一种脂蛋白相关磷脂酶a2酶联免疫检测试剂盒及制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒及制备方法，该脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒包括：标准品和质控品、包被载体、酶标记物、显色液、分析缓冲液及浓缩洗涤液；该脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒制备方法包括：制备脂蛋白相关磷脂酶A2标准品和质控品；制备包被有脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的载体；制备脂蛋白相关磷脂酶A2抗体酶标记物；制备分析缓冲液；制备浓缩洗涤液；组装脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒。本发明可以取代其他试剂盒来进行脂蛋白相关磷脂酶A2的定量检测。本发明试剂盒价格低廉，而且操作简便，灵敏度高，便于在临床上大规模推广使用。
【专利说明】一种脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫检测分析【技术领域】，尤其涉及一种脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒及制备方法。
【背景技术】
[0002]动脉粥样硬化(atheiOscleiOsis)是严重危害人类健康的常见病种，在过去很长一段时间内始终是医学和生物化学研究的重点。因为它普及面广，在人体内潜伏期长，往往以局部缺血、心绞痛、心肌梗塞、中风、冠心病或心力衰竭等致命病的形式爆发，已成为现阶段最常见的死因。
[0003]脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp_PLA2)是心血管疾病中一种新的炎症酶，属于磷脂酶家族中PLA2的一种，是丝氨酸依赖的磷脂酶，能水解氧化低密度脂蛋白(LDL)，产生溶血磷脂酸胆喊(lysophosphatidylcholine,Lyso-PC)和氧化型游离脂肪酸(oxidized free fattyacids，ox-FA)，促进动脉粥样硬化的形成和发展。越来越多的研究证实，Lp-PLA2活性能反映动脉粥样硬化病变的严重程度，并与易损斑块的稳定性有关。它可作为缺血性卒中独立的预测因子，可提供传统危险因子评估以外的预测信息，测定其水平有助于指导预防策略。Lp-PLA2与其他炎性因子(如C-反应蛋白等)相比，受其他危险因素的影响较小，检测具有更高的灵敏度和特异性，目前已被用作预测心血管事件的风险指标，用以对患者心血管疾病进行早期诊断、疗效观察及预后评估。大量临床研究证实，Lp-PLA2与其他心血管疾病标志物联检，可以更进一步提高诊断的敏感性和特异性。
[0004]目前，临床上用于测定Lp-PLA2的方法有ELISA法和免疫比浊法两种。免疫比浊法检测灵敏度低，很容易受血脂浓度影响产生假性升高，且不适用于大批量、自动化式检测平台。ELISA法具有更高的灵敏度、特异性，且具有检测时间短、测量线性范围宽、稳定性好、操作简便快捷、便于自动化、安全无污染等诸多优点，已广泛应用于传染病、肥胖相关疾病、内分泌系统、遗传病、肿瘤的早期诊断、动植物检验检疫等众多领域，并已逐渐成为标记免疫分析的一个重要方向。
【发明内容】
[0005]本发明实施例的目的在于提供一种简便、快捷、准确的脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒及制备方法，旨在解决酶联免疫分析技术在人Lp-PLA2免疫分析产品的应用方面仍是空白的问题。
[0006]本发明实施例是这样实现的，一种脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒，该脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒包括:标准品和质控品、包被载体、酶标记物、显色液、分析缓冲液及浓缩洗涤液；
[0007]标准品和质控品是以胎牛血清为基质，由脂蛋白相关磷脂酶A2抗原稀释而成，其中标准品的浓度包括 1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、0ng/mL 共 6 个浓度，质控品分为质控低值和质控高值，浓度范围依次为150±30ng/mL、300±60ng/mL。
[0008]进一步载体为微孔板、磁性颗粒或塑料管。
[0009]进一步用于标记的酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
