清洗，晾干。
[0025]步骤9.将5 yL步骤4制得的GR/Ag@BSA-Ab2—到步骤8制得的电极表面，室温下孵育40 min, pH 7.4的PBS缓冲溶液清洗，晾干，即得到电化学免疫传感器的工作电极。
[0026]步骤10.将银/氯化银参比电极、铂丝对电极和根据上述步骤制备的工作电极连接在电化学工作站上。
[0027]步骤11.pH 7.4的PBS缓冲溶液作为底液，通过计时电流法检测工作电极对双氧水的响应，根据所得的电流值与CEA浓度的对数呈线性关系，绘制工作曲线。
[0028]步骤12.得到的“响应电流-CEA浓度”的线性曲线为Current (μ A) = 40.20 +15.26 Ig [CEA] (ng/mL)，线性相关系数为 0.9997，由图1 可知，CEA 在 0.005-150 ng/mL范围内，响应电流值与CEA浓度的对数保持良好的线性关系，检测限为0.002 ng/mL ο
[0029]实施例2制备检测含CEA的血清样品的电化学免疫传感器。
[0030]步骤1.制备I3DDA功能化的GR
a氧化石墨烯的制备:将100 mL体积比为1:9的磷酸和浓硫酸混合溶液加入到三口瓶中，然后称取0.75 g石墨粉加入到上述溶液中，加热到30 °C，向溶液中加入4.5 g高锰酸钾后，调节水浴锅温度到50 °C，磁力搅拌条件下反应12 h，反应停止后，将样品倒入预先加入了 4 mL双氧水的300 mL冰水中，充分搅拌，得到的混合液经离心分离，用超纯水洗涤7次，随后在真空干燥箱中60 °C干燥，干燥后得到棕黄色氧化石墨烯固体；
b GR的制备:将25 mg上述步骤a制备的氧化石墨稀溶解到150 mL超纯水中，超声波处理30 min，依次向溶液中加100 μ L水合肼，560 μ L氨水，10 mg聚乙烯吡咯烷酮，水浴锅中90 °C反应I h，得到的混合液离心分离，用超纯水洗涤5次，弃去上清液，在真空干燥箱中60 °C干燥，干燥后得到黑色GR固体；
c PDDA功能化GR的制备:称取2.5 mg上述步骤b制备的GR加入到5 mL超纯水中，超声波处理30 min,将预先配好的10 mL质量分数为1%的TODA加入到上述溶液中，室温下搅拌2 h，得到的混合液经离心分离，用超纯水洗涤3次，弃去上清液，重新溶解到5 mL超纯水中，成功制得I3DDA-GR溶液。
[0031]步骤2.AgiBSA的制备:将45 mg BSA固体粉末溶解到10 mL超纯水中，室温下搅拌5 min，在水浴锅中加热到60 °C，迅速加入10 mL 8 mmol/L的硝酸银溶液，继续在60 °C下搅拌45 min，得到的混合溶液经离心分离，用超纯水洗涤5次，弃去上清液，在室温下干燥，得到固体AgOBSA。
[0032]步骤3.GR/AgiBSA复合材料的制备:将I mg步骤2制得的AgOBSA溶解到I mL超纯水中，充分搅拌5 min,向溶液中加入I mL步骤I制得的TODA-GR，继续在室温下搅拌
4h，得到的混合液经离心分离，弃去上层清液，得到的混合物溶解到I mL pH 7.4的PBS缓冲溶液中，得到GR/Ag@BSA溶液。
[0033]步骤4.GR/AgiBSA标记第二抗体溶液的制备:将步骤3制得的I mL GR/AgiBSA溶液与3 mL质量分数为2.5%的戊二醛溶液混合，室温下搅拌2 h，得到的混合溶液离心分离，弃去上清液，溶解到I mL pH 7.4的PBS缓冲溶液中；将I mL 20 μ g/mL的Ab2加入上述溶液中，室温下搅拌孵育2 h，离心分离，弃去上层清液，重新溶解到I mL pH 7.4的PBS缓冲溶液中，即得到溶液。
