专利名称：一种孔雀石绿的检测方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及孔雀石绿检测技术领域，确切地说是一种利用表面增强拉曼光谱技术 检测孔雀石绿的方法和该方法的应用。
背景技术：
中国是世界上第一大水产品生产国和出口国，但近年来，频频爆发的水产品安全 事件不仅危及消费者的利益，更成为制约我国水产品正常出口的瓶颈。在众多水产品安全 事件中，因不恰当使用、过量使用甚至非法使用渔药，导致的渔药残留超标现象最为严重。 孔雀石绿，由于其残留对人体具有“致癌，致畸，致突”的危害，已经被包括中国在内的许多 国家禁止在水产养殖中使用，但因其价格低廉且药效好的特点，仍被当作杀菌剂在水产养 殖过程中非法使用。目前检测水产品中孔雀石绿的标准方法主要有HPLC、LC/MS和GC/MS 法。鉴于现行检测手段耗时耗力、成本昂贵等特点，研究和开发操作简便、快速准确的孔雀 石绿检测新方法，对于加强水产品质量安全的监控及促进水产品贸易发展具有非常重要的 意义。中国专利公开号CN101566674A公开了一种水体及水产品中孔雀石绿和无色孔雀 石绿残留的快速检测方法，属于水体及水产品中的残留物检测技术领域。该法是将待测样 品和提取剂I振荡混合均匀后，加入提取剂II振荡混合后静置，取上清液加入到富集柱中， 观察富集柱中最下层的显色剂颜色变化，若形成绿色环带，则判断待测样品中含有孔雀石 绿或无色孔雀石绿；提取剂I为乙腈、二氯甲烷、正己烷和对甲苯磺酸的混合液；提取剂II 为二氧化铅和酸性氧化铝的混合物；待测样品为待检测水体样品或待检测水产品样品。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一在于针对现有孔雀石绿的检测标准方法所存在 的不足而提供一种新的孔雀石绿的检测方法。本发明所要解决的技术问题之二在于该检测方法的应用。作为本发明第一方面的一种孔雀石绿的检测方法，其特征是将孔雀石绿标准溶 液滴加到纳米金颗粒修饰的具有表面活性的拉曼基底上，待溶剂蒸干后，使用激光波长为 633nm的共聚焦显微拉曼光谱仪采集孔雀石绿表面增强拉曼光谱，该孔雀石绿表面增强拉 曼光谱具有 1610, 1360，1170，798,913,432cm-1 处特征峰。所述孔雀石绿标准溶液的配制方法如下准确称取10. OOmg孔雀石绿于100mL烧杯中，用一定体积乙腈(色谱纯)完全溶解， 最后定容在100mL容量瓶里,配制成100mg/Kg的孔雀石绿母液，再用一定体积比的乙腈和 超纯水作为溶剂将母液稀释成系列浓度的标准溶液。作为本发明第二方面的该检测方法的应用，其特征在于，是用以检测水体中的孔
雀石绿残留量。作为本发明第二方面的该检测方法的应用，其特征在于，是用以检测水产品中的孔雀石绿及隐性孔雀石绿残留。在所述应用中，所述用以检测水产品中的孔雀石绿及隐性孔雀石绿残留需要对水 产品进行前处理，所述前处理方法是剪取水产品样品，采用乙腈和乙酸铵缓冲溶液进行振 荡提取，随后离心，重复两次，合并上层提取液；用二氯甲烷对提取液进行萃取，重复两次， 合并下层有机相旋转蒸发至干，提取物呈油状；加入乙腈重新溶解油状提取物；接着加入 一定浓度二氯二氰基苯醌将隐性孔雀石绿氧化成孔雀石绿，待其氧化完全后得待检溶液; 其中所述乙腈和乙酸铵缓冲溶液中，乙腈总体积和乙酸铵的体积比约为10:1;液液萃取中 二氯甲烷的总体积与提取液的体积比约为1:1;二氯二氰基苯醌体积与重新溶解后的提取 物体积比约为1:1。