一种浊点萃取分离富集孔雀石绿及拉曼检测方法
【专利摘要】一种浊点萃取同时分离富集孔雀石绿及构建表面增强拉曼基底的检测方法：通过还原硝酸银制得纳米银；采用超滤管离心，对纳米银进行浓缩除杂；采用浓度为5-20ppm的纳米银以得到具有表面增强拉曼活性的增强基底；选择浊点萃取溶液酸碱度为pH3.5-5.5；加入0.05-0.2M的氯化钠促进纳米银的自团聚，以及非离子表面活性剂与水相的分离；吸取溶液置于拉曼光谱仪上进行测定。本发明具有高灵敏度、操作简便等特点，适用于对水体中痕量孔雀石绿的快速分离测定。
【专利说明】一种浊点萃取分离富集孔雀石绿及拉曼检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境分析化学领域，具体地涉及一种浊点萃取分离富集孔雀石绿及拉 曼检测方法，更具体地涉及一种基于浊点萃取同时分离富集水体中的孔雀石绿和构建表面 增强拉曼基底的方法。
【背景技术】
[0002] 作为一种三苯甲烧类染料，孔雀石绿（malachite green,MG)不仅在纺织和印刷行 业得到了广泛的应用，还因其具有良好的抗菌性能而被非法用于水产养殖业中。然而，研究 表明，MG对生物体具有基因毒性和致癌作用（M. A. Pierrard, P. Kestemont, E. Delaive, et al，Aquat. Toxicol. 2012, 114, 142-152)，因此建立水体中痕量MG的简便、快速、高灵敏度 分析方法具有重要意义。目前用于检测水体中的MG的方法，主要包括分光光度法、高效液 相色谱法、液相色谱-质谱法、流动注射分析、酶联免疫法等，但是这些技术方法不仅需要 昂贵的仪器和繁琐的前处理步骤，而且运行费用较高，不利于该技术的推广和野外现场分 析。
[0003] 表面增强拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering, SERS)作为近年来迅 速发展起来的一种检测技术，在实现高灵敏度检测的同时还能够提供物质的结构信息和浓 度信息，已经被广泛用于拉曼标记、化学反应过程原位监控、国土安全以及化学/生化分析 中。近年来便携式拉曼光谱技术的发展进一步使得该技术有望在环境污染物的现场分析方 面获得应用（J. J. Du, J. L. Cui, C. Y. Jing, Chem. Comm. 2014, 50, 347-349)。
[0004] 池点萃取（cloud point extraction, CPE)是一种通过改变温度影响表面活性 剂的浊点变化来实现两相分离的萃取技术，该技术萃取效率高，成本低，并且萃取条件温 和，对环境友好，应用范围广，目前它已成功的用于纳米颗粒（J.F.Liu，R.Liu，Y.G.Yin，et al，Chem. Comm. 2009, 1514-1516)，金属离子，有机小分子，生物大分子及环境样品的前处理 中（S.J. Yu, J.B. Chao, J. Sun, et al，Environ. Sci.Technol. 2013, 47, 3268-3274)。因此， 将浊点萃取与表面增强拉曼技术相结合，开发一种同时对水体中孔雀石绿进行分离富集与 SERS基底构建的新方法对环境中污染物的快速分离分析具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种浊点萃取同时分离富集孔雀石绿及构建表面增强拉曼 基底的检测方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供的浊点萃取同时分离富集孔雀石绿及构建表面增强 拉曼基底的检测方法，步骤如下：
[0007] a、通过还原硝酸银制得纳米银；
[0008] b、采用超滤管离心，对纳米银进行浓缩除杂；
[0009] C、采用浓度为5-20ppm的纳米银以得到具有表面增强拉曼活性的增强基底；
[0010] d、选择浊点萃取溶液酸碱度为ρΗ3· 5-5. 5 ;
[0011] e、通过离心辅助分离非离子表面活性剂与水相；
[0012] f、加入0. 05-0. 2M的氯化钠促进纳米银的自团聚，以及非离子表面活性剂与水相 的分离；
[0013] g、吸取溶液置于拉曼光谱仪上进行测定。
[0014] 所述的方法中，步骤a是采用盐酸羟胺还原硝酸银制得纳米银，或采用柠檬酸还 原硝酸银制得纳米银。
[0015] 所述的方法中，步骤b是采用30kD超滤管浓缩纳米银。