[0010]进一步显色液为四甲基联苯胺或3_(2’ -螺旋金刚烷)-4_甲氧基_4-(3’ -磷酰氧基)苯基_1，2- 二氧乙烧。
[0011]进一步分析缓冲液为含有I %牛血清白蛋白和0.05%吐温的IOmM磷酸盐缓冲溶液，pH7.2-7.4。
[0012]进一步浓缩洗涤液为含有1%吐温的20mM磷酸盐缓冲溶液，pH7.2-7.4。
[0013]本发明实施例的另一目的在于提供一种脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒制备方法，该脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒制备方法包括以下步骤:
[0014]步骤一，制备脂蛋白相关憐脂酶A2标准品和质控品:
[0015]用pH7.4、20mmol/L PBS缓冲液与胎牛血清按体积比3:1比例混合配制成基础缓冲液，用基础缓冲液将脂蛋白相关磷脂酶A2重组抗原稀释成浓度为1000、500、250、100、50、0ng/mL标准品；用基础缓冲液将脂蛋白相关憐脂酶A2重组抗原稀释成浓度为300ng/mL高值质控品和150ng/mL低值质控品，高、低质控品的浓度测定范围经统计学分析确定为300±35ng/mL、150± 15ng/mL ；
[0016]步骤二，制备包被有脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的载体:
[0017]载体为微孔板或塑料管时，包被载体通过以下方法制备:脂蛋白相关磷脂酶A2抗体用包被缓冲液稀释，取待包被载体，将经过稀释的脂蛋白相关磷脂酶A2抗体负载于载体上，包被结束后，吸去包被缓冲液，再加入封闭缓冲液，置于37°C封闭2小时或4°C封闭过夜；弃去封闭液，室温18-25°C干燥3-4小时后加入干燥剂密封包装，得到脂蛋白相关磷脂酶A2抗体包被载体，所述包被缓冲液为pH7.2-7.4、10mmol/L磷酸盐溶液，脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的稀释浓度为lug/mL ;稀释的脂蛋白相关磷脂酶A2抗体在载体上的包被量可为每孔IOOul ;包被的条件可置于37°C包被2小时或4°C包被过夜；封闭缓冲液为pH7.2-7.4、IOmmoI/L PBST溶液，内含1% BSA及I~10%蔗糖；封闭缓冲液的加入量可为每孔300ul ；封闭后包被载体的干燥环境相对湿度小于30% ；
[0018]载体为磁性颗粒时，包被载体通过以下方法制备:吸取3mL内含2%磁颗粒的PBS溶液，用磁力架分离，用去离子水清洗；用清洗液清洗磁颗粒并调整体积至6mL ;加入5mg脂蛋白相关磷脂酶A2抗体，置于4°C内混匀30min ;加入12mg碳二亚胺，置于4°C内孵育过夜；用ρΗ7.4、IOOmmoI/L PBS缓冲液清洗磁颗粒；加入Tris和EDTA，使终浓度依次为50mmol/L和4mmol/L ;调节pH至7.4,抗体终浓度为lmg/mL,得到脂蛋白相关磷脂酶A2抗体包被载体，清洗液为PH6.0、10mmol/L PBS缓冲液；
[0019]步骤二，制备脂蛋白相关憐脂酶A2抗体酶标记物:
[0020]用于标记的酶为碱性磷酸酶时，酶标记抗体的制备方法为:采用戊二醛交联法将脂蛋白相关磷脂酶A2抗体与碱性磷酸酶偶联，用pH7.2U0mmol/L PBS缓冲液充分透析，在透析后的结合物溶液中加入等体积的甘油，_20°C以下保存；标记好的脂蛋白相关磷脂酶A2抗体酶结合物可用20%胎牛血清稀释液稀释至工作浓度，置于4°C保存至有效期，胎牛血清稀释液为pH7.4、20mmol/L PBST溶液，内含20%胎牛血清、I~10%蔗糖、0.01 %食品红；[0021]用于标记的酶为辣根过氧化物酶时，酶标记抗体的制备方法为:溶解2mg辣根过氧化物酶于ImL去离子水中，加入0.4mL50mmol/L过碘酸钠溶液，4°C缓慢摇动30min，用pH4.4、Immo 1/L醋酸钠缓冲液透析过夜,加入2mg脂蛋白相关磷脂酶A2抗体,4 °C震荡过夜，使用400ul200mmol/L NaBH4溶液进行还原，经pH7.4、20mmol/L PBS缓冲液透析过夜后用HPLC 二次纯化，收集蛋白峰，加入等体积甘油，-20°C以下保存；标记好的脂蛋白相关磷脂酶A2抗体酶结合物可用20%胎牛血清稀释液稀释至工作浓度，可置于4°C保存至有效期，胎牛血清稀释液为pH7.4、10mmol/L PBST溶液，内含20%胎牛血清、I %蔗糖、0.1 %防腐剂、
0.01%食品红；
[0022]步骤四，制备分析缓冲液，分析缓冲液为pH7.4U0mmol/L PBST缓冲液，内含1%BSA ；