拉曼光谱是物质的散射光谱。拉曼光谱分析法是基于拉曼散射效应，对与入射光 频率不同的散射光谱进行分析得到分子振动、转动方面的信息，进而用于分析分子结构的 一种方法。但是拉曼散射效应非常弱，而表面增强拉曼技术(SERS)使用经特殊处理的表 明粗糙的金属(通常为金或银)，通过把待测物质有效吸附在金属表面，可以使拉曼信号增 大至原来的103-106倍。随着新型纳米粒子体系的应用推动SERS技术上到一个新台阶，甚 至可以使拉曼信号放大至1014-1015倍，达到单分子检测水平。本发明结合纳米金颗粒修饰的SERS活性基底和表面增强拉曼光谱技术，将其应 用于检测水产品的渔药残留孔雀石绿和隐性孔雀石绿中。此种新方法具有较高的检测灵敏 度,且大大缩短了检测时间,节约了检测成本。
图1为本发明系列浓度孔雀石绿标准溶液的表面增强拉曼光谱图。图2为本发明罗非鱼中孔雀石绿提取物的表面增强拉曼光谱图。图3为本发明鳗鱼中孔雀石绿提取物的表面增强拉曼光谱图。
具体实施例方式以下结合具体实施例来详细说明本发明。实施例1准确称取10. OOmg于100mL烧杯中，用一定体积乙腈(色谱纯)完全溶解，最后定容 在100mL容量瓶里，配制成100mg/Kg的孔雀石绿母液，再用一定体积比的乙腈和超纯水作 为溶剂将母液稀释成0. 5，1，5，20ng g'用移液枪吸取0. 1-0. 5 y L标准溶液，滴在纳米金 颗粒修饰的具有SERS活性的基片上，待溶液自然挥发干后，放入拉曼光谱仪进行检测。由 图1可以看出，表面增强拉曼光谱强度随浓度的增加而增加。以其1610，1360，1170, 798, 913,432cm-1处特征峰依然可见为依据，该方法最低能检测到0. 5-lng mL—1的孔雀石绿。实施例2在均质的空白罗非鱼鱼样中添加一系列浓度(0，0. 5，1，2，5，10，20ng *g_1)的隐性 孔雀石绿。简化的国际标准提取方法如下剪取水产品样品，采用乙腈和乙酸铵缓冲溶液 进行振荡提取，随后离心，重复两次，合并上层提取液；用二氯甲烷对提取液进行萃取，重复 两次，合并下层有机相旋转蒸发至干，提取物呈油状；加入乙腈重新溶解油状提取物；接着 加入一定浓度二氯二氰基苯醌将隐性孔雀石绿氧化成孔雀石绿，待其氧化完全后得待检溶液；其中所述乙腈和乙酸铵缓冲溶液中，乙腈总体积和乙酸铵的体积比约为10:1;液液萃 取中二氯甲烷的总体积与提取液的体积比约为1:1;二氯二氰基苯醌体积与重新溶解后的 提取物体积比约为1:1。滴0. 1-0.5^し待检溶液于金纳米修饰的表面增强拉曼底板上，待溶剂挥发 干后，采用共聚焦拉曼光谱仪进行表面增强拉曼光谱的采集。由图2可以看出，以 其1610，1360，1170，798,913,432cm_1处特征峰依然可见为依据，此法最低能检测到 5-101^*ビ的孔雀石绿残留。实施例3在均质的空白鰻鱼鱼样中添加ー系列浓度(0，0. 5，1，2，5，10，20ng g_1)的隐性 孔雀石绿。