔雀石绿(无色孔 雀石绿)的方法，步骤如下(1)根据孔雀石绿(无色孔雀石绿)样品浓度，将10_7 liTmol/L的联吡啶钌以 及待测的孔雀石绿(无色孔雀石绿)样品分别加入到PH值为3-11的0. IM的磷酸盐或硼 酸盐缓冲溶液中；(2)在任意一款电化学工作站上，对步骤(1)配置的溶液进行扫描；扫描电位范围 0-1. 8V ；(3)所述的联吡啶钌包括单核三联吡啶钌、以及通过不同长度碳链连接的双核三
联吡啶钌，其代表性结构式如下
权利要求
1.一种电化学发光检测孔雀石绿的方法，其特征在于，该方法步骤如下(1)根据孔雀石绿样品浓度，将10_7 IO-1Hi0VL的联吡啶钌和待测的孔雀石绿样品分 别加入到PH值为3-11的0. IM磷酸盐或硼酸盐缓冲溶液中；(2)在电化学工作站上，对步骤(1)配置的溶液进行扫描；扫描电位范围0-1.8V ；(3)用光检测器采集电化学工作站扫描产生的光信号，经数据处理后得到样品中孔雀 石绿的含量。
2.根据权利要求1所述的一种电化学发光检测孔雀石绿的方法，其特征在于，该方法 适用于检测所有含有孔雀石绿的物质，以及孔雀石绿的代谢产物。
3.根据权利要求1所述的一种电化学发光检测孔雀石绿的方法，其特征在于，所述的 电化学工作站为任意一款电化学工作站和/或发光检测器。
4.根据权利要求1所述的一种电化学发光检测孔雀石绿的方法，其特征在于，所述的 联吡啶钌包括单核三联吡啶钌、以及通过不同长度碳链连接的双核三联吡啶钌，其代表性 结构式如下联吡啶钌
全文摘要
本发明属于一种高灵敏电化学发光检测领域，具体涉及一种电化学发光检测孔雀石绿的方法。将一定量的联吡啶钌配合物和孔雀石绿溶于磷酸或硼酸缓冲溶液中，用电化学方法在0-1.8V电位范围内对其进行扫描；分别用单核三联吡啶钌和双核三联吡啶钌检测孔雀石绿，单核钌所能达到的检测范围在1×10-8～1×10-5mol/L，最低检测限在1×10-8mol/L，而双核钌所能达到的检测范围在1×10-12～1×10-8mol/L，最低检测限在1×10-12mol/L。本发明能够更加有效的检测孔雀石绿，检测限更低，检测线性范围更宽，灵敏度高，重现性好，测试可在瞬间完成。
文档编号G01N21/76GK102004099SQ20101028844
公开日2011年4月6日 申请日期2010年9月17日 优先权日2010年9月17日
发明者刘凤玉, 孙世国, 杨雪 申请人:大连理工大学