[0023]步骤五，制备浓缩洗涤液，浓缩洗涤液为pH7.2-7.4、20mmol/L PBS缓冲液，内含I %吐温；
[0024]步骤六，组装脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒，将标准品和质控品、包被载体、酶标记物、显色液、分析缓冲液及浓缩洗涤液组装成脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒。
[0025]本发明提供的脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒及制备方法，采用双抗体夹心反应模式，可以对人血样本中的脂蛋白相关磷脂酶A2分子进行专一的定量检测。具有灵敏度高、检测范围宽、稳定性好、操作简便快速无污染等优点。本发明与其他开放式全自动酶联免疫检测平台相结合，可以有效缩短检测时间，降低检测成本和人力花费。项目开发的产品市场前景广阔，经济和社会效益显著；与免疫比浊等方法相比较，本发明简化了操作步骤，缩短了检测时间、大大提高了测定的灵敏度和准确性。
[0026]本发明使用的脂蛋白相关磷脂酶A2抗体具有高度特异性，得到的脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒及制备方法可以取代其他试剂盒来进行脂蛋白相关磷脂酶A2的定量检测。与国外试剂盒相比，本发明试剂盒不仅价格低廉，而且操作简便，灵敏度高，便于在临床上大规模推广使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1是本发明的实施例1所制备的试剂盒中的标准品线形图；
[0028]图2为本发明实施例1提供的脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒与美国PLAC公司脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫测定试剂盒检测200例心血管病人相关性的结果示意图。
【具体实施方式】
[0029]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0030]下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0031]本发明实施例的一种脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒包括:标准品和质控品、包被载体、酶标记物、显色液、分析缓冲液及浓缩洗涤液；[0032]标准品和质控品是以胎牛血清为基质，由脂蛋白相关磷脂酶A2抗原稀释而成，其中标准品的浓度包括 1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、0ng/mL 共 6 个浓度，质控品分为质控低值和质控高值，浓度范围依次为150±30ng/mL、300±60ng/mL ；
[0033]载体为微孔板、磁性颗粒或塑料管；
[0034]用于标记的酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶；
[0035]显色液为四甲基联苯胺或3_(2’ -螺旋金刚烷)-4_甲氧基_4-(3’ -磷酰氧基)苯基_1，2- 二氧乙烧；
[0036]分析缓冲液为含有I %牛血清白蛋白和0.05%吐温的IOmM磷酸盐缓冲溶液，ρΗ7.2-7.4 ；
[0037]浓缩洗涤液为含有I %吐温的20mM磷酸盐缓冲溶液，pH7.2-7.4。
[0038]本发明具体的方法如下:
[0039]步骤一，制备脂蛋白相关憐脂酶A2标准品和质控品:
[0040]用pH7.4、20mmol/L PBS缓冲液与胎牛血清按体积比3:1比例混合配制成基础缓冲液，用基础缓冲液将脂蛋白相关磷脂酶A2重组抗原稀释成浓度为1000、500、250、100、50、0ng/mL标准品；用基础缓冲液将脂蛋白相关憐脂酶A2重组抗原稀释成浓度为300ng/mL高值质控品和150ng/mL低值质控品，高、低质控品的浓度测定范围经统计学分析确定为300±60ng/mL、150±30ng/mL ；
[0041]步骤二，制备包被有脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的载体:
