专利名称：检测孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的单抗及酶联免疫方法与试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能识别孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的单克隆抗体及一种用于检测孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的酶联免疫方法与试剂盒。
背景技术：
孔雀石绿、结晶紫属于三苯甲烷类染料，可用作杀菌、驱虫剂，是药用染料中抗菌效力较强的一类。由于孔雀石绿和结晶紫具有潜在的致癌性，已被许多国家禁用，但是目前还存在非法使用的现象，因此很有必要加强对于该药的检验监测。孔雀石绿和结晶紫可分别代谢为无色孔雀石绿及无色结晶紫，目前，对于孔雀绿、 结晶紫及其代谢物残留检测的方法主要是高效液相色谱法，该方法虽然灵敏、准确，但样品前处理繁琐、检测时间长、耗资大、技术性要求高，且要有昂贵的仪器，不适合大量样品的高通量检测。酶联免疫检测方法(ELISA)是利用免疫反应(即抗原-抗体结合反应)的高度特异性和酶促反应的高度敏感性对药物进行定性和定量分析的一种综合性检测技术，它具有操作简便、高通量、高灵敏度、低费用等优点，能克服仪器检测方法的不足之处。申请号为200810202733. 8的中国专利公开了一种检测孔雀石绿的酶联免疫试剂及方法，该发明采用活泼酯法将孔雀石绿半抗原分别与钥孔槭血蓝蛋白和牛丙种球蛋白偶联得到免疫原和包被原，所得到的酶联免疫试剂及方法仅能检测孔雀石绿，无法检测其代谢产物及结晶紫的代谢产物。申请号为200910058317. X的另一篇中国专利公开了测定水样及水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿总量的酶联免疫吸附分析方法，其特点是合成氨基无色孔雀石绿作为半抗原，分别与牛血清白蛋白和卵清蛋白偶联得到免疫原和包被原，通过免疫动物获得多克隆抗体，该发明所采用的半抗原合成方法复杂，涉及到加氢等比较危险的反应体系。
发明内容
本发明的第一个目的是对孔雀石绿半抗原进行结构改造，合成对_[3-(羧基)丙氧基]无色孔雀石绿作为半抗原，进而提供出一种能识别孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫的单克隆抗体。本发明的第二个目的是利用所述该单克隆抗体，建立一种能用于孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫检测的酶联免疫方法。本发明的第三个目的是提供一种检测孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫的酶联免疫试剂盒。本发明的第四个目的是提供所述单克隆抗体在制备检测孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的酶联免疫试剂盒中的应用。本发明的第五个目的是提供包含所述单克隆抗体的试剂盒在动物源性食品中孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫检测中的应用。
本发明通过以下技术方案实现一种能识别孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO C201143的杂交瘤细胞4B10所分泌的。上述杂交瘤细胞4B10，保藏在位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO C201143o所用的免疫原是由半抗原对-[3-(羧基)丙氧基]无色孔雀石绿与人血清白蛋白偶联制备的。进一步，本发明提供了一种用于孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫检测的酶联免疫方法，包括以下步骤(I)将半抗原对_[3-(羧基)丙氧基]无色孔雀石绿(LMG-HEO)与人血清白蛋白 (HSA)偶联得到免疫原(LMG-HE0-HSA)；(2)将半抗原对-[3-(羧基)丙氧基]无色孔雀石绿(LMG-HEO)与卵清蛋白(OVA) 偶联得到包被原(LMG-HE0-0VA)；(3)利用步骤(I)的免疫原免疫小鼠，通过细胞融合与筛选得到保藏号为CCTCC NO C201143的杂交瘤细胞4B10 ；(4)用保藏号为CCTCC NO C201143的杂交瘤细胞4B10制备单克隆抗体；(5)用步骤⑵的包被原包被固相载体(如酶标板)；(6)取均质好的组织样品，用乙腈超声提取、离心，取乙腈层用氮气吹干，残渣用含 O. 05体积％吐温20的IOmM PH为7. 4的三羟甲基胺基甲烷-HCl溶液(Tris-HCl溶液)溶解，得到待测物； (7)取待测物进行ELISA检测。步骤(6)含O. 05体积％吐温20的IOmM PH为7. 4的三羟甲基胺基甲烷-HCl溶液(Tris-HCl溶液)的配制方法为准确称取三羟甲基胺基甲烷(Tris)1.211g，加入少量水搅拌溶解完全，至950mL，搅拌条件下用浓盐酸调pH值至7. 