脂蛋白磷脂酶a2免疫层析定量检测试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型属于免疫检测领域，具体涉及一种高灵敏度脂蛋白磷脂酶A2免疫层析定量检测试纸条。
【背景技术】
[0002]脂蛋白磷脂酶A2 (Lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp_PLA2)是磷醋酶A2 (phospholipase A2，PLA2)超家族中的一员，由441个氨基酸残基组成的一种丝氨酸脂酶，相对分子质量为45.4kD。Lp-PLA2作为一种新的炎性反应标志物，在动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的几个主要阶段中均起着作用。
[0003]Lp-PLA2主要由巨噬细胞和淋巴细胞产生，在早期的关于Lp_PLA2与As的研宄中因Lp_PLA2能水解致炎因子如血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)及结构相关的氧化磷脂，因此曾被认为能抑制炎性反应，甚至能抑制动脉粥样硬化的形成，故也被称为血小板活化因子乙酰水解酶(platelet activating factor acetylhydrolase，PAF-AH)。但是近年来的研宄已证实Lp-PLA2更大的作用在于促进动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的发生与发展。
[0004]目前，关于Lp-PLA2的实验研宄及流行病学研宄已经表明，Lp_PLA2具有促进冠状动脉粥样硬化发生与发展的作用，是一个新的AS的危险标志物，能独立预测AS的风险，在未来的临床决策中可能成为一个独立的测量指标。
[0005]目前检测脂蛋白磷脂酶A2的常用方法有:
[0006]I酶联免疫吸附法
[0007]酶联免疫吸附测定法，是以免疫学反应为基础，将抗原抗体特异性结合与酶底物的高效催化产物作用相结合的一种敏感性很高的实验技术。利用Lp-PLA2抗原性制备特异性抗体，通过免疫学方法直接测定血液中酶的蛋白质含量。
[0008]2免疫透射比浊法
[0009]免疫透射比浊法是实验室常用检测方法。免疫透射比浊法也是一种微量的免疫沉淀测定法。其与速率散射比浊法不同的是以测定透过溶液的光量来反映待测抗原的含量。当光线透过反应体系时，溶液中的抗原抗体免疫复合物可对光线加以吸收和反射，使透射光减少。免疫复合物越多，吸收的光线越多，透射光越少，这种变化可用吸光度表示。若抗体量固定，所测吸光度与免疫复合物的量成正比，也与待测抗原的量成正比。以一系列已知浓度的抗原标准品作对照，即可以测出受检物含量。
[0010]生物素-亲和素系统(b1tinavidin system，BAS)，是一种新型生物反应放大系统。随着各种生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于医学各领域。将该系统应用于免疫组化，酶联免疫，荧光免疫，放射免疫等检测技术中，可显著地提高以上技术方法的敏感性、特异性和稳定性，使方法更简便，有助于临床快速诊断，并利于进行大规模流行病学调查，成为研宄免疫反应的有力工具。由于BAS检测系统经济快速，又无放射物质污染，不需复杂仪器，充分显示了此系统的巨大潜力和应用的可能性。
[0011]生物素-亲和素系统检测原理:BAS是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素与亲和素间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kDa，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达1015M-1)。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。链霉亲和素是与亲和素有相似生物学特性的一种蛋白质，链霉亲和素与亲和素一样分子中每条肽链都能结合一个生物素，因几乎所有用于标记的物质均可以同亲和素或链霉亲合素结合。利用生物素-亲和素系统研制脂蛋白磷脂酶A2检测试快速诊断试剂尚无报道。
【实用新型内容】
[0012]本实用新型的目的，在于提供一种脂蛋白磷脂酶A2免疫层析定量检测试纸条，其基于双抗体夹心法、荧光免疫侧向层析和生物素-链霉亲和素放大系统，提供高灵敏度脂蛋白磷脂酶A2免疫层析定量检测试纸条。使用本实用新型时，提高了检测灵敏度和检测稳定性，降低了非特异性结合，检测时间不大于10分钟，大大提高了诊断效率。
[0013]本实用新型解决其技术问题的解决方案是:脂蛋白磷脂酶A2免疫层析定量检测试纸条，其包括底板，所述底板上依次设有样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述吸水垫和荧光标记物结合垫分别交叠压在硝酸纤维素膜的两端后在硝酸纤维素膜的表面形成检测区，所述样品垫交叠压在荧光标记物结合垫上，所述荧光标记物结合垫上固定有生物素标记的脂蛋白磷脂酶A2单克隆抗体和链霉亲和素标记的荧光蛋白；所述检测区内的硝酸纤维素膜上固定有识别脂蛋白磷脂酶A2另外一个表位的单克隆抗体构成的检测线和羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线。
[0014]作为上述技术方案的进一步改进，所述荧光标记物结合垫包括层叠的第一荧光标记物结合垫和第二荧光标记物结合垫，所述第一荧光标记物结合垫的一端垫在样品垫的下方，所述第二荧光标记物结合垫交叠压在硝酸纤维素膜的一端。
[0015]作为上述技术方案的进一步改进，所述第一荧光标记物结合垫中插入样品垫下方的一端设有定位条，所述样品垫的下端面设有能容纳定位条的定位槽。
[0016]作为上述技术方案的进一步改进，还包括卡壳，所述底板、样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫均置于卡壳内，所述卡壳壳面上对应于硝酸纤维膜的位置设有观察窗，卡壳壳面上对应于样品垫的位置设有加样孔。
[0017]作为上述技术方案的进一步改进，所述观察窗为长方形孔。
[0018]作为上述技术方案的进一步改进，所述荧光蛋白可以是绿色荧光蛋白、藻胆蛋白中的一种。
[0019]作为上述技术方案的进一步改进，所述样品垫为经表面活性剂缓冲液浸泡处理后干燥的玻璃纤维构件。
[0020]作为上述技术方案的进一步改进，所述底板为聚苯乙烯构件或者聚乙烯构件。
[0021]作为上述技术方案的进一步改进，所述卡壳包括塑料上壳和塑料下壳，所述塑料上壳扣合塑料下壳上后形成卡壳。
[0022]本实用新型与现有技术相比，具有如下优点:
[0023](I)本实用新型将荧光蛋白作为标记物，此标记物稳定性良好，有利于提高检测稳定性。
[0024](2)本实用新型通过利用“链霉亲和素-生物素放大系统”，提高检测灵敏度，降低非特异性结合，有利于提高试剂盒性能。
[0025](3)利用本实用新型进行降钙素原的检测时间不大于10分钟，检测线性范围为
0.10ng/ml?100.00ng/ml，极大地提高了检测效率。
[0026](4)本实用新型可通过荧光免疫分析仪对结果进行判读，可实现自动化，减少主观因素的影响，提供便利、快速、可靠的诊断结果。
[0027](5)本使用新型卡壳设有样品进入的加样孔和供观测结果的观察窗，根据分析仪器判定结果，准确可靠。
[0028](6)本实用新型制作方便，体积小、便于携带。
[0029](7)本实用新型检测成本较低。
[0030](8)本实用新型可批量生产，适用于临床快速诊断和现场快速诊断；易于保存，有利于基层单位推广。
【附图说明】
[0031]为了更清楚地说明本实用新型实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单说明。显然，所描述的附图只是本实用新型的一部分实施例，而不是全部实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他设计方案和附图。
[0032]图1是本实用新型实施例一的结构示意图；
[0033]图2是本实用新型实施例二的结构示意图；
[0034]图3是本实用新型实施例三的结构示意图；