一种检测癌胚抗原的电化学免疫传感器的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于电化学免疫传感器技术领域，具体涉及一种检测癌胚抗原的电化学免疫传感器的构建方法。
【背景技术】
[0002]癌胚抗原(CEA)是一个广谱性肿瘤标志物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后估计是一个较好的肿瘤标志物。目前检测CEA的免疫分析方法主要有放射性免疫测定法、酶联免疫分析法、压电免疫分析法、荧光免疫分析法等。虽然这些方法灵敏可靠，但是存在一些缺点:有辐射危害、分析时间长、需要复杂的电器仪表等。
[0003]近年来，电化学免疫传感器受到了广泛关注，这是由于它具有良好的可移植性、低耗费、高的检测灵敏度等内在优势。在电化学免疫分析过程中，通常使用酶作信号探针，但是酶容易灭活、价格昂贵，因此，构建无酶免疫传感器引起了分析者们的注意。银纳米粒子对双氧水的还原有高的催化活性，这一催化特性使银纳米粒子成为构建无酶免疫传感器的潜在材料。然而，单纯银纳米材料的生物兼容性不好，因此需要制备具有高催化活性和好生物兼容性的材料来构建无酶传感器。牛血清蛋白稳定的银纳米粒子(AgOBSA)集合了银纳米粒子的催化活性和BSA的良好生物兼容性，在传感器的构建方面有很好的应用前景。
[0004]石墨烯(GR)具有优异的电化学稳定性、高的导电性、大的比表面积，是人们关注的焦点。此外，基于GR的复合材料综合了不同材料各自的特性，也受到了人们的广泛关注。因此，将GR和AgOBSA复合制得的材料不仅具有好的的导电性、高的催化性能、良好的生物兼容性，可以更好地应用于抗体的固定。
[0005]本发明用电沉积的方法将金纳米修饰到玻碳电极表面，然后依次固载一抗和抗原，用GR/Ag@BSA复合材料标记二抗，制备了一种检测CEA的电化学免疫传感器，该传感器具有尚的灵敏度、选择性和稳定性。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种检测CEA的电化学免疫传感器的构建方法，尤其是基于GR/Ag@BSA复合材料的检测CEA的电化学免疫传感器的构建方法。
[0007]为实现上述目的，本发明采用如下技术问题:
本发明的电化学免疫传感器的构建方法包括如下步骤:
(O电化学沉积金纳米粒子修饰的玻碳电极；
(2)聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)功能化还原石墨烯(GR)的制备；
(3)牛血清蛋白(BSA)稳定银纳米粒子的制备；
(4)牛血清蛋白保护银纳米粒子与功能化还原石墨稀复合材料(GR/Ag@BSA)的制备；
(5)GR/Ag@BSA标记癌胚抗原第二抗体(GR/Ag@BSA-Ab2)的制备；
(6)利用夹心免疫法构建电化学免疫传感器。
[0008]所述步骤(I)电化学沉积金纳米粒子修饰的玻碳电极，具体包括以下步骤:
a依次用1.0，0.3和0.5 μ m的三氧化二铝抛光粉抛光处理玻碳电极，然后用超纯水冲洗干净，自然晾干；
b将处理清洁的玻碳电极浸入3 mL质量分数为1%的氯金酸溶液中，用玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，在室温下，以-0.2 V的工作电位恒电位沉积30 s制备金纳米粒子修饰的玻碳电极，超纯水清洗干净，晾干。
[0009]所述步骤(2) PDDA功能化GR的制备，具体包括以下步骤:
a氧化石墨烯的制备:称量0.75 g石墨粉加入到100 mL体积比为1:9的磷酸和浓硫酸的混合溶液中，并在水浴锅中加热到30 0C，称量4.5 g高锰酸钾加入到上述混合液中，升温至50 °C，磁力搅拌反应12 h后，将样品倒入预先加入4 mL双氧水的300 mL冰水中，得到的混合溶液10000转离心分离15 min，用超纯水洗涤7次，在真空干燥箱中60 °C干燥12 h后得到固体氧化石墨烯；