[0034]步骤5.金纳米粒子修饰玻碳电极的制备:依次用1.0，0.3和0.5 μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理玻碳电极，然后用超纯水冲洗，自然晾干；将处理清洁的玻碳电极浸入3 mL质量分数为1%的氯金酸溶液中，用玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，在室温下，以-0.2 V的工作电位恒电位沉积30 s制备金纳米粒子修饰的玻碳电极，超纯水清洗，晾干。
[0035]步骤6.滴涂5 μ L I mg/mL的CEA第一抗体至步骤5制得的金纳米粒子修饰的玻碳电极表面，室温下孵育I h，超纯水清洗，晾干。
[0036]步骤7.将5 μ L质量分数为1%的BSA溶液滴涂至步骤6制得的电极表面，用于封闭电极的非特异性活性位点，用PH 7.4的PBS缓冲溶液溶液对电极清洗，晾干。
[0037]步骤8.将5 UL含CEA的血清样品滴涂到BSA掩蔽的电极表面，室温下孵育40min, pH 7.4的PBS缓冲溶液清洗，晾干。
[0038]步骤9.将5 yL步骤4制得的GR/Ag@BSA-Ab2—到步骤8制得的电极表面，室温下孵育40 min, pH 7.4的PBS缓冲溶液清洗，晾干，即得到电化学免疫传感器的工作电极。
[0039]步骤10.将银/氯化银参比电极、铂丝对电极和根据上述步骤制备的工作电极连接在电化学工作站上。
[0040]步骤11.pH 7.4的PBS缓冲溶液作为底液，通过计时电流法检测工作电极对双氧水的响应。
【主权项】
1.一种检测癌胚抗原(CEA)的电化学免疫传感器的构建方法，其特征在于包括以下步骤: Cl)电化学沉积金纳米粒子修饰的玻碳电极； (2)聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)功能化石墨烯(GR)的制备； (3)牛血清蛋白稳定银纳米粒子(AgOBSA)的制备； (4)牛血清蛋白稳定银纳米粒子与功能化还原石墨稀复合材料(GR/Ag@BSA)的制备； (5)GR/Ag@BSA标记癌胚抗原第二抗体(GR/Ag@BSA-Ab2)的制备； (6)利用夹心免疫法构建电化学免疫传感器。
2.根据权利要求1所述的一种检测CEA的电化学免疫传感器的构建方法，其特征在于所述步骤(I)具体为: a依次用1.0，0.3和0.5 μ m的三氧化二铝抛光粉抛光处理玻碳电极，然后用超纯水冲洗干净，自然晾干； b将处理清洁的玻碳电极浸入3 mL质量分数为1%的氯金酸溶液中，用玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，在室温下，以-0.2 V的工作电位恒电位沉积30 s制备金纳米粒子修饰的玻碳电极，超纯水清洗干净，晾干。
3.根据权利要求1所述的一种检测CEA的电化学免疫传感器的构建方法，其特征在于所述步骤(2)具体为: a氧化石墨烯的制备:称量0.75 g石墨粉溶解到100 mL体积比为1:9的磷酸和浓硫酸的混合溶液中，并在水浴锅中加热到30 °C，将4.5 g高锰酸钾加入到上述混合液中，升温至50 0C，磁力搅拌反应12 h后，将样品倒入预先加入4 mL双氧水的300 mL冰水中，得到的混合溶液10000转离心分离15 min，用超纯水洗涤7次，在真空干燥箱中60 °C干燥12h后得到固体氧化石墨烯； b还原石墨稀的制备:称取25 mg步骤(2) a制得的氧化石墨稀溶解到150 mL超纯水中，超声波处理30 min，依次向溶液中加入100 yL水合肼，560 μ L氨水，10 mg聚乙烯吡咯烷酮，在90 °C反应I h，得到的混合溶液10000转离心分离15 min，用超纯水洗涤5次，在真空干燥箱中60 °C干燥12 h后得到固体GR ; c PDDA功能化GR的制备:称取2.5 mg步骤(2) b制得的GR固体溶解到5 mL超纯水中，超声波处理30 min,向溶液中加入10 mL质量分数为1%的TODA，室温下搅拌2 h，得到的混合溶液10000转离心分离10 min，用超纯水洗涤3次后重新溶解到5 mL超纯水中，这样就成功制备了 I3DDA-GR溶液。
