专利名称：制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法
技术领域：
本发明属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及新型链霉亲和素标记的藻蓝蛋 白类荧光蛋白质的制备方法。
背景技术：
藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分。根据 其吸收光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白(phycoerythrin,简称CPE)、 藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin，简称PEC)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称CPC)和 变藻蓝蛋白(allophycocyanin，简称APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含alpha和beta亚基, 每个亚基中藻胆色素(phycobilin )通过硫醚键与藻胆蛋白脱辅基蛋白 (apo-phycobiliprotein)半胱氨酸残基的巯基共价结合，其种类及其与脱辅基蛋白的相 互作用决定藻胆蛋白的光谱性质。藻胆色素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得 CPE主要吸收约560nm的可见光，发射约580nm的荧光；PEC吸收约570nm的可见光，发 射约630nm的荧光；CPC吸收约620nm的可见光，发射约640nm的荧光；APC吸收约650 660nm的可见光，发射约660 670nm的荧光。CPE结合的辅基色素为藻红胆素 (phycoerythrobilin，简称PEB); PEC的alpha亚基结合的辅基色素为藻紫胆素 (phycoviolobilin，简称PVB); PEC的beta亚基结合的辅基色素为藻蓝胆素 (phycocyanobilin，简称PCB); CPC和APC结合的辅基色素都为藻蓝胆素PCB。
链霉亲和素可以跟生物素特异结合，通过链霉亲和素-生物素系统，可以实现信号放 大作用，提高检测灵敏度。目前链霉亲和素-生物素系统已经广泛应用于生物学检测和医 疗检测等领域。目前主要是通过化学交联实现链霉亲和素对目标的标记。
CPC的alpha亚基可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产(TooleyAJ, CaiYA， Glazer A N. Biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial C-phycocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(19):10560 10565)。 PCB生物合成基因由hoi和pcyA组成，可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产PCB (F. T丄andgraf, C. Forreiter, et al. Recombinant holophytochrome in Echerichia coli[J]. FEBS Letters, 2001, 508:459-462)。与前人的方法不同，我们发现Anabaena sp. PCC7120中alr0617基因和Synechocystis sp. PCC 6803中slr2049基因分别编码beta 裂合酶，在其它蓝藻中也存在同源的beta裂合酶。这些beta裂合酶能催化PCB与CPC的
beta亚基及其同源蛋白质共价结合，从而生成具有优良荧光性质的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。通过基因工程技术，把链霉亲和素基因和藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于 表达载体，可以在大肠杆菌内表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白的融合蛋 白，直接实现链链霉亲和素和藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白的连接，而不需要通过化学交联等 方法来实现链霉亲和素标记。
藻胆蛋白类荧光蛋白质可以应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域。藻蓝蛋白类 荧光蛋白质具有优良的荧光性质，通过直接实现链链霉亲和素和藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白 的连接，可用于生物学检测以及医疗检测领域。本发明为藻蓝蛋白类色素蛋白质功能材料 应用于医药和生物工程领域，特别是检测领域奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，它 是应用beta裂合酶催化藻蓝胆素与链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合， 从而制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质；将含有beta裂合酶基因、链霉亲和 素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白拼接的基因、藻蓝胆素生物合成酶基因的表达质粒依次转入宿 主菌，得到相应的工程菌，通过这种方法得到的基因工程菌生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋 白类荧光蛋白质。
本发明的目的是这样实现的 一种制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方 法，包括下述步骤
(1) 用基因工程方法，将beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到 beta裂合酶表达质粒
(2) 用基因工程方法将链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因 克隆于第二个表达载体中，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒；
(3) 用基因工程方法将PCB生物合成酶基因力W和/^7力或其同源基因同时克隆于第 三个表达载体中或分别克隆于第三、第四个表达载体中，得到PCB合成质粒；
(4) 将beta裂合酶表达质粒、链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒、PCB生物合 成酶质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌， 应用此工程菌发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋 白类荧光蛋白质。
上述的制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法中所述的宿主菌为大肠 杆菌。所述的beta裂合酶基因是指与^a力ae朋sp. PCC7120中WrW/;7基因或 5>/7ec/ oc/stis sp. PCC 6803中slr^^^基因同源的基因。所述的藻蓝蛋白类脱辅基蛋 白基因是指与A aZ^e/7a sp. PCC7120或5y"ec/ ocys"'s sp. PCC 6803或# 7a/zu'/ os"s sp.PCC7603中cpc5同源的基因。
本发明与现有技术相比，具有以下优点
1、 不使用藻类为原料而是利用大肠杆菌生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质，大肠杆菌繁殖 快，可以大大缩短周期；
2、 与藻类相比，大肠杆菌细胞壁容易破碎，纯化过程中可节省能源；
3、 通过大肠杆菌生产，目标蛋白含量高，有His-tag标记，且体系中几乎没有性质 类似的蛋白，提取方便；
4、 产物中链霉亲和素与荧光藻胆蛋白类色素蛋白质直接结合，不需额外进行处理， 有利于发展荧光藻胆蛋白类色素蛋白质在检测领域的应用。
图1为本发明中Alr0617或Alr2049催化下生成的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光 蛋白质的吸收与荧光光谱；其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。
具体实施例方式
下面以实例对本发明作进一步详细地说明。 实施例1