b GR的制备:称取25 mg步骤(2) a制得的氧化石墨稀固体溶解到150 mL超纯水中，超声波处理30 min，依次向溶液中加入100 yL水合肼，560 μ L氨水，10 mg聚乙烯吡咯烷酮，在90 °C反应I h，得到的混合溶液10000转离心分离15 min，用超纯水洗涤5次，在真空干燥箱中60 °C干燥12 h后得到固体GR ；
c PDDA功能化GR的制备:称取2.5 mg步骤(2)b制得的GR固体溶于5 mL超纯水中，超声波处理30 min，向溶液中加入10 mL质量分数为1%的TODA，室温下搅拌2 h，得到的混合溶液10000转离心分离10 min，用超纯水洗涤3次后重新溶解到5 mL超纯水中，成功制得I3DDA-GR溶液。
[0010]所述步骤(3)牛血清蛋白(BSA)稳定银纳米粒子的制备，具体包括以下步骤:
将45 mg BSA溶解到10 mL超纯水中，室温下搅拌5 min后，加热至60 °C，迅速向溶液中加入10 mL 8 mmol/L的硝酸银，继续搅拌45 min，得到的混合溶液10000转离心分离
5min,用超纯水洗涤5次，室温下干燥后得到固体AgOBSA。
[0011]所述步骤(4)牛血清蛋白保护银纳米粒子与功能化还原石墨稀复合材料(GR/Ag@BSA)的制备，具体包括以下步骤:
称取I mg步骤(3)制备的AgOBSA溶解到I mL超纯水中，搅拌5 min后和I mL步骤
(2)制备的TODA-GR溶液混合，室温下搅拌4 h，将得到的混合液1000转离心分离5 min,弃去上清液，溶解到I mL pH 7.4的PBS缓冲溶液中制得GR/Ag@BSA溶液。
[0012]所述步骤(5)制备GR/Ag@BSA标记的Ab2,具体包括以下步骤:
a将步骤(4)制备的I mL GR/Ag@BSA溶液与3 mL质量分数为2.5%的戊二醛溶液混合，室温下搅拌2 h，得到的混合液10000转离心分离5 min，弃去上清液，溶解到I mL pH
7.4的PBS缓冲溶液中；
b将I mL 20 μ g/mL的Ab2加入上述溶液中搅拌孵育2 h，10000转离心分离5 min,弃去上清液，重新溶解到I mL pH 7.4的PBS缓冲溶液中，得到GR/Ag@BSA_Ab2溶液。
[0013]所述步骤(6)构建电化学免疫传感器，具体包括以下步骤:
a滴涂5 μ L I mg/mL的CEA第一抗体至上述步骤(I)制备的金纳米粒子修饰的玻碳电极表面，室温下孵育I h，pH 7.4的PBS缓冲溶液清洗3次，晾干；
b在上述电极表面滴加5 μ L质量分数为1%的BSA溶液以封闭电极表面的非特异性活性位点，pH 7.4的PBS缓冲溶液清洗3次，晾干；
c将5 μ L 0.005-150 ng/mL的CEA抗原溶液分别滴涂到不同电极表面，室温下孵育40 min, pH 7.4的PBS缓冲溶液清洗3次，晾干；
d将5 uL GR/Ag@BSA-Ab2滴到电极表面，室温下孵育40 min, pH 7.4的PBS缓冲溶液清洗3次，晾干，即得到电化学免疫传感器的工作电极；
e将银/氯化银参比电极、铂丝对电极和上述制备的工作电极连接在电化学工作站上;
f pH 7.4的PBS缓冲溶液作为底液，通过计时电流法检测工作电极对双氧水的响应，根据所得的电流值与CEA浓度的对数呈线性关系，绘制工作曲线。
【附图说明】
[0014]图1是本发明的电化学免疫传感器对CEA测定的工作曲线。
【具体实施方式】
[0015]以下通过具体实施例来说明本发明的技术方案，但是本发明的保护范围并不局限于此。