[0016] 所述的方法中，步骤c中的纳米银浓度为lOppm。
[0017] 所述的方法中，步骤d中的浊点萃取溶液酸碱度为pH4. 5。
[0018] 所述的方法中，步骤e中采用1500rpm离心分离lOmin。
[0019] 所述的方法中，步骤f中加入的氯化钠浓度为0. 1M。
[0020] 所述的方法中，步骤f中的非离子表面活性剂为TX-114。
[0021] 所述的方法中，步骤g是采用内径为0. 5mm的玻璃毛细管吸取溶液后置于拉曼光 谱仪上测定。
[0022] 与公知的利用浊点萃取测定孔雀石绿的方法相比，本方法具有以下优点：
[0023] 1)灵敏度较高，可实现水体中低至1(ΓηΜ孔雀石绿的检测。
[0024] 2)所需样品量少,不超过lmL样品。
[0025] 3)可以同时实现对孔雀石绿的分离富集和表面增强拉曼基底的构建。
[0026] 4)操作简便，结合便携式拉曼光谱仪便可实现野外现场分析。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1是本发明纳米银的量对测定孔雀石绿灵敏度的影响。
[0028] 图2是本发明氯化钠用量对测定孔雀石绿灵敏度的影响。
[0029] 图3是本发明溶液酸碱度对测定孔雀石绿灵敏度的影响。
[0030] 图4是在实际水样中测定的孔雀石绿的标准曲线。
【具体实施方式】
[0031] 对于浊点萃取分离富集孔雀石绿并用拉曼检测的报道极少。在相关的报道中，首 先需要对孔雀石绿进行浊点萃取，然后再稀释并加入纳米银后进行拉曼检测，这样难免会 损失其方法的灵敏度。
[0032] 本发明将纳米银加入到含有孔雀石绿的溶液中同时进行浊点萃取，实现了对水体 中孔雀石绿分离富集和SERS基底的同时构建，在最大程度上保留了该方法的灵敏度，并成 功的用于实际水样中孔雀石绿的分离测定。
[0033] 在本发明中提出了同时分离富集孔雀石绿与构建SERS基底的方法，包括纳米银 的合成、浓缩、孔雀石绿的测定条件和拉曼检测方法，本发明的方法包括以下步骤：
[0034] a、纳米银增强基底的合成，采用碱性条件下盐酸羟胺还原硝酸银的反应；
[0035] b、采用30kD超滤管对纳米银进行浓缩除杂；
[0036] c、纳米银浓度的选择，向待萃取样品溶液中加入合适浓度的纳米银以获得具有最 佳SERS活性的拉曼基底；
[0037] d、选择合适酸碱度的浊点萃取溶液分离检测孔雀石绿；
[0038] e、通过离心辅助分离非离子表面活性剂与水相；
[0039] f、在萃取后的非离子表面活性剂中加入合适的氯化钠促进纳米银的自团聚，以及 非离子表面活性剂与水相的彻底分离；
[0040] g、采用玻璃毛细管吸取溶液直接置于拉曼光谱仪上测定。
[0041] 在本发明的实施方案中，所述的环境污染物不局限于孔雀石绿，任何可以通过浊 点萃取被分离的污染物都可以，并还包括一些本身不能被萃取，但是可以通过与纳米银的 结合作用随着纳米银一同被萃取的污染物。
[0042] 本发明的方法中，关于纳米银的合成，也可以采用柠檬酸作为还原剂；增强基底还 可以是纳米金。
[0043] 本发明的方法中，可以选择其他孔径的超滤管对纳米银进行浓缩。
[0044] 本发明的方法中，作为表面增强拉曼增强基底的纳米银的最佳浓度为lOppm。本 发明考查了纳米银浓度在〇. 5-40ppm范围变化时，孔雀石绿的SERS信号随纳米银浓度的 变化，最后选择纳米银的加入浓度为lOppm。由图1可以看出，随着加入的纳米银浓度的增 力口，所测定的孔雀石绿的表面增强拉曼信号明显增加，当加入纳米银的浓度为lOppm时，获 得了最强佳的增强效果。
[0045] 本发明的方法中，萃取溶液酸碱度最佳为pH4. 5。本发明考查了萃取溶液酸碱度 pH3. 5-10范围内，该方法对纳米银的萃取效率及孔雀石绿的拉曼检测的响应。由图3可以 看出，随着pH值的增大，孔雀石绿的拉曼信号明显降低。在pH为4. 5时，获得了最佳的SERS 效果。
[0046] 本发明的方法中，采用1500rpm离心lOmin，辅助分离非离子表面活性剂相与水 相。
[0047] 本发明的方法中，萃取后的溶液中优选加入0. 1M氯化钠促进纳米银的自团聚，以 及非离子表面活性剂与水相的彻底分离，实现对孔雀石绿的高灵敏度检测。本发明考察了 氯化钠加入量在〇. 01-0. 2M范围内变化时，其对孔雀石绿SERS信号测定的影响。由图2可 以看出，随着氯化钠浓度的增加，所测得的孔雀石绿的拉曼信号明显增加，但是当氯化钠的 浓度超过〇. 1M时，过量浓度的氯化钠会导致纳米银发生过度团聚而降低其增强效果，孔雀 石绿的拉曼信号也随之降低。