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种^ a6ae朋sp. PCC7120和5y/ ec力oc/"j's sp. PCC 6803的全序列已经测定完成。^ a6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019， 5y/ ec/ oc/"is sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将力朋&朋a sp. PCC7120中的a^rt 《77基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-alrt W;7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将^7a&e;7asp.PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc5和链霉亲和素基 因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-w"c^， 链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和 素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893,通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o/和pc州)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o -pc_M，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即脱辅基蛋白基因c; c5在PET30中是在AcoRV和J力o I两个酶切位点之间，链霉亲和素基因sa在ZTjwI和《WII两个酶切位点之间；裂合酶基因W7^《/7在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是I和J力o I ; PCB合成酶基因是2个(/ o/和pcy/0， 它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在AfcoI和尸sH之间， ; c州在第二个多克隆位点，在We I和i7w I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pCDFDuet-aZrt W7、 pET30-sa"C/ c^和pACYCDuet-力o7-pc_^转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37。C振荡培养至0D卿为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 2(TC至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体 细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应 的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。其吸收与荧光光谱见 附图1所示，其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式如下
从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21(DE3)单菌落，接种于5mLLB培养基，37 t:振荡培养过夜；取100iaL饱和培养物，无菌转接至5mLLB培养基，37。C振荡培养至0D600 =0.3 0.4时，将菌液转移至5mL无菌离心管中，冰上放置10分钟；离心1分钟(10000g， 4。C)弃去上清，收集沉淀菌体；用lmL预冷的0.1mol/LCaCl2无菌溶液重悬菌体，离心30 秒(10000g, 4'C)去上清，菌体沉淀用100pL预冷的0. lmol/L CaCl2重悬，放置于冰上， 加入一定量的构建好的质粒，混匀后冰浴放置30分钟，42。C热休克90秒，冰浴5分钟后 加入300)iiL LB培养基，37。C低速振荡培养45分钟，无菌涂布在含有相应抗生素的LB培 养基平板上，倒置于37'C培养箱至形成可见的单克隆菌斑。
提取3个左右菌落，分别接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，振荡培养至饱和；
分别从中取10(^L转接至5ml含相应抗生素的LB培养基中；37。C振荡培养至0D6。产0. 5-0.7
时，冰浴约30分钟，加入IPTG诱导表达；避光、20°C、 150转/分，表达约12小时。离
心收集细胞，细胞加入缓冲液重悬；通过光谱仪测其产物荧光量，选取荧光产量高的菌株进行大量表达。 实施例2
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种」朋Z ae朋sp. PCC7120和5>/ ec/ ocj^"s sp. PCC 6803的全序列已经测定完成。A7aZ7ae/7a sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019, 5>"ec/ oc/"is sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022,可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将^ a力se朋sp. PCC7120中的sZrt 《77基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-a^rt W7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将^73&e/7a sp. PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因c/7C万(C1551)和链霉亲 和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-^-t^o9(C1551)，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆 菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的 脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pc^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o/-pc/力，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即脱辅基蛋白基因c/7cA(C155I)在pET30中是在化oRV和J/w I两个酶切位点之间， 链霉亲和素基因^在&/7 1和《WII两个酶切位点之间；裂合酶基因s7r0《77在pCDFDuet 中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是AWeI和J/wI ; PCB合成酶基因是2个(力W和 / cW)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在;Vco I和尸" I之间，pc州在第二个多克隆位点，在M/el和/力oI之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-a7/^W7、 pET30-sa~c/ c5(C155I)和pACYCDuet-力o7-pcW转入大
肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于PH 7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lraraol/L， 2(TC至37'C振荡 表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离 心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提 纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例3
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp. PCC7120和Synechocystis sp. PCC 6803的全序列已经测定完成。Anabaena sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019， Synechocystis sp. PCC 6803在GeneBank中编号为:BA000022，可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将Synechocystis sp. PCC 6803中slr2049基因克隆于Novagen 公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-sZr^ 必，在大肠杆菌中能表达beta裂合 酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将力/ a^e/7asp.PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc^和链霉亲和素基 因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-sa-cpcA 链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和 素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893,通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(/w/和pcW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o7-pc/A在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即脱辅基蛋白基因cp"在pET30中是在化oRV和两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因幼在和5WII两个酶切位点之间；裂合酶基因W/^^9在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是A^e I和/力o I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pcj^)， 它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力W处于第一个多克隆位点，在儉o I和尸"I之间， ; c^在第二个多克隆位点，在We I和J/w I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，