[0016]实施例1制备检测CEA标准样品的电化学免疫传感器。
[0017]步骤1.制备I3DDA功能化的GR
a氧化石墨烯的制备:将100 mL体积比为1:9的磷酸和浓硫酸混合溶液加入到三口瓶中，然后称取0.75 g石墨粉加入到上述溶液中，加热到30 °C，向溶液中加入4.5 g高锰酸钾后，调节水浴锅温度到50 °C，磁力搅拌条件下反应12 h，反应停止后，将样品倒入预先加入了 4 mL双氧水的300 mL冰水中，充分搅拌，得到的混合液经离心分离，用超纯水洗涤7次，随后在真空干燥箱中60 °C干燥，干燥后得到棕黄色氧化石墨烯固体；
b GR的制备:将25 mg上述步骤a制备的氧化石墨稀溶解到150 mL超纯水中，超声波处理30 min，依次向溶液中加100 μ L水合肼，560 μ L氨水，10 mg聚乙烯吡咯烷酮，水浴锅中90 °C反应I h，得到的混合液离心分离，用超纯水洗涤5次，弃去上清液，在真空干燥箱中60 °C干燥，干燥后得到黑色GR固体；
c PDDA功能化GR的制备:称取2.5 mg上述步骤b制备的GR加入到5 mL超纯水中，超声波处理30 min,将预先配好的10 mL质量分数为1%的TODA加入到上述溶液中，室温下搅拌2 h，得到的混合液经离心分离，用超纯水洗涤3次，弃去上清液，重新溶解到5 mL超纯水中，成功制得I3DDA-GR溶液。
[0018]步骤2.AgiBSA的制备:将45 mg BSA固体粉末溶解到10 mL超纯水中，室温下搅拌5 min，在水浴锅中加热到60 °C，迅速加入10 mL 8 mmol/L的硝酸银溶液，继续在60 °C下搅拌45 min，得到的混合溶液经离心分离，用超纯水洗涤5次，弃去上清液，在室温下干燥，得到固体AgOBSA。
[0019]步骤3.GR/AgiBSA复合材料的制备:将I mg步骤2制得的AgOBSA溶解到I mL超纯水中，充分搅拌5 min,向溶液中加入I mL步骤I制得的TODA-GR，继续在室温下搅拌
4h，得到的混合液经离心分离，弃去上层清液，得到的混合物溶解到I mL pH 7.4的PBS缓冲溶液中，得到GR/Ag@BSA溶液。
[0020]步骤4.GR/AgiBSA标记第二抗体溶液的制备:将步骤3制得的I mL GR/AgiBSA溶液与3 mL质量分数为2.5%的戊二醛溶液混合，室温下搅拌2 h，得到的混合溶液离心分离，弃去上清液，溶解到I mL pH 7.4的PBS缓冲溶液中；将I mL 20 μ g/mL的Ab2加入上述溶液中，室温下搅拌孵育2 h，离心分离，弃去上层清液，重新溶解到I mL pH 7.4的PBS缓冲溶液中，即得到溶液。
[0021]步骤5.金纳米粒子修饰玻碳电极的制备:依次用1.0,0.3和0.5 μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理玻碳电极，然后用超纯水冲洗，自然晾干；将处理清洁的玻碳电极浸入
3mL质量分数为1%的氯金酸溶液中，用玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，在室温下，以-0.2 V的工作电位恒电位沉积30 s制备金纳米粒子修饰的玻碳电极，超纯水清洗，晾干。
[0022]步骤6.滴涂5 μ L I mg/mL的CEA第一抗体至步骤5制得的金纳米粒子修饰的玻碳电极表面，室温下孵育I h，超纯水清洗，晾干。
[0023]步骤7.将5 UL质量分数为1%的BSA溶液滴涂至步骤6制得的电极表面，用于封闭电极的非特异性活性位点，用PH 7.4的PBS缓冲溶液溶液对电极清洗，晾干。
[0024]步骤8.将5 μ L 0.005-150 ng/mL的CEA抗原溶液分别滴涂到BSA掩蔽的不同电极表面，室温下孵育40 min, pH 7.4的PBS缓冲溶液