[0042]载体为微孔板或塑料管时，包被载体可通过以下方法制备:脂蛋白相关磷脂酶A2抗体用包被缓冲液稀释，取待包被载体，将经过稀释的脂蛋白相关磷脂酶A2抗体负载于载体上，包被结束后，吸去包被缓冲液，再加入封闭缓冲液，置于37°C封闭2小时或4°C封闭过夜；弃去封闭液，室温(18-25°C )干燥3-4小时后加入干燥剂密封包装，得到脂蛋白相关磷脂酶A2抗体包被载体,所述包被缓冲液为pH7.2-7.4、10mmol/L磷酸盐溶液,所述脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的稀释浓度为lug/mL ;所述稀释的脂蛋白相关磷脂酶A2抗体在载体上的包被量可为每孔IOOul ;所述包被的条件可置于37°C包被2小时或4°C包被过夜；所述封闭缓冲液为PH7.2-7.4U0mmol/L PBST溶液，内含1% BSA、1?10%蔗糖；所述封闭缓冲液的加入量可为每孔300ul ;所述封闭后包被载体的干燥环境相对湿度小于30% ；
[0043]载体为磁性颗粒时，包被载体可通过以下方法制备:吸取3mL内含2%磁颗粒的PBS溶液，用磁力架分离，用去离子水清洗；用清洗液清洗磁颗粒并调整体积至6mL ;加入5mg脂蛋白相关磷脂酶A2抗体，置于4°C内混匀30min ;加入12mg碳二亚胺，置于4°C内孵育过夜；用PH7.4U00mmol/L PBS缓冲液清洗磁颗粒；加入Tris和EDTA，使终浓度依次为50mmol/L和4mmol/L ;调节pH至7.4,抗体终浓度为lmg/mL,得到脂蛋白相关磷脂酶A2抗体包被载体，所述清洗液为PH6.0U0mmol/L PBS缓冲液；
[0044]步骤二，制备脂蛋白相关憐脂酶A2抗体酶标记物:
[0045]用于标记的酶为碱性磷酸酶时，酶标记抗体的制备方法为:采用戊二醛交联法将脂蛋白相关磷脂酶A2抗体与碱性磷酸酶偶联，用pH7.2U0mmol/L PBS缓冲液充分透析，在透析后的结合物溶液中加入等体积的甘油，-20°C以下保存；标记好的脂蛋白相关磷脂酶A2抗体酶结合物可用20%胎牛血清稀释液稀释至工作浓度，可置于4°C保存至有效期，所述胎牛血清稀释液为pH7.4、20mmol/L PBST溶液，内含20%胎牛血清、I?10%蔗糖、0.01%食品红；
[0046]用于标记的酶为辣根过氧化物酶时，酶标记抗体的制备方法为:溶解2mg辣根过氧化物酶于ImL去离子水中，加入0.4mL50mmol/L过碘酸钠溶液，4°C缓慢摇动30min，用pH4.4、Immo 1/L醋酸钠缓冲液透析过夜,加入2mg脂蛋白相关磷脂酶A2抗体,4 °C震荡过夜，使用400ul200mmol/L NaBH4溶液进行还原，经pH7.4、20mmol/L PBS缓冲液透析过夜后用HPLC 二次纯化，收集蛋白峰，加入等体积甘油，-20°C以下保存；标记好的脂蛋白相关磷脂酶A2抗体酶结合物可用20%胎牛血清稀释液稀释至工作浓度，可置于4°C保存至有效期，所述胎牛血清稀释液为PH7.4U0mmol/L PBST溶液，内含20%胎牛血清、I %蔗糖、0.1%防腐剂、0.01%食品红；
[0047]步骤四，制备分析缓冲液，分析缓冲液为pH7.4U0mmol/L PBST缓冲液，内含1%BSA ；
[0048]步骤五，制备浓缩洗涤液，浓缩洗涤液为pH7.2-7.4、20mmol/L PBS缓冲液，内含I %吐温；
[0049]步骤六，组装脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒，将标准品和质控品、包被载体、酶标记物、显色液、分析缓冲液及浓缩洗涤液组装成脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒。
[0050]结合以下的实施例对本发明的应用效果做进一步的说明:
[0051]实施例1:
[0052]本发明实施例的脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒包括标准品和质控品、包被载体、碱性磷酸酶酶标记物、显色液、分析缓冲液、浓缩洗涤液；
[0053]其中:
[0054]1.标准品和质控品用下述方法制成:用pH7.4、20mmol/L PBS缓冲液与胎牛血清按体积比3:1比例混合配制成基础缓冲液，用基础缓冲液将脂蛋白相关磷脂酶A2重组抗原稀释成浓度为1000、500、250、100、50、01^/11114示准品；用基础缓冲液将脂蛋白相关磷脂酶A2重组抗原稀释成浓度为300ng/mL高值质控品和150ng/mL低值质控品，高、低质控品的浓度测定范围经统计学分析确定为300±60ng/mL、150±30ng/mL ；