4，再加O. 5mL吐温20溶解， 定容至1000mL。本发明以上述单克隆抗体和包被原作为核心试剂与常规的其他试剂组合，制成了能检测孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫的酶联免疫试剂盒，结合上述酶联免疫方法， 实现了对动物可食性组织中孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫的酶联免疫检测。本发明的主要优点是I.本发明制备的单克隆抗体能同时检测孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫， 识别范围广，灵敏度高。2.本发明设计的半抗原合成工艺简便、效率高，所用的主要有机试剂避免了高毒性，对操作者身体健康危害小。3.本发明所使用的人工抗原载体为人血清白蛋白，在现有专利和文献中未见报道和使用，免疫效果优于牛血清白蛋白做载体的免疫原。4.本发明涉及的ELISA检测方法以含O. 05体积％吐温20的IOmM PH为7. 4的 Tris-HCl溶液为标准品稀释液和样品稀释液，对待测物的溶解性好，所得标准曲线线性好， 检测结果的准确度和精密度好。
图I为本发明免疫原LMG-HE0-HSA的MALDI-T0F/T0F图谱。图2为本发明载体蛋白HSA的MALDI-T0F/T0F图谱。图3为本发明的单克隆抗体与无色结晶紫标准品的间接竞争ELISA反应曲线，X轴为孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫三种标准溶液浓度对数值，Y轴为孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫三种标准品溶液的光密度值除以“O”孔光密度值(B/Bd。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步说明。实施例I半抗原的制备I. I合成对-[3_(乙基羧基)丙氧基]苯甲醛干燥处理取一瓶N，N- 二甲基甲酰胺(DMF) 500ml加无水硫酸钠60g，震荡，静置过夜，减压过滤，收集干燥后的DMF于一干燥的IOOOml单口瓶,密封,置干燥阴凉处备用。药品称量准确称取4-羟基-苯甲醛34g，碳酸钾28g，4_溴丁酸乙酯68g。羟基烷基化反应将以上称取的三种药品一起加入到200ml干燥DMF中，110°C回流反应过夜。静置至室温，过滤，滤液用乙酸乙酯提取，抽真空干燥。获得具有水果清香味的无色油状液体，即为对-[3_(乙基羧基)丙氧基]苯甲醛。I. 2合成对-[3_(乙基羧基)丙氧基]无色孔雀石绿称量准确称(量)取步骤I所获的对_[3-(乙基羧基)丙氧基]苯甲醛Sg，N， N 二甲苯胺30ml，对甲苯磺酸15g。傅克反应将以上称量的三种物质混合，120°C搅拌反应过夜。静置至室温，加 13g固体碳酸钾中和反应体系。乙酸乙酯提取后，抽真空干燥。得到橙色油状物，即为对-[3-(乙基羧基)丙氧基]无色孔雀石绿。柱色谱纯化采用湿法填柱进样，以乙酸乙酯正己烷=I 6为流动相纯化上述得到的对-[3_(乙基羧基)丙氧基]无色孔雀石绿。I. 3合成对-[3-(羧基)丙氧基]无色孔雀石绿称量准确称(量)取步骤2所获的对-[3_(乙基羧基)丙氧基]无色孔雀石绿 6g，甲醇四氢呋喃=3 2混合溶液300ml，4N NaOH溶液50ml。皂化反应将以上称量的物质混合，室温搅拌反应过夜(16小时)。真空除掉有机溶剂部分，吸出水层底部的少量油滴，用乙酸乙酯正己烷=I 4萃洗，弃正己烷层，静置于4°C，待溶液中出现大量亮色薄片状物质时，过滤，得到肉黄色粘土状粗品。将其均匀铺开，静置干燥。用研钵磨细，得到蓝绿色固体，即为对-[3_(羧基)丙氧基]无色孔雀石绿 (LMG-HEO)。实施例2免疫原和包被原的制备2. I药物羧基端的活化药品称量准确称取LMG-HEO 80mg, I，3_ 二环己基碳二亚胺(DCC) 20mg，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 11. 5mg。药物羧基端的活化将以上称取的三种药品置于IOmL反应瓶中，加入DMF3mL和磁力搅拌子，室温避光搅拌反应16小时，过滤，取滤液(此为A液)备用。
2. 2载体蛋白溶液配制称量准确称(量)取O. IM pH 8. 5的碳酸氢钠溶液16mL，人血清白蛋白 (HSA) IOOmg 或者卵清蛋白(OVA) 100. mg。制备B液将HSA IOOmg溶解到O. IM pH8. 5的碳酸氢钠溶液16mL中，加入磁力搅拌子，此为B液。制备C液将OVA 100. mg溶解到O. IM ρΗ8· 5的碳酸氢钠溶液16mL中，加入磁力搅拌子，此为C液。2.3人工抗原制备免疫原的制备将实施例2. I制备的A液逐滴加到实施例2. 2配制的B液中，搅拌反应过夜。然后将此混合溶液装入透析袋中，对PH7. 2的磷酸盐缓冲溶液透析，将透析充分的抗原从透析袋取出，加入到IOml离心管5000转/分钟，离心10分钟。吸取上清，I. 5ml/ 青霉素小瓶分装，在_70°C预冻过夜，冷冻干燥24小时，封口处理，_70°C低温保存。此即为免疫原LMG-HE0-HSA。分别称取Img LMG-HE0-HSA和HSA于I. 5mL EP管中，超纯水溶解到 lmg/mL、0. 5mg/mL、0. 25mg/mL 三个浓度，过 O. 22 μ L 微孔滤膜后进样，经 MALDI-T0F/T0F 进样扫描，见附图1、2。根据分子离子峰吸收值计算为结合率(69252.06-66492.53)/446 =
