U，混勻，封板，置37°C避光显色10分 钟。每孔加终止液50yl，混匀，10分钟内完成结果测定。单波长测定：可用空白对照凋零， 在酶标仪450nm波长下测定各孔的0D值；双波长检测：在酶标仪450nm/630nm波长下测定 各孔0D值。
[0035] 阴性对照的0D值应〈0. 15。阳性对照的0D值应>0. 80。
[0036] 检验结果的解释：
[0037] 1.临界值（Cutoff)计算：Cutoff=阴性对照品0D值+0? 2
[0038] 2?检验结果的判断：
[0039][样本的0D值]<[Cutoff]为：TB-SA抗体阴性。
[0040][样本的0D值]〉[Cutoff]为：TB-SA抗体阳性。
[0041] 本发明的有益效果是：本试剂盒在微孔板内包被TB-SA抗原，若待测样本中有 TB-SA抗体即可与之结合，再与酶标记抗体反应，形成"抗原-抗体-酶复合物"，酶催化显 色剂显色，根据显色程度可判断TB-SA抗体的有无。本发明灵敏度高、特异性强，因此，本发 明不但减少了假阳性或假阴性现象对临床诊断带来的干扰，使该试剂盒能够对结核分枝杆 菌TB-SA抗体进行快速、准确的检测，而且误差小、检测灵敏度高；该试剂盒制备方便，制备 方法操作简单，适宜于工业化大规模生产。
【附图说明】
[0042] 图1为实施例1中样本不同反应时间的P/N曲线图；
[0043] 图2为实施例1中酶标记液不同反应时间的P/N曲线图。
【具体实施方式】
[0044] 下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所 述：
[0045] 实施例1 :
[0046] 1.样本反应时间的确定
[0047] 我们选择了不同抗体水平的阳性参考品和阴性参考品，按照确定的稀释比例，（请 明确不同抗体水平、阳性参考品、阴性参考品、确定的稀释比例）测定l〇min、20min、30min、 45min和1小时的结果，数次实验结果显示lOmin效果最佳，统计如表1所示：
[0048] 表1 :样本不同反应时间的结果差异
【主权项】
1. 结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒由 TB-SA抗原包被板、样品稀释液、酶标记液、浓缩洗液、显色剂A液、显色剂B液、阴性对照品、 阳性对照品和终止液组成。
2. 如权利要求1所述的结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于， 所述TB-SA抗原包被板为包被有TB-SA抗原的微孔板，所述TB-SA抗原用磷酸盐缓冲液稀 释，其包被浓度为〇? 〇lmg/ml。
3. 如权利要求1所述的结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于， 所述样品稀释液为含有吐温-20和蛋白的缓冲液。
4. 如权利要求1所述的结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于， 所述酶标记液为含辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌蛋白A溶液。
5. 如权利要求1所述的结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于， 所述浓缩洗液为含吐温-20的缓冲液。
6. 如权利要求1所述的结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于， 所述显色剂A液为含有过氧化脲的溶液，显色剂B液为含TMB的溶液。
7. 如权利要求1所述的结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于， 所述阳性对照品为含TB-SA抗体阳性的血清溶液，阴性对照品为含TB-SA抗体阴性的血清 溶液。
8. 如权利要求1所述的结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于， 所述终止液为含硫酸的溶液。
9. 如权利要求1所述的结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒的制备方法， 其特征在于，它包括以下步骤： 51. TB-SA抗原包被板的制备：用磷酸盐缓冲液将TB-SA抗原稀释至包被浓度为 0. 01mg/ml，将包被液包被于微孔板上，37°C干燥后保存；
52. 样品稀释液的制备：用10倍浓缩的磷酸盐缓冲液500ml，加入酪蛋白5. 00g，加入 纯化水搅拌至酪蛋白充分溶解；再加入3ml的吐温-20,混匀后加纯化水至1000ml，充分混 匀，保存；
53. 酶标记液的制备：用pH为10倍浓缩的磷酸盐缓冲液300ml，加纯化水至3000ml， 将辣根过氧化物酶标的葡萄球菌蛋白A稀释至1:4万?1:6万保存；
54. 浓缩洗液的制备：称取氯化钠300g、磷酸氢二钠85g加入1000ml纯化水溶解后， 再加吐温-20 15ml，用纯化水加至1300ml，搅拌混匀后保存；
55. 对照品的制备
551. 阳性对照品的制备：用10倍浓缩的磷酸盐缓冲液70ml，加入海藻糖0. 15g、吐 温-20 0. 35ml，丙三醇35ml，溶解后加纯化水至650ml，搅拌混匀后加入含TB-SA抗体阳性 的血清6. 5ml，混匀后保存；
552. 阴性对照品的制备：用10倍浓缩的磷酸盐缓冲液70ml，加入海藻糖0. 15g、吐 温-20 0. 35ml，丙三醇35ml，溶解后加纯化水至650ml，搅拌混匀后加入含TB-SA抗体阴性 的血清6. 5ml，混匀后保存；
56. 显色液的制备： S61.显色剂A液的制备：称取柠檬酸0. 9g，过氧化脲0. lg，加纯化水100ml溶解后，力口 纯化水至170ml，充分混匀后保存； S62.显色剂B液的制备：用100ml纯化水将3g柠檬酸溶解后加入丙三醇17ml，混匀 后加入用3ml DMSO溶解的0. 04g TMB，加纯化水至170ml，保存； S7.终止液的制备：将纯化水150ml和量取的硫酸18ml混匀后加纯化水至180ml，保 存。
【专利摘要】本发明公开了结核分枝杆菌TB-SA抗体酶联免疫法检测试剂盒及其制备方法，检测试剂盒由TB-SA抗原包被板、样品稀释液、酶标记液、浓缩洗液、显色剂A液、显色剂B液、阴性对照品、阳性对照品和终止液组成。制备方法包括：TB-SA抗原包被板的制备、样品稀释液的制备、酶标记液的制备、浓缩洗液的制备、对照品的制备和显色液的制备。本发明灵敏度高、特异性强，因此，本发明不但减少了假阳性或假阴性现象对临床诊断带来的干扰，使该试剂盒能够对结核分枝杆菌TB-SA抗体进行快速、准确的检测，而且误差小、检测灵敏度高；该试剂盒制备方便，制备方法操作简单，适宜于工业化大规模生产。
【IPC分类】G01N33-569, G01N33-558
【公开号】CN104614523
【申请号】CN201410799980
【发明人】刘军, 郭沛, 叶成栋, 罗春勤, 王洪
【申请人】成都永安制药有限公司
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2014年12月19日