[0055]2.包被微孔板的制备步骤为:脂蛋白相关磷脂酶A2抗体用包被缓冲液稀释，取待包被载体，将经过稀释的脂蛋白相关磷脂酶A2抗体负载于载体上，包被结束后，吸去包被缓冲液，再加入封闭缓冲液，置于37°C封闭2小时或4°C封闭过夜；弃去封闭液，室温(18-25°C )干燥3-4小时后加入干燥剂密封包装，得到脂蛋白相关磷脂酶A2抗体包被载体，所述包被缓冲液为PH7.2、10mmol/L磷酸盐溶液，所述脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的稀释浓度为lug/mL;所述稀释的脂蛋白相关磷脂酶A2抗体在载体上的包被量可为每孔IOOul ;所述包被的条件可置于37°C包被2小时或4°C包被过夜；所述封闭缓冲液为pH7.4、IOmmoI/L PBST溶液，内含1% BSA及I~10%蔗糖；所述封闭缓冲液的加入量可为每孔300ul ;所述封闭后包被载体的干燥环境相对湿度小于30% ；
[0056]3.碱性磷酸酶标记抗体的制备方法为:采用戊二醛交联法将脂蛋白相关磷脂酶A2抗体与碱性磷酸酶偶联，用pH7.2U0mmol/L PBS缓冲液充分透析，在透析后的结合物溶液中加入等体积的甘油，-20°C以下保存；标记好的脂蛋白相关磷脂酶A2抗体酶结合物可用20%胎牛血清稀释液稀释至工作浓度，可置于4°C保存至有效期，所述胎牛血清稀释液为pH7.4、20mmol/L PBST溶液，内含20%胎牛血清、I %蔗糖、0.01%食品红；
[0057]4.分析缓冲液的制备配方为:pH7.4、IOmmoI/L PBST缓冲液，内含I % BSA ;
[0058]5.浓缩洗涤液的制备配方为:pH7.4、20mmol/L PBS缓冲液，内含I %吐温；
[0059]6.半成品及成品组成:上述步骤所得产品分装即为半成品，随机抽取三批进行特异性、精密度、灵敏度及稳定性检验，合格后组装为脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒；
[0060]实验证明:用塑料管替代实施例1步骤2中的微孔板，其他同实施例1，可以制备出相应的脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒；
[0061]用磁性颗粒替代实施例1步骤2中的微孔板，并在所述试剂盒中放入空白微孔板或塑料管，其他同实施例1，可以制备出相应的脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒；
[0062]实验证明:用pH为7.3或7.4的包被缓冲液替代实施例1步骤2中的pH值为7.2的包被缓冲液，其他同实施例1，可以制备出相应的脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒；
[0063]实验证明:用pH为7.2或7.3的封闭缓冲液替代实施例1步骤2中的pH值为7.4的封闭缓冲液，其他同实施例1，可以制备出相应的脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒；
[0064]实验证明:用pH为7.2或7.3的浓缩洗涤液替代实施例1步骤2中的pH值为7.4的浓缩洗涤液，其他同实施例1，可以制备出相应的脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒；
[0065]实施例2:
[0066]一种脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒包括以下组分:
[0067]1.标准品和质控品(同实施例1):
[0068]2.包被载体(同实施例1)
[0069]3.辣根过氧化物酶标记物，其制备方法为:溶解2mg辣根过氧化物酶于ImL去离子水中，加入0.4mL50mmol/L过碘酸钠溶液,4°C缓慢摇动30min,用pH4.4、lmmol/L醋酸钠缓冲液透析过夜，加入2mg脂蛋白相关磷脂酶A2抗体，4°C震荡过夜，使用400ul200mmol/L NaBH4溶液进行还原，经pH7.4、20mmol/L PBS缓冲液透析过夜后用HPLC 二次纯化，收集蛋白峰，加入等体积甘油，-200C以下保存；标记好的脂蛋白相关磷脂酶A2抗体酶结合物可用20%胎牛血清稀释液稀释至工作浓度，可置于4°C保存至有效期，所述胎牛血清稀释液为pH7.4、10mmol/L PBST溶液，内含20%胎牛血清、I %蔗糖、、0.01%食品红；
[0070]4.分析缓冲液(同实施例1);
[0071]5.浓缩洗涤液(同实施例1)；
[0072]6.半成品及成品组成(同实施例1);
[0073]实验证明:用塑料管替代实施例1步骤2中的微孔板，其他同实施例1，可以制备出相应的脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒；