把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pCDFDuet-sZr^似义pET30-sa-cpc^和pACYCDuet-/w/-pc/力转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37。C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(i-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体 细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Nr亲和层析，可提纯得到相应 的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。其吸收与荧光光谱见 附图1所示，其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例4
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种^ a6ae朋sp. PCC7120和6y"ec/ ocys"ssp. PCC 6803的全序列已经测定完成。^7a6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019, 6y"ec/ oc/s"'s sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将A7a6ae朋sp. PCC7120中的Wri，W9基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-sir^ 必，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将^7s&e朋sp. PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc5(C1551)和链霉亲 和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-cpCS(C155I)，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆 菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的 脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和/ cW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-/ o/-pc/A在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即脱辅基蛋白基因c/ c夙C155I)在pET30中是在fcoRV和J/w I两个酶切位点之间，
链霉亲和素基因sa在,p/7l和5^n两个酶切位点之间；裂合酶基因W/^似9在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是7We I和I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和 pc州)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在餘o I和," I之间，pc州在第二个多克隆位点，在AWel和i7 oI之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pCDFDuet-Wi"i^必、pET30-sa"C/x^(C1551)和pACYCDuet-7 o7-pcy力转入大 肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0 的LB培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-(3-D-galactoside,简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离 心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提 纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例5
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种^ afee朋sp. PCC7120和分/7ec力ocy"/s sp. PCC 6803的全序列已经测定完成。」朋Z ae朋sp.PCC7120在GeneBank中编号为BA000019， 5"/77ec/ oc/s"s sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需 基因，M 7a/w'/7os"s sp. PCC7603已经部分测序，所用到基因序列在GeneBank中编号为 M34254;通过基因工程方法，将^a&e朋sp. PCC7120中的a7j^《77基因克隆于Novagen 公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDTOuet-alrt^/7，在大肠杆菌中能表达beta裂合 酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将必J柳&ows sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc5和链霉亲和
素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫
pET30-幼-cpc万，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基 蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(/w7和pcW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o/-pc^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即脱辅基蛋白基因cpc^在pET30中是在fcoRV和J7 oI两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因^在yfp/ I和《WII两个酶切位点之间；裂合酶基因s7r。《77在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是A^e I和化o I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pc州)， 它们在同一个载体pACYCDuet-l中，力o7处于第一个多克隆位点，在〃co I和尸sf I之间， pc/力在第二个多克隆位点，在M/e I和i7 o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-alr^7;7、 pET30-sa~cpc5和PACYCDuet-/ o7-; c;^转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养 基中，37'C振荡培养至0D柳为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 2(TC至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体 细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Nr亲和层析，可提纯得到相应 的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例6
(1)从GeneBank中可以査到，藻种^ a6ae朋sp. PCC7120和5y/ ec力ocj^t/s sp. PCC
6803的全序列已经测定完成。^朋6a， sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019，
