一种新型现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒，其特征是：检测试剂盒包括测试条和液滴瓶；测试条有反应槽，反应槽是经孔雀石绿抗体包被过的，液滴瓶内装有示踪液，阳性对照液，阴性对照液，显色液；示踪液含有预标记的孔雀石绿，能特异地与孔雀石绿抗体结合。本实用新型具有结构简单，操作易捷，检测准确，灵敏度高，可用于现场检测等优点；本实用新型实现在一次实验中同时测定样品、阳性对照和阴性对照，从而能更准确地界定检测结果和有效性。
【专利说明】一种新型现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型属于免疫检测【技术领域】，特别是涉及一种新型现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒。
【背景技术】
[0002]孔雀石绿，孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，又名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿，其既是杀真菌剂，又是染料，易溶于水，溶液呈蓝绿色；
[0003]孔雀石绿的英文名称为:MalachiteGreenoxalate (别名:Malachite Greenchloride ；N, N, Nj, Nj -TetramethylK -diaminotriphenylcarbenium chloride ；BasicGreen4)，CAS号:569_64_2，分子式:C23H25C1N2，分子量:364.92。孔雀石绿可用作治理鱼类或鱼卵的寄生虫、真菌或细菌感染。用作抑菌剂或杀阿米巴原虫剂；对脂鲤和鲶鱼等海产动物来说，有高度毒性、高残留等副作用。孔雀石绿中的化学功能团三苯甲烷可致癌，很多国家已经禁用，但仍有渔民在防治鱼类感染真菌时使用，也有运输商用作消毒，以延长鱼类在长途贩运中的存活时间。研究发现，孔雀石绿在鱼内残留时间长，且其具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用，鉴于此，许多国家均将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。2002年5月中国农业部已将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》。
[0004]目前，检测孔雀石绿的主要方法分别为肉眼辨别法，液相色谱法，酶联免疫法和试纸条检测法。肉眼检测，不够准确，缺乏执法依据；液相色谱法检测速度慢，检测成本高，技术要求必需是专业人员，特别是不能现场检测，严重的影响了国家职能部门的执法力度和效率；利用具有高度专一性的抗体设计的孔雀石绿酶联免疫法(ELISA)也是目前最常用的孔雀石绿检测方法，该法适合在一般实验室里进行，检测程序较多还需要特殊的读盘仪器，得由专业技术人员执行，也不适合现场快速检测；试纸条检测法，适合现场快速检测，但因灵敏度低且没有同时进行阳性和阴性对照，容易造成假阳性或假阴性等缺点。
【发明内容】
[0005]本实用新型为解决上述公知技术中存在的问题而提供一种新型现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒。
[0006]本实用新型的目的是提供一种操作简单，准确快速，灵敏度高，而且又能进行阳性和阴性对照检测的现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒。
[0007]本实用新型现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒，包括一个测试条，示踪液，阳性对照液，阴性对照液；所述的测试条含有多个反应槽，所述的反应槽是事先经孔雀石绿抗体包被，封闭液封闭过的；所述的示踪液、阳性对照液，阴性对照液是装在液滴瓶内；所述的示踪液含有预标记的孔雀石绿能特异地与包被在检测槽中的孔雀石绿抗体结合。
[0008]本实用新型现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒所采取的技术方案是:
[0009]一种新型现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒，其特征是:检测试剂盒包括测试条和液滴瓶；液滴瓶内装有示踪液，阳性对照液，阴性对照液，显色液；测试条含有三个或以上反应槽，可用于同时检测阳性对照，阴性对照和一个或一个以上的样品；反应槽是经孔雀石绿抗体抗体包被，封闭液封闭过的；示踪液含有预标记的孔雀石绿，能特异地与包被在检测槽中的孔雀石绿抗体或结晶紫抗体结合。