[0048] 本发明的方法中，采用内径为0. 5mm的玻璃毛细管吸取溶液后直接置于拉曼光谱 仪上测定。
[0049] 以下结合附图和实施例对本发明的技术方案作详细说明：
[0050] 实施例1 :自来水中孔雀石绿的加标测定
[0051] (1)盐酸羟胺还原法制备纳米银胶体
[0052] 合成前，用新配制的王水，将用于合成反应的100mL具塞锥形瓶浸泡至少30min。 使用前，分别用自来水、蒸馏水和超纯水依次清洗干净。
[0053] 向90mL含有1. 67X 10_3M盐酸羟胺和3. 33X 10_3M氢氧化钠的混合溶液中，快速加 入10mL 10 2M硝酸银溶液并持续揽祥，溶液颜色迅速由无色转为灰黄色，并趋于稳定。
[0054] 采用超滤离心法（5000rpm，15min)将未反应完的试剂去除，收集超滤管中的纳米 银，用ICP-MS定浓度至约lOOOppm备用。
[0055] (2)自来水中孔雀石绿的加标测定
[0056] 自来水水样用0. 22 μ m滤膜过滤。在1. 5mL离心管中加入100 μ L过滤后的自来 水和900 μ L超纯水,用稀硝酸调节pH至约4. 5,再加入如图4所示的的孔雀石绿标准溶 液，10yL lOOppm 的纳米银，23yL 10% (v/v)TX-114 和 3.5yL 1M NaCl，混合均匀后置 于40°C水浴中加热30min，进一步在1500rpm离心lOmin辅助相分离。弃上层水相，在下层 TX-114相中加入lyL 2M NaCl，混匀静置lOmin，用毛细管吸取清液，直接置于拉曼光谱仪 上进行检测。实验结果表明，在实际水体中MG浓度为10_ nM?3X10_9M范围内其SERS响 应强度与浓度呈现良好的线性关系（请参阅图4)。该方法可以通过浊点萃取一步实现水体 中MG的分离富集和SERS基底的构建，操作简便，灵敏度高，可用于水体中痕量污染物的快 速分离测定。
【权利要求】
1. 一种浊点萃取同时分离富集孔雀石绿及构建表面增强拉曼基底的检测方法，步骤如 下： a、 通过还原硝酸银制得纳米银； b、 采用超滤管离心，对纳米银进行浓缩除杂； c、 采用浓度为5-20ppm的纳米银以得到具有表面增强拉曼活性的增强基底； d、 选择浊点萃取溶液酸碱度为pH3. 5-5. 5 ; e、 通过离心辅助分离非离子表面活性剂与水相； f、 加入0. 05-0. 2M的氯化钠促进纳米银的自团聚，以及非离子表面活性剂与水相的分 离； g、 吸取溶液置于拉曼光谱仪上进行测定。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，步骤a是采用盐酸羟胺还原硝酸银制得纳米银， 或采用柠檬酸还原硝酸银制得纳米银。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中，步骤b是采用30kD超滤管浓缩纳米银。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中，步骤c中的纳米银浓度为lOppm。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中，步骤d中的浊点萃取溶液酸碱度为pH4. 5。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中，步骤e中采用1500rpm离心lOmin，分离非离子 表面活性剂相与水相。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中，步骤f中加入的氯化钠浓度为0. 1M。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中，步骤f中的非离子表面活性剂为TX-114。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中，步骤g是采用内径为0. 5mm的玻璃毛细管吸取溶 液后置于拉曼光谱仪上测定。
【文档编号】G01N21/65GK104122135SQ201410374078
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】刘景富, 张宗绵, 刘睿, 孙洁芳 申请人:中国科学院生态环境研究中心