简化的国际标准提取方法如下剪取水产品样品，采用乙腈和乙酸铵缓冲溶液 进行振荡提取，随后离心，重复两次，合并上层提取液；用二氯甲烷对提取液进行萃取，重复 两次，合并下层有机相旋转蒸发至干，提取物呈油状；加入乙腈重新溶解油状提取物；接着 加入一定浓度二氯二氰基苯醌将隐性孔雀石绿氧化成孔雀石绿，待其氧化完全后得待检溶 液；其中所述乙腈和乙酸铵缓冲溶液中，乙腈总体积和乙酸铵的体积比约为10:1;液液萃 取中二氯甲烷的总体积与提取液的体积比约为1:1;二氯二氰基苯醌体积与重新溶解后的 提取物体积比约为1:1。滴0. 1-0.5^し待检溶液于金纳米修饰的表面增强拉曼底板上，待溶剂挥发 干后，采用共聚焦拉曼光谱仪进行表面增强拉曼光谱的采集。由图2可以看出，以 其1610，1360，1170，798,913,432cm_1处特征峰依然可见为依据，此法最低能检测到 5-101^*ビ的孔雀石绿残留。
权利要求
1.ー种孔雀石绿的检测方法，其特征是将孔雀石绿标准溶液滴加到纳米金颗粒修饰的具有表面活性的拉曼基底上，待溶剂蒸干后，使用激光波长为633nm的共聚焦显微拉曼光谱仪采集孔雀石绿表面增强拉曼光谱，该孔雀石绿表面增强拉曼光谱具有1610，1360，1170，798,913,432cm—1 处特征峰。
2.如权利要求I所述的孔雀石绿的检测方法，其特征在于，所述孔雀石绿标准溶液的配制方法如下 准确称取10. OOmg孔雀石绿于IOOmL烧杯中，用一定体积こ腈(色谱纯)完全溶解,最后定容在IOOmL容量瓶里,配制成100mg/Kg的孔雀石绿母液,再用一定体积比的こ腈和超纯水作为溶剂将母液稀释成系列浓度的标准溶液。
3.—种权利要求I所述的检测方法的应用，其特征在于，是用以检测水体中的孔雀石绿残留量。
4.一种权利要求I所述的检测方法的应用，其特征在于，是用以检测水产品中的孔雀石绿和隐性孔雀石绿残留量。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，在所述中，所述用以检测水产品中的孔雀石绿和隐性孔雀石绿残留量的应用首先需要对水产品进行前处理，所述前处理方法是剪取水产品样品，采用こ腈和こ酸铵缓冲溶液进行振荡提取，随后离心，重复两次，合井上层提取液；用ニ氯甲烷对提取液进行萃取，重复两次，合并下层有机相旋转蒸发至干，提取物呈油状；加入こ腈重新溶解油状提取物；接着加入一定浓度ニ氯ニ氰基苯醌将隐性孔雀石绿氧化成孔雀石绿，待其氧化完全后得待检溶液；其中所述こ腈和こ酸铵缓冲溶液中，こ腈总体积和こ酸铵的体积比约为10:1 ;液液萃取中二氯甲烷的总体积与提取液的体积比约为1:1 ;ニ氯ニ氰基苯醌体积与重新溶解后的提取物体积比约为1:1。
全文摘要
本发明公开的一种孔雀石绿的检测方法，其特征是将孔雀石绿标准溶液滴加到纳米金颗粒修饰的具有表面活性的拉曼基底上，待溶剂蒸干后，使用激光波长为633nm的共聚焦显微拉曼光谱仪采集孔雀石绿表面增强拉曼光谱，该孔雀石绿表面增强拉曼光谱具有1610,1360,1170,798，913，432cm-1处特征峰。该检测方法的应用，是用以检测水体中的孔雀石绿或隐性孔雀石绿残留量。本发明结合纳米金颗粒修饰的SERS活性基底和表面增强拉曼光谱技术，将其应用于检测水产品的渔药残留孔雀石绿和隐性孔雀石绿中。此种新方法具有较高的检测灵敏度，且大大缩短了检测时间，节约了检测成本。
文档编号G01N1/28GK102661945SQ20121017971
公开日2012年9月12日 申请日期2012年6月1日 优先权日2012年6月1日
发明者张源园, 张衍亮, 赖克强, 黄轶群 申请人:上海海洋大学