5y/7ec力oc/st/s sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需
基因，尨^迈i"osiA5 sp. PCC7603已经部分测序，所用到基因序列在GeneBank中编号为
M34254;通过基因工程方法，将力朋力ae朋sp. PCC7120中的a7/^W7基因克隆于Novagen
公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-aZrt^ 7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将必7a加'加ms sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc^(C1551)和链 霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-幼-^c^(C1551)，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆 菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的 脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893,通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和pc^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-/w/-pc/A在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即脱辅基蛋白基因cpcMC155I)在pET30中是在fcoRV和J力o I两个酶切位点之间， 链霉亲和素基因幼在/T/ /j I和《WII两个酶切位点之间；裂合酶基因a7r^W7在pCDFDuet 中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是WeI和; PCB合成酶基因是2个(力o7和 pcy力)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在Afco I禾卩尸W I之间，/7c;^/在第二个多克隆位点，在Wel和i7 oI之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-W/^W7、 pET30-sa"cpc5(C1551)和pACYCDuet-力o/-pc/^转入大
肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于PH 7.0
的LB培养基中，37。C振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷
(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lramol/L， 20。C至37。C振荡
表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离
心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N:t亲和层析，可提
纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例7
U )从GeneBank中可以査到，藻种Anabaena sp. PCC7120和Synechocystis sp. PCC 6803的全序列已经测定完成。Anabaena sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019, Synechocystis sp. PCC 6803在GeneBank中编号为:BA000022,可从全序列中找到所需 基因，必2a/w'/7oms sp. PCC7603已经部分测序，所用到基因序列在GeneBank中编号为 M34254;通过基因工程方法，将Synechocystis sp. PCC 6803中slr2049基因克隆于 Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-57/^似^，在大肠杆菌中能表达beta
劲A鹏 农n鹏o
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将必h肌'/7o幼s sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因c/ c^和链霉亲和 素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-^-^c必链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能 表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基 蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893,通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力o7和z c^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-力o卜pc州，在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即脱辅基蛋白基因c;pc5在pET30中是在fc凍V和J/w I两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因sa在和J^7II两个酶切位点之间；裂合酶基因Wj^似9在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是Afe I和J力o I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pcW)， 它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o7处于第一个多克隆位点，在Afco I和尸W I之间， pc/力在第二个多克隆位点，在AWe I和J/ o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-sZr^^久pET30-sa"c/7c5和pACYCDuet-/ < 7-p《W转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养
基中，37'C振荡培养至0D咖为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p_D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小 时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体 细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N;T亲和层析，可提纯得到相应 的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例8
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种A a6ae朋sp. PCC7120和5>/7ec/ oc/s"s sp. PCC 6803的全序列已经测定完成。力刀a6ae/ a sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019， 5y/7ec/ oc/"^ sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需 基因，M 7s肌'朋s"s sp. PCC7603已经部分测序，所用到基因序列在GeneBank中编号为 M34254;通过基因工程方法，将力朋6ae朋sp.PCC7120中的Wr^似9基因克隆于Novagen 公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-Wi^似义在大肠杆菌中能表达beta裂合 酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，禾偶相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将M7a肌'/70s"ssp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因c/ c^(C155I)和链 霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-幼-cpc^(C1551)，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆 菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的 脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因(力W和pc^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得质粒叫pACYCDuet-在大肠杆菌中能同时表达H01和PcyA。
