结核分枝杆菌tb-sa抗体酶联免疫法检测试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物学检测技术领域，具体涉及结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法 检测试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 结核病、艾滋病与疟疾一起，被视为至今影响全球公共卫生的三大疾病，结核病是 我国重点控制的重大疾病之一，也是全球关注的公共卫生问题和社会问题。
[0003]据世界卫生组织（WHO)和全国第五次结核病流行病学调查显示：目前全球有近 1/3的人口感染结核分枝杆菌，每年有约800万新病例发生，接近300万人死于该病。中国 是全球22个结核病高负担国家之一，结核病患者数量居世界第二位。目前有肺结核病人 约450万，结核病年发病人数约130万，我国肺结核的发病率为459/10万人，占全球发病的 14. 3%，每年因结核病死亡人数达13万，大大超过其他传染病死亡人数的总和。
[0004]结核病是人畜共患传染病，可感染各个阶段的人群，第五次流行病学调查显示，随 着年龄的增长，结核病人的发病率增加。有报道显示，一个传染性结核病人一年内可能传染 10?15人。面对如此严峻的形势，我们应该及早采取措施。结核病的早期诊断及有效治疗 是结核病预防工作的重中之重，对于控制结核菌传播有着重要的临床意义。目前国内大多 数医院根据直接涂片镜检和结核分枝杆菌培养技术对活动性结合进行诊断。结核菌涂片检 测虽然简单易行且准确性高，但阳性率低。结核菌培养检测可信度高，但耗时较长，不能满 足临床需求。此外，结核菌素皮试（PPD)试验所用抗原为结核分枝杆菌粗提的抗原混合物， 和许多非结核分枝杆菌及卡介苗（BCG)均存在共同抗原成分，从而导致该法用于结核病诊 断特异性差。中国是结核病高度流行区，由于广泛接种BCG，也造成PH)实验假阳性率很高， 所以临床上只能根据pro实验皮肤的反应强弱给予辅助诊断。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的即在于克服现有技术的不足，提供一种可快速定性检测样本中的结 核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒。
[0006] 本发明的另一目的在于提供结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒的 制备方法。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫 法检测试剂盒，所述检测试剂盒由TB-SA抗原包被板、样品稀释液、酶标记液、浓缩洗液、显 色剂A液、显色剂B液、阴性对照品、阳性对照品和终止液组成。
[0008] 进一步地，所述TB-SA抗原包被板为包被有TB-SA抗原的微孔板，所述TB-SA抗原 用磷酸盐缓冲液稀释，其包被浓度为0. 〇lmg/ml。
[0009] 进一步地，所述样品稀释液为含有吐温-20和蛋白的缓冲液。
[0010] 进一步地，所述酶标记液为含辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌蛋白A溶液。
[0011] 进一步地，所述浓缩洗液为含吐温-20的缓冲液。
[0012] 进一步地，所述显色剂A液为含有过氧化脲的溶液，显色剂B液为含TMB的溶液。
[0013] 进一步地，所述阳性对照品为含TB-SA抗体阳性的血清溶液，阴性对照品为含 TB-SA抗体阴性的血清溶液。
[0014] 进一步地，所述终止液为含硫酸的溶液。
[0015] 结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒的制备方法，它包括以下步骤：
[0016]SI.TB-SA抗原包被板的制备：用磷酸盐缓冲液将TB-SA抗原稀释至包被浓度为 0. 01mg/ml，将包被液包被于微孔板上，35?40°C干燥后保存；
[0017]S2.样品稀释液的制备：用10倍浓缩的磷酸盐缓冲液500ml，加入酪蛋白5. 00g， 加入纯化水搅拌至酪蛋白充分溶解；再加入3ml的吐温-20,混匀后加纯化水至1000ml，充 分混匀，保存；
[0018]S3.酶标记液的制备：用pH为10倍浓缩的磷酸盐缓冲液300ml，加纯化水至 3000ml，将辣根过氧化物酶标的葡萄球菌蛋白A稀释至1:4万?1:6万，保存；
[0019]S4.浓缩洗液的制备：称取氯化钠300g、磷酸氢二钠85g加入1000ml纯化水溶解 后，再加吐温-20 15ml，用纯化水加至1300ml，搅拌混匀后保存；
[0020] S5.对照品的制备
[0021] S51.阳性对照品的制备：用10倍浓缩的磷酸盐缓冲液70ml，加入海藻糖0. 15g、 吐温-20 0. 35ml，丙三醇35ml，溶解后加纯化水至650ml，搅拌混匀后加入含TB-SA抗体阳 性的血清6. 5ml，混匀后保存；
[0022] S52.阴性对照品的制备：用10倍浓缩的磷酸盐缓冲液70ml，加入海藻糖0. 15g、 吐温-20 0. 35ml，丙三醇35ml，溶解后加纯化水至650ml，搅拌混匀后加入含TB-SA抗体阴 性的血清6. 5ml，混匀后保存；
[0023]S6.显色液的制备：
[0024]S61.显色剂A液的制备：称取柠檬酸0. 9g，过氧化脲0.lg，加纯化水100ml溶解 后，加纯化水至170ml，充分混匀后保存；
[0025] S62.显色剂B液的制备：用100ml纯化水将3g柠檬酸溶解后加入丙三醇17ml，混 匀后加入用3mlDMS0溶解的0. 04gTMB，加纯化水至170ml，保存；
[0026]S7.终止液的制备：将纯化水150ml和量取的硫酸18ml混匀后加纯化水至180ml， 保存。
[0027] 本发明的结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒的检测原理：
[0028] 本试剂盒在微孔板内包被TB-SA抗原，若待测样本中有TB-SA抗体即可与之结合， 再与酶标记抗体反应，形成"抗原-抗体-酶复合物"，酶催化显色剂显色，根据显色程度可 判断TB-SA抗体的有无。
[0029] 本试剂盒检测样本为血清，分离的样本可在2_8°C保存下存储7天，长期存储应 置-20°C，避免反复冻融，冷藏或冷冻保存的样本使用前应平衡至室温，并充分混匀。
[0030] 本试剂盒的检测方法为：
[0031] 1.试剂准备：将试剂盒平衡至室温，用纯化水将浓缩洗液作1:20稀释，即配成洗 涤工作液备用。
[0032]2.加样：将所需数量的TB-SA抗原包被板条固定于板架上，各孔加入100ill样本 稀释液，按序加入5yl待测样本；每次实验设空白对照（用双波长检测时可以不设空白对 照）、阴性对照、阳性对照各2孔，分别加入样本稀释液、阴性对照品、阳性对照品各100yl/ 孔；震荡混勻，封板，37°C温育10分钟，用洗漆工作液洗板5次，拍干。
[0033] 3.加酶：每孔加入酶标记液100iil，震荡混匀，封板，37°C温育10分钟，用洗涤工 作液洗板5次，拍干。
[0034] 4.显色读值：每孔加入显色剂A、B液各50i