[0010]本实用新型现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒还可以采用如下技术方案:
[0011]所述的现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒，其特征是:检测试剂盒还含有装有显色液的液滴瓶。
[0012]所述的现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒，其特征是:检测试剂盒还含有塑料吸管。
[0013]所述的现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒，其特点是:示踪液含有预标记的孔雀石绿能直接或间接产生肉眼可见颜色的胶体金、碱性磷酸酶或过氧化氢酶。
[0014]所述的现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒，其特点是:显色液是示踪液中的孔雀石绿标记酶的底物。
[0015]所述的现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒，其特点是:阳性对照液含孔雀石绿，所述孔雀石绿能与示踪液中预标记的孔雀石绿竞争性地与包被在反应槽中的孔雀石绿抗体结合。
[0016]所述的现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒，其特点是:阴性对照液含有缓冲液，不含孔雀石绿。
[0017]本实用新型具有的优点和积极效果是:
[0018]现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒由于采用了本实用新型的技术方案，与现有技术相比，具有结构简单，使用方便，不需要仪器就能检测，检测灵敏度比免疫层析试纸条高出十倍以上等优点。
[0019]本实用新型实现了在一次现场用免疫检测实验中，能同时测定样品，阳性对照和阴性对照，避免了使用免疫层析试纸条时可能隐藏的假阴性和假失效的结果，因此，能更正确地界定检测结果及有效性。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1是本实用新型现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒结构示意图。
[0021]图中，1、测试条，2、示踪液，3、阳性对照液，4、阴性对照液。
【具体实施方式】
[0022]为能进一步了解本实用新型的内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下:
[0023]参阅附图1。
[0024]实施例1
[0025]一种新型现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒，包括测试条和液滴瓶；液滴瓶内装有示踪液，阳性对照液，阴性对照液；测试条有多个反应槽，反应槽是经孔雀石绿抗体包被，封闭液封闭过的；示踪液含有胶体金预标记的孔雀石绿。
[0026]示踪液中胶体金标记的孔雀石绿能特异性地与包被在反应槽中的孔雀石绿抗体口 ?[0027]阳性对照液含孔雀石绿能与示踪液中胶体金标记的孔雀石绿竞争，消弱胶体金标记的孔雀石绿与包被在反应槽中的孔雀石绿抗体结合；
[0028]阴性对照液含有阴性缓冲液；阴性缓冲液中不含孔雀石绿。
[0029]本实施例的具体实施过程:
[0030]如图1所示，一种新型现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒，包括:装在塑料真空袋里的4条测试条⑴和装在液滴瓶里的示踪液(2)，阳性对照液(3)及阴性对照液⑷各I瓶。
[0031]测试条是成形塑胶条，每个测试条含有8个反应槽可用于同时测定阳性对照，阴性对照以及1-6个待测样品。反应槽是事先经含l-10ng/ml孔雀石绿抗体的PBS缓冲液包被后，用2% BSA封闭液封闭过的。
[0032]示踪液是胶体金预标记的孔雀石绿(10ng/ml)溶解在含I % BSA的PBS缓冲液。
[0033]阳性对照液是含0.5ng/ml孔雀石绿，溶解在含I % BSA的PBS缓冲液。
[0034]阴性对照液是含I % BSA的PBS缓冲液，不含孔雀石绿。
[0035]实施例2
[0036]一种新型现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒，包括一个测试条，示踪液，阳性对照液，阴性对照液，显色液和塑料吸管；测试条含有多个反应槽，所述的反应槽是事先经孔雀石绿抗体抗体包被，封闭液封闭过的；示踪液含有预标记的孔雀石绿抗体。