即脱辅基蛋白基因cpc饥C155I)在pET30中是在AcoRV和i7w I两个酶切位点之间，
链霉亲和素基因幼在化/j I和^WII两个酶切位点之间；裂合酶基因^riW9在pCDFDuet
中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是yfetel和; PCB合成酶基因是2个(力o7和
pc_M)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，力o/处于第一个多克隆位点，在AfcoI和尸"
I之间，pc州在第二个多克隆位点，在yVAI和i7^I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pCDFDuet-WriW^义pET30-sa"C/ c5(C1551)和pACYCDuet-/w7-pc_^转入大 肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0 的LB培养基中，37'C振荡培养至0"。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离 心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提 纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例9
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种^a力朋朋sp. PCC7120和5>77ec/ oc/"ys sp. PCC 6803的全序列己经测定完成。力朋Aae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019, 5>77ec/ oc_KWis sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022,可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将力朋&e朋sp, PCC7120中的a7r。W7基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-a&郎77，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将力朋fee朋sp. PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpci9和链霉亲和素基 因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-幼-cpc5, 链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和 素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，
所得质粒叫pACYCDuet-力o厶在大肠杆菌中能表达H01。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pc//I克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-/ c/A在大肠杆菌中能表达PcyA。
即脱辅基蛋白基因cpcA在pET30中是在fcoRV和两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因幼在I和A^II两个酶切位点之间；裂合酶基因aZrt 6/7在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是7fefe I和J力o I ; PCB合成酶基因是2个(力o/和/ c/力)， hol在pACYCDuet-l中，处于第一个多克隆位点，在Afcol和尸"I之间，pcy力在pETDuet-l 中第二个多克隆位点，在;We I和I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pCDFDuet-alrM/7、 pET30-sa"C/ c5和pACYCDuet-hol、 pETDuet-pcyA转入 大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0 的LB培养基中，37'C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isoprophyl thiof D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l醒ol/L, 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离 心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Nr亲和层析，可提 纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例10
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种^ a6ae朋sp, PCC7120和6y"ec/ ocys"ssp. PCC 6803的全序列己经测定完成。力朋6細a sp.PCC7120在GeneBank中编号为BA000019， 5y/jec/ ocys"s sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将」/2a6ae/7a sp. PCC7120中的a7i^W7基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-aZrt W7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相
应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将」朋&e/7asp. PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc万(C1551)和链霉亲
和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-幼-cpc^(C1551)，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆 菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的 脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力W克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o厶在大肠杆菌中能表达HOl。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 ；xy^克隆于Novagen公司的pETDuet-l中，所得质 粒叫pETDuet-pcyA在大肠杆菌中能表达PcyA。
即脱辅基蛋白基因cpc5(C155I)在pET30中是在fcoRV和X力o I两个酶切位点之间， 链霉亲和素基因幼在1和两个酶切位点之间；裂合酶基因sZrt 《/7在pCDFDuet 中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是Atol和i7wI ; PCB合成酶基因是2个(力W和 ; c/力，hol在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在I禾卩尸st I之间，pc州在 pETDuet-l中第二个多克隆位点，在vWe I和J/ o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-a7r。W;7、 pET30-sa"Cpc5(C1551)和pACYCDuet-ho1、 pETDuet-pcyA 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于 pH7.0的LB培养基中，37'C振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖 苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振 荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B; 离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可 提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例11
(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp. PCC7120和Synechocystis sp. PCC
6803的全序列已经测定完成。Anabaena sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019,