6.18。包被原的制备将实施例2. I制备的A液逐滴加到实施例2. 2配制的C液中，搅拌反应过夜。然后将此混合溶液装入透析袋中，对PH7. 2的磷酸盐缓冲溶液透析，将透析充分的抗原从透析袋取出，加入到IOml离心管5000转/分钟，离心10分钟。吸取上清，I. 5ml/ 青霉素小瓶分装，在_70°C预冻过夜，冷冻干燥24小时，封口处理，_70°C低温保存，此即为包被原 LMG-HE0-0VA。实施例3单克隆抗体的制备杂交瘤细胞的制备参照薛庆善《体外培养的原理与技术》科学出版社2001年版中的方法以实施例2制备的免疫原LMG-HE0-HSA免疫Balb/C小鼠，免疫程序为基础免疫将免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠背部皮下多点注射，首免与二免间隔3 周，以后每间隔2周加强免疫一次，换用不完全佐剂乳化，最后于融合前三天腹腔注射，强化免疫，抗原量加倍，不加佐剂。融合时，取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75%酒精中浸泡5分钟消毒。将3-5X 107SP2/0骨髓瘤细胞和免疫小鼠脾脏细胞悬液加入到50mL离心管中，混匀，1500r/分钟离心5分钟。弃上清，并用灭菌的滤纸吸干。轻轻敲击管底，使管底细胞松动。将离心管置于37°C水浴中，缓慢加入预温至37°C的50% PEGO. 85mL，边加边轻轻用吸管尖搅拌，加完后继续搅拌，总用时维持在90秒内。缓慢加入37°C预温的RPMI-1640基础液10mL。具体方法为第I分钟逐滴加lmL， 第2分钟加2mL，之后缓慢加入剩余的RPMI-1640基础液，边加边轻摇离心管。缓慢加入 40mL RPMI-1640基础液，加完后，缓慢上下颠倒混匀，1500r/分钟离心5分钟。弃上清，IOmL 滴管吸取含饲养细胞HAT培养基，沿管壁缓慢滴加，用滴管缓慢机械搅拌，缓慢吸取融合细胞，接近饲养细胞液面滴加，机械搅拌混匀。接种于6块96孔培养板中，约150 μ L/孔，置于37°C，5% CO2细胞培养箱中培养。从融合当天起计为O天，3天后每个培养孔滴加I滴HAT培养基，5天后有规律地每隔2天吸去1/2体积的培养基，换入等量HT培养基。在融合后4天，开始对融合细胞进行跟踪观察，标记和记录有杂交瘤细胞生长的培养孔，并计算融合率。在融合后6-7天，待孔内细胞长至孔底1/10-1/5时，取培养上清，用间接竞争ELISA方法筛选阳性细胞孔。包被原浓度为10mg/L。每个细胞培养孔设置O孔和200 μ g/L药物孔，每孔中加入50 μ L培养上清进行间接竞争ELISA检测。选择4-6个上清检测呈强阳性且只有1-2个形态良好集落生长的孔，用有限稀释法进行亚克隆。经过3 4次克隆，最终筛选出分泌针对孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞。申请人将该杂交瘤细胞命名为4Β10，并于2011年 6月29日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为 CCTCC NO C201143o腹水单抗制备与鉴定在接种前7天取Balb/c小鼠数只，每只小鼠腹腔注射 O. 5ml弗氏不完全佐剂进行预处理。用RPMI-1640基础培养基悬浮由保藏号为CCTCC NO: C201143的杂交瘤细胞4B10扩大培养的细胞，并将细胞数调至I X IO6个/mL，每只小鼠腹腔接种O. 5ml。待小鼠腹部明显膨大，精神变差，濒死不动时采集腹水。按照文献方法(朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法.北京人民军医出版社，2000)，纯化获得单克隆抗体。 采用购自ROCKLAND公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒(Mouse Mab Isotyping Test Kit)对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果为小鼠IgG2a亚型。实施例4无色结晶紫、孔雀石绿、无色孔雀石绿间接竞争ELISA检测方法的建立4. I ELISA相关试剂配制碳酸盐缓冲液(pH 9. 6):准确称取Na2CO3 I. 59g、NaHCO3 2. 93g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。洗涤液(pH7.4):准确称取 NaCl 8. 00g，KH2PO4 0. 20g，Na2HPO4 · 12H20 2.90g，KCl