[0074]用磁性颗粒替代实施例1步骤2中的微孔板，并在所述试剂盒中放入空白微孔板或塑料管，其他同实施例1，可以制备出相应的脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒；
[0075]实验证明:用pH为7.3或7.4的包被缓冲液替代实施例1步骤2中的pH值为7.2的包被缓冲液，其他同实施例1，可以制备出相应的脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒；
[0076]实验证明:用pH为7.2或7.3的封闭缓冲液替代实施例1步骤2中的pH值为7.4的封闭缓冲液，其他同实施例1，可以制备出相应的脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒；
[0077]实验证明:用pH为7.2或7.3的浓缩洗涤液替代实施例1步骤2中的pH值为7.4的浓缩洗涤液，其他同实施例1，可以制备出相应的脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒；
[0078]实施例3:
[0079]以下给出采用实施例1中制备的酶联免疫检测试剂盒检测临床样本中脂蛋白相关磷脂酶A2的具体操作方法:
[0080]1.样本处理:待测样本为血浆时，用EDTA抗凝管取血2mL，1500r/min离心10分钟，收集上清液；待测样本为血清时，用普通管或促凝管取血2mL，4°C下放置30分钟后，1500r/min离心10分钟，收集上清液；
[0081]2.样本检测:将样本、分析缓冲液加到固相有脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的微孔板中，反应30min后，样本中的脂蛋白相关磷脂酶A2与固相抗体特异性结合，洗去游离成分，加入酶标记物避光反应30min，被酶标记的脂蛋白相关磷脂酶A2抗体与抗原、固相抗体形成“夹心”复合物，洗去游离成分，加入显色液，避光反应5min后测定各孔吸光值，其与其中的脂蛋白相关磷脂酶A2抗原浓度正相关，样本浓度依据样本的OD值可进行定量计算；
[0082]实施例4:
[0083]以下给出按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的酶联免疫检测试剂盒进行检定，结果见表1:
[0084]表1
[0085]
【权利要求】
1.一种脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒包括:标准品和质控品、包被载体、酶标记物、显色液、分析缓冲液及浓缩洗涤液； 标准品和质控品是以胎牛血清为基质，由脂蛋白相关磷脂酶A2抗原稀释而成，其中标准品的浓度包括 1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、0ng/mL 共 6 个浓度，质控品分为质控低值和质控高值，浓度范围依次为150±30ng/mL、300±60ng/mL。
2.如权利要求1所述的脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述包被载体为微孔板、磁性颗粒或塑料管。
3.如权利要求1所述的脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述酶标记物为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
4.如权利要求1所述的脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述显色液为四甲基苯胺或3- (2 ’ -螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4- (3 ’ -磷酰氧基)苯基-1，2- 二氧乙烷。
5.如权利要求1所述的脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述分析缓冲液为含有1%牛血清白蛋白和0.05%吐温的IOmM磷酸盐缓冲溶液，pH为7.2-7.4。
6.如权利要求1所述的脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为含有1%吐温的20mM磷酸盐缓冲溶液，pH为7.2-7.4。