[0037]本实施例的具体实施过程:
[0038]测试条制备:选择具有固定形状，含有可盛装液体的多个反应槽，常温常压下化学性质稳定不与待测的样品及检测系统中的物质发生化学反应的成形板。所述的反应槽与蛋白类分子有高亲和力。用IOOmM Tris-HCl (pH8)缓冲液将孔雀石绿抗体稀释至0.l_30ug/ml，取100微升(每个槽)添加于测试条的槽中，静置I小时或以上；洗槽后用150微升(每个槽)2%牛血清蛋白-PBS缓冲液封闭I小时或以上，再次洗槽后，于45度。C烘干，用铝箔袋真空包装，置于冰箱备用。所述的孔雀石绿抗体可以是单克隆的孔雀石绿抗体也可以是多克隆的孔雀石绿抗体，所述的特异性抗体可以从市场购得也可以按公知的抗体制备方法来获得。
[0039]示踪液制备:将过氧化氢酶标记的孔雀石绿，用I %牛血清蛋白-PBS缓冲液释至
0.01-5000ng/ml，无菌过滤后装在液滴瓶里，置于冰箱备用。
[0040]阳性对照液制备:所述的阳性对照液含孔雀石绿。将孔雀石绿用1%牛血清蛋白-PBS缓冲液释成0.01-5ng/ml，无菌过滤后装在液滴瓶里，置于冰箱备用。
[0041]阴性对照液制备:所述的阴性对照液含有I %牛血清蛋白-PBS缓冲液，该阴性缓冲液不含孔雀石绿，无菌过滤后装在液滴瓶里，置于冰箱备用。
[0042]显色液制备:将TMB溶解于用50mM柠檬酸缓冲液(pH4.5)，调浓度至0.2mg/ml，再加过氧化氢至0.03%，无菌过滤后装在避光液滴瓶里，置于冰箱备用。
[0043]本实施例新型现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒的检测过程，包含下述几个步骤:
[0044]I)加样反应:取一测试条，给每个反应槽作记号，如:反应槽1-8 ;在各反应槽中加入3滴示踪液，再分别在反应槽I和反应槽2中加入2滴阳性对照液和2滴阴性对照液，用不同的塑料吸管分别吸取不同待测样品，在反应槽3-8中分别滴加2滴待测样品，轻晃混匀后室温下静置5-30分钟。
[0045]2)洗涤:倒掉反应槽中液体并用过滤水(或自来水)冲洗反应槽5次或以上；每次冲洗后，将反应槽倒向摔在吸水纸(如卫生纸)上以除去反应槽内水珠。
[0046]3)显色:在每个反应槽内加入6滴显色液，轻晃测试条并观察反应槽中颜色变化，直至阴性反应槽内有清晰的颜色出现，
[0047]4)结果分析:比较各反应槽(阳性对照，阴性对照和各样品)的颜色深浅程度以确定该被检样品是阳性还是阴性。
[0048]由于阳性对照或阳性样品中孔雀石绿能与示踪液中预标记的孔雀石绿相互竞争地与反应槽上孔雀石绿抗体结合，而阴性对照不能；因此，正常情况下阳性样品不显色，阴性显色。如果被检样品的颜色明显比阴性对照浅，说明该被检样品为阳性；如果被检样品的颜色与阴性对照相同或更深说明该被检样品为阴性；如果被检样品的颜色比阴性对照稍浅，比阳性对照深说明该被检样品为阳性，其孔雀石绿浓度低于阳性对照；如果被检样品的颜色比阳性对照更浅，说明该被检样品为强阳性；如果阳性对照的颜色与阴性对照相同或更深说明该实验失败。
[0049]本实施例具有结构简单，快捷方便，检测灵敏度高等特点，实现在一次实验中同时测定样品，阳性对照和阴性对照，从而能正确地界定检测结果和有效性。
【权利要求】
1.一种新型现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒，其特征是:所述检测试剂盒包括测试条和液滴瓶；所述测试条含有经孔雀石绿抗体包被且经封闭液封闭过的反应槽，所述液滴瓶包括:示踪液滴瓶、阳性对照液滴瓶和阴性对照液滴瓶。
2.根据权利要求1所述的现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒，其特征是:测试条含有三个或以上反应槽，可用于同时检测阳性对照，阴性对照和一个或一个以上的样品。
3.根据权利要求1所述的现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒，其特征是:所述检测试剂盒还含有装有显色液的液滴瓶。
4.根据权利要求1所述的现场用高灵敏度孔雀石绿速测试剂盒，其特征是:所述检测试剂盒还含有塑料吸管。
【文档编号】G01N21/78GK203502353SQ201320034175
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年1月23日 优先权日:2013年1月23日
【发明者】邹潮, 关靖 申请人:邹潮, 关靖