Synechocystis sp. PCC 6803在GeneBank中编号为:BA000022,可从全序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将Synechocystis sp. PCC 6803中slr2049基因克隆于Novagen 公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-Wri，似义在大肠杆菌中能表达beta裂合 酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将^7a6ae朋sp.PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc"和链霉亲和素基 因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-幼-cpc& 链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能表达得到链霉亲和 素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893,通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 Zw7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o厶在大肠杆菌中能表达H01。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pc州克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-z cW，在大肠杆菌中能表达PcyA。
即脱辅基蛋白基因cpc万在pET30中是在fcoRV和J力oI两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因幼在,p/ I和5^1I两个酶切位点之间；裂合酶基因W/^^9在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是T^e I和J/w I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pcW)， hoi在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在/Vco I和尸"I之间，pc/力在pETDuet-l 中第二个多克隆位点，在I和J力o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物 分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片 段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把
载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1:
1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆
菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-s7/^ W、 pET30-sa"cpc5和pACYCDuet-hoi、 pETDuet-pcyA转入
大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0
的LB培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷
(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmraol/L， 20'C至37'C振荡
表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提 纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例12
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种^a6ae朋sp. PCC7120和5y/ ec/ oc/"J's sp. PCC 6803的全序列已经测定完成。^ a/ ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019， 5y/ ec/ oc;^2^s sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需 基因；通过基因工程方法，将^ a6ae朋sp. PCC7120中的s7/^似9基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-WriW必，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将^atee朋sp. PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因c;x^(C1551)和链霉亲 和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-幼-cpc5(C1551)，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆 菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的 脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力W克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o7，在大肠杆菌中能表达H01 。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 vPcy力克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-/ c/A在大肠杆菌中能表达PcyA。
即脱辅基蛋白基因cpc爪C155I)在pET30中是在fcoRV和J/ o I两个酶切位点之间， 链霉亲和素基因sa在和^^ni两个酶切位点之间；裂合酶基因WriY W在pCDFDuet 中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是A^I和J/ o1 ; PCB合成酶基因是2个(力o/和 pc/Z)， hol在pACYCDuet-l中，处于第一个多克隆位点，在Afco I和尸"I之间，pc州在 pETDuet-1中第二个多克隆位点，在AWe I和J力o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pCDFDuet-Wri^^久pET30-s『cpci (C155I)和pACYCDuet-hol、 pETDuet-pcyA 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于 pH7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖 苷(is叩rophyl thio-P-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 2(TC至37。C振 荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B; 离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N:T亲和层析，可 提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例13
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种力/ a6ae/ a sp. PCC7120和5"/7jec力ocy"is sp. PCC 6803的全序列已经测定完成。力/ a6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019， 5)77ec/wcys"s sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需 基因，i/./柳i/7ows sp. PCC7603已经部分测序，所用到基因序列在GeneBank中编号为 M34254;通过基因工程方法，将^7a&e朋sp.PCC7120中的aZr^677基因克隆于Novagen 公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-aZrt 《/7，在大肠杆菌中能表达beta裂合 酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将#. Ja肌'/7os^ sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc^和链霉亲和 素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-幼-cpc5，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能 表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基 蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o 克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o7，在大肠杆菌中能表达H01。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 /^7力克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质