7.一种脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒制备方法，其特征在于，所述脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒制备方法包括以下步骤: 步骤一，制备脂蛋白相关磷脂酶A2标准品和质控品: 用pH = 7.4,20mmol/L的PBS缓冲液与胎牛血清按体积比3:1比例混合配制成基础缓冲液，用基础缓冲液将脂蛋白相关磷脂酶A2抗原稀释成浓度为1000、500、250、100、50、Ong/mL标准品；用基础缓冲液将脂蛋白相关憐脂酶A2抗原稀释成浓度为300±60ng/mL的高值质控品和150±30ng/mL的低值质控品； 步骤二，制备包被有脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的载体: 所述包被载体为微孔板或塑料管时，包被载体通过以下方法制备:脂蛋白相关磷脂酶A2抗体用包被缓冲液稀释，取待包被载体，将经过稀释的脂蛋白相关磷脂酶A2抗体负载于载体上，包被结束后，吸去包被缓冲液，再加入封闭缓冲液，置于37°C封闭2小时或4°C封闭过夜；弃去封闭液，室温18-25°C干燥3-4小时后加入干燥剂密封包装，得到脂蛋白相关磷脂酶A2抗体包被载体，所述包被缓冲液为pH为7.2-7.4、10mmol/L磷酸盐溶液，脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的稀释浓度为lug/mL ;稀释的脂蛋白相关磷脂酶A2抗体在载体上的包被量可为每孔IOOul ;包被的条件可置于37°C包被2小时或4°C包被过夜；封闭缓冲液为pH7.2-7.4U0mmol/L PBST溶液，内含1% BSA及I~10%蔗糖；封闭缓冲液的加入量可为每孔300ul ;封闭后包被载体的干燥环境相对湿度小于30% ； 步骤三，制备脂蛋白相关磷脂酶A2抗体酶标记物: 用于标记的酶为碱性磷酸酶时，酶标记抗体的制备方法为:采用戊二醛交联法将脂蛋白相关磷脂酶A2抗体与碱性磷酸酶偶联，用pH为7.2U0mmol/L PBS缓冲液充分透析，在透析后的结合物溶液中加入等体积的甘油，-20°C以下保存；标记好的脂蛋白相关磷脂酶A2抗体酶结合物可用20%胎牛血清稀释液稀释至工作浓度，置于4°C保存至有效期，胎牛血清稀释液为PH为7.4、20mmol/L PBST溶液，内含20%胎牛血清、I~10%蔗糖、0.01 %食品红； 步骤四，制备分析缓冲液，分析缓冲液为pH7.4U0mmol/L PBST缓冲液，内含1% BSA、1%防腐剂； 步骤五，制备浓缩洗涤液，浓缩洗涤液为pH7.2-7.4、20mmol/L PBS缓冲液，内含1%吐温； 步骤六，组装脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒，将标准品和质控品、包被载体、酶标记物、显色液、分析缓冲液及浓缩洗涤液组装成脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒。
8.如权利要求7所述的脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒制备方法，其特征在于,在步骤二中,载体为磁性颗粒时,包被载体通过以下方法制备:吸取3mL内含2%磁颗粒的PBS溶液，用磁力架分离，用去离子水清洗；用清洗液清洗磁颗粒并调整体积至6mL ;加入5mg脂蛋白相关磷脂酶A2抗体，置于4°C内混匀30min ;加入12mg碳二亚胺，置于4°C内孵育过夜；用PH7.4U00mmol/L PBS缓冲液清洗磁颗粒；加入Tris和EDTA，使终浓度依次为50mmol/L和4mmol/L ;调节pH至7.4,抗体终浓度为lmg/mL,得到脂蛋白相关磷脂酶A2抗体包被载体，清洗液为PH6.0、lOmmol/L PBS缓冲液。
9.如权利要求7所述的脂蛋白相关磷脂酶A2酶联免疫检测试剂盒制备方法，其特征在于，在步骤三中，用于标记的酶为辣根过氧化物酶时，酶标记抗体的制备方法为:溶解2mg辣根过氧化物酶于ImL去离子水中，加入0.4mL50mmol/L过碘酸钠溶液，4°C缓慢摇动30min,用pH4.4、lmmol/L醋酸钠缓冲液透析过夜,加入2mg脂蛋白相关磷脂酶A2抗体，4°C震荡过夜，使用400ul200mmol/L NaBH4溶液进行还原，经pH7.4、20mmol/L PBS缓冲液透析过夜后用HPLC 二次纯化，收集蛋白峰，加入等体积甘油，_20°C以下保存；标记好的脂蛋白相关磷脂酶A2抗体酶结合物可用20%胎牛血清稀释液稀释至工作浓度，可置于4°C保存至有效期，胎牛血清稀释液为PH7.4U0mmol/L PBST溶液，内含20%胎牛血清、I %蔗糖、0.01%食品红。
【文档编号】G01N33/535GK104007260SQ201410265732
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】兰成杰 申请人:天津康尔克生物科技有限公司