0.20g,少量超纯水溶解，加入吐温20 0. 50mL,定容至1000mL。磷酸盐缓冲液(PBS)(ρΗ7· 4):准确称取 NaC18. 00g, KH2PO4O. 20g, Na2HPO4 · 12H20
2.90g, KC10. 20g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。封闭液准确称取卵清蛋白10. OOg,加入IOOOmL磷酸盐缓冲液，搅拌混匀直至蛋
白完全溶解。含0. 05体积％吐温20的IOmM PH为7. 4的Tris_HCl溶液的配制准确称取 Tris I. 211g，加入少量水搅拌溶解完全，至950mL，搅拌条件下用浓盐酸调pH值至7. 4，再加0. 5mL吐温20溶解，定容至IOOOmL0底物液购自武汉飞远科技有限公司。终止液2mol/L硫酸。4. 2包被原浓度和抗体工作浓度的确定包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定采用方阵滴定初步确定包被原浓度和抗体工作浓度，抗原浓度设置4、2、1、0. 5,0. 25,0. 125,0. 0625,0. 3125mg/L。抗体浓度为2、4、
8、16、32、64、128，256X 103。酶标板每孔加入50 μ L PBS和50 μ L抗体，选择OD值接近2. 0， 且相邻孔OD值出现较大变化的包被浓度和抗体浓度做为最佳抗原、抗体组合。由表I方阵结果可以确定包被原浓度为lmg/L，初步确定抗体工作浓度为I : 20000。表I抗体方阵测定结果
权利要求
1.一种能识别孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的单克隆抗体，其特征在于，它是由保藏号为CCTCC NO C201143的杂交瘤细胞4B10所分泌的。
2.权利要求I所述的杂交瘤细胞4B10，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为 CCTCC NO C201143o
3.包含权利要求I所述的单克隆抗体的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，该试剂盒是用于检测孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的酶联免疫试剂盒。
5.一种用于检测孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的酶联免疫方法，包括免疫原、 包被原、抗体的制备以及样品的处理和检测，其步骤如下(1)将半抗原对-[3_(羧基)丙氧基]无色孔雀石绿与人血清白蛋白偶联得到免疫原；(2)将半抗原对-[3-(羧基)丙氧基]无色孔雀石绿与卵清蛋白偶联得到包被原；(3)利用步骤(I)的免疫原免疫小鼠，通过细胞融合与筛选得到保藏号为CCTCCNO C201143的杂交瘤细胞4B10 ；(4)用保藏号为CCTCCNO C201143的杂交瘤细胞4B10制备单克隆抗体；(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；(6)取均质后的组织样品，用乙腈超声提取、离心，取乙腈层用氮气吹干，残渣用含 O. 05体积％吐温20的IOmM PH为7. 4的三羟甲基胺基甲烷-HCl溶液溶解，得到待测物；(7)取待测物进行酶联免疫检测。
6.权利要求I所述的单克隆抗体在制备检测孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的酶联免疫试剂盒中的应用。
7.权利要求3或4所述的试剂盒在动物源性食品中孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种能识别孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的单克隆抗体和一种用于检测孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的酶联免疫检测方法与试剂盒。本发明的单克隆抗体是由杂交瘤细胞4B10所分泌的，该杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NOC201143。本发明的酶联免疫检测方法包括免疫原、包被原、抗体的制备以及样品的处理和检测等步骤。与现有技术相比，本发明制备的单克隆抗体可以同时识别无色结晶紫、孔雀石绿、无色孔雀石绿，本发明的检测方法和试剂盒具有简便、快速、灵敏、准确等优点。
文档编号G01N33/543GK102608320SQ20121004521
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月27日 优先权日2012年2月27日
发明者刘振利, 彭大鹏, 戴梦红, 潘源虎, 王玉莲, 翟长友, 袁宗辉, 陈冬梅, 陶燕飞, 黄玲利 申请人:华中农业大学