粒叫pETDuet-pc州，在大肠杆菌中能表达PcyA。即脱辅基蛋白基因cpc5在pET30中是在fcoRV和J力o I两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因幼在《;wl和《WII两个酶切位点之间；裂合酶基因Wr。^^在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是Afafe I和i7 o I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pc^), hol在pACYCDuet-l中，处于第一个多克隆位点，在Afco I和尸"I之间，pc/力在pETDuet-l 中第二个多克隆位点，在Wel和i7 oI之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，
利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pCDFDuet-a7^ W7、 pET30-sa^cpc5和pACYCDuet-hol、 pETDuet-pcyA转入 大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0 的LB培养基中，37'C振荡培养至OD柳为0.5至0.8，加入异丙基硫代-13-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-卩-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 2(TC至37。C振荡 表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离 心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提 纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例14
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种^朋6ae朋sp. PCC7120和5y/ ec力oc/s"s sp. PCC 6803的全序列己经测定完成。細6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号为:BA000019， 5y/ ec/wc/stA sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需 基因，尨7柳/770 iAs sp. PCC7603已经部分测序，所用到基因序列在GeneBank中编号为 M34254;通过基因工程方法，将sp.PCC7120中的a7i^W7基因克隆于Novagen 公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-aZr^77,在大肠杆菌中能表达beta裂合 酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将必Ja/w'朋s"ssp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc^(C155I)和链霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-^-c/^^(C1551)，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆 菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的 脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中查到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力W克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o厶在大肠杆菌中能表达HOl。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 ； c;^克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-pc^，在大肠杆菌中能表达PcyA。
即脱辅基蛋白基因cpc5(C155I)在pET30中是在fcoRV和J/ o I两个酶切位点之间， 链霉亲和素基因ss在yT/wI和《WII两个酶切位点之间；裂合酶基因W^ 《77在pCDFDuet 中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是AWeI和; PCB合成酶基因是2个(力o7和 pcW)， hol在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在tVco I和尸"I之间，pc州在 pETDuet-1中第二个多克隆位点，在We I和J力o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-aZrt W7、 pET30-5a-cpc夙C1551)和pACYCDuet-hol、 pETDuet-pcyA 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于 pH7.0的LB培养基中，37'C振荡培养至OD6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖 苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振 荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B; 离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N:T亲和层析，可 提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实施例15
(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp. PCC7120和Synechocystis sp. PCC
6803的全序列已经测定完成。Anabaena sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019,Synechocystis sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022,可从全序列中找到所需 基因，M 7s啦V o dA sp. PCC7603已经部分测序，所用到基因序列在GeneBank中编号为 M34254;通过基因工程方法，将Synechocystis sp. PCC 6803中slr2049基因克隆于 Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-sZri^必，在大肠杆菌中能表达beta
烈A鹏 农口鹏o
根据GeneBank中査到的基因序列，设计了引物，禾!」用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将M J柳i/mws sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc万和链霉亲和 素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-幼-cpc&链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆菌中能 表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的脱辅基 蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893,通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o7，在大肠杆菌中能表达H01。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pc^克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-pcW，在大肠杆菌中能表达PcyA。
即脱辅基蛋白基因cpc5在pET30中是在fcoRV和J/ o I两个酶切位点之间，链霉亲 和素基因幼在A^/j i和《wii两个酶切位点之间；裂合酶基因w/^W9在pCDFDuet中， 处于第二个多克隆位点，酶切位点是vWe I和J力o I ; PCB合成酶基因是2个(力o7和pc^)， hoi在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在Afco I和尸"I之间，pc/力在pETDuet-1 中第二个多克隆位点，在AWe I和J力o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1: 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pCDFDuet-slr2似R pET30-sa"cpc5和pACYCDuet-ho1、 pETDuet-pcyA转入
大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于PH7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代_|3-0-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l咖ol/L， 20。C至37。C振荡 表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B;离 心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N:T亲和层析，可提 纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例16
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种^ a^3e"a sp. PCC7120和5y/ ec/wcyW" sp. PCC 6803的全序列已经测定完成。力"a力a, sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019， 5)77ec/ ocj^fis sp. PCC 6803在GeneBank中编号为BA000022，可从全序列中找到所需 基因，必7s犯'加ws sp. PCC7603已经部分测序，所用到基因序列在GeneBank中编号为 M34254;通过基因工程方法，将/!/7a6ae朋sp. PCC7120中的slri^^^基因克隆于Novagen 公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-Wri^必，在大肠杆菌中能表达beta裂合 酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模 板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将#. J柳i加wssp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc5(C155I)和链 霉亲和素基因(简称sa)拼接后克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫 pET30-幼-cpc5(C1551)，链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因拼接后，在大肠杆 菌中能表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白的融合蛋白，得到链霉亲和素标记的 脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
链霉亲和素基因可以从GeneBank中査到，编号为AF283893，通过全基因合成得到。
(3) 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得质粒叫pACYCDuet-力o7，在大肠杆菌中能表达H01 。
将藻蓝胆素生物合成酶基因之一 pc州克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质 粒叫pETDuet-pc^，在大肠杆菌中能表达PcyA。
即脱辅基蛋白基因cpc^(C155I)在pET30中是在AcoRV和/力o I两个酶切位点之间， 链霉亲和素基因sa在v^/7l和)9^ n两个酶切位点之间；裂合酶基因WriY^9在pCDFDuet 中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是AWel和X/wI ; PCB合成酶基因是2个(力o7和
pc^)， hol在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在Afcol和尸"I之间，pc州在pETDuet-l中第二个多克隆位点，在AWe I和J力o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分 别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段， 把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体 用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致h 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pCDFDuet-s7riW4久pET30-s『c/ c饥C1551)和pACYCDuet-hol、 pETDuet-pcyA 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于 pH7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖 苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmraol/L， 20。C至37'C振 荡表达约12小时，生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B; 离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N:T亲和层析，可 提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 上述制备方法适用于采用各种蓝藻中的beta裂合酶、藻蓝蛋白类脱辅基蛋白和PCB 生物合成酶基因或其同源基因来制备藻蓝蛋白类荧光蛋白质，但涉及到微生物菌种公开的 问题，本发明只选用了 GenBank中已公开全序列的蓝藻力朋力ae朋sp. PCC7120 、 5y"ec/ oc7"A sp. PCC 6803和已公开部分序列的蓝藻必J柳i加s〃s sp, PCC7603为例 对本发明方法加以说明，本领域的技术人员可以根据上述公开的内容采用其它原料实施本 发明。
权利要求
1. 一种制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，其特征在于包括下述步骤(1)用基因工程方法，将beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到beta裂合酶表达质粒(2)用基因工程方法将链霉亲和素基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因克隆于第二个表达载体中，得到链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒；(3)用基因工程方法将PCB生物合成酶基因hol和pcyA或其同源基因同时克隆于第三个表达载体中或分别克隆于第三、第四个表达载体中，得到PCB合成质粒；(4)将beta裂合酶表达质粒、链霉亲和素标记的脱辅基蛋白表达质粒、PCB生物合成酶质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的宿主菌为大肠杆菌。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的beta裂合酶基因是指与^ ate朋a sp. PCC7120中a^M77基因或5y/7ec/ ocys"s sp. PCC 6803中Wr^ 必基因同源的基 因。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因是 指与/I朋6ae朋sp. PCC7120或5y/7ec/ oc/stis sp. PCC 6803或#- 7a/M'加siAs sp. PCC7603 中cpc5同源的基因。
全文摘要
本发明公开了一种制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，通过应用藻胆蛋白beta裂合酶催化藻蓝胆素与链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，制备链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。本发明的方法应用生物过程生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质，是一种环境友好的生产方法。链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质能应用于生物学和医药功能材料领域，特别是应用为生物学和医学检测领域的荧光探针。
文档编号C12N15/65GK101412996SQ20071003088
公开日2009年4月22日 申请日期2007年10月17日 优先权日2007年10月17日
发明者佟顺刚, 明 周, 坤 夏, 赵开弘 申请人:广州天宝颂原生物科技开发有限公司;华中科技大学