4.根据权利要求1所述的一种检测CEA的电化学免疫传感器的构建方法，其特征在于所述步骤(3)具体为: 将45 mg BSA溶解到10 mL超纯水中，室温下搅拌5 min后，在水浴锅中加热到60 °C，迅速向溶液中加入10 mL 8 mmol/L的硝酸银，继续搅拌45 min，得到的混合溶液10000转离心分离5 min,用超纯水洗涤5次，室温下干燥后得到固体AgOBSA。
5.根据权利要求1所述的一种检测CEA的电化学免疫传感器的构建方法，其特征在于所述步骤(4)具体为: 称取I mg步骤(3)制备的AgOBSA溶解到I mL超纯水中，搅拌5 min后与I mL步骤(2)制备的TODA-GR溶液混合，室温下搅拌4 h，将得到的混合液10000转离心分离5 min,弃去上清液，溶解到I mL pH 7.4的PBS缓冲溶液中，制得GR/Ag@BSA溶液。
6.根据权利要求1所述的一种检测CEA的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于所述步骤(5)具体为: a将步骤(4)制备的I mL GR/Ag@BSA溶液与3 mL质量分数为2.5%的戊二醛溶液混合，室温下搅拌2 h，得到的混合液10000转离心分离5 min，弃去上清液，溶解到I mL pH.7.4的PBS缓冲溶液中； b将I mL 20 μ g/mL的Ab2W入上述溶液中，室温下搅拌孵育2 h，10000转离心分离.5 min，弃去上清液，重新溶解到I mL pH 7.4的PBS缓冲溶液中，得到GR/Ag@BSA_Ab2溶液。
7.根据权利要求1所述的一种检测CEA的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于所述步骤(6)具体为: a滴涂5 μ L I mg/mL的CEA第一抗体至上述步骤(I)制备的金纳米粒子修饰的玻碳电极表面，室温下孵育I h，pH 7.4的PBS缓冲溶液清洗3次，晾干； b在上述电极表面滴加5 μ L质量分数为1%的BSA溶液以封闭电极表面的非特异性活性位点，PH 7.4的PBS溶液清洗3次，晾干； c将5 μ L 0.005-150 ng/mL的CEA抗原溶液分别滴涂到不同电极表面，室温下孵育.40 min, pH 7.4的PBS缓冲溶液清洗3次，晾干； d将5 uL GR/Ag@BSA-Ab2滴到电极表面，室温下孵育40 min, pH 7.4的PBS缓冲溶液清洗3次，晾干，即得到电化学免疫传感器的工作电极； e将银/氯化银参比电极、铂丝对电极和上述制备的工作电极连接在电化学工作站上; f pH 7.4的PBS缓冲溶液作为底液，通过计时电流法检测工作电极对双氧水的响应，根据所得的电流值与CEA浓度的对数呈线性关系，绘制工作曲线。
【专利摘要】本发明涉及一种检测癌胚抗原的电化学免疫传感器的构建方法，尤其是基于石墨烯/牛血清蛋白稳定的银纳米粒子（GR/AgBSA）复合材料的检测癌胚抗原的电化学免疫传感器的构建方法。其特征在于：首先使用电位沉积方法在玻碳电极表面电沉积一层金纳米粒子，然后依次将一抗和抗原固载到电极表面，最后通过抗原抗体间的特异性反应来固定GR/AgBSA标记的二抗溶液。金纳米粒子具有优良的导电性，使用的GR/AgBSA复合材料不仅集合了GR优异的导电性和BSA良好的生物兼容性，而且还对双氧水还原有高的催化活性，基于该材料构建的电化学免疫传感器对癌胚抗原的检测有较高的灵敏度和低的检测限。
【IPC分类】G01N27-26, G01N33-574, G01N33-532
【公开号】CN104614527
【申请号】CN201510013542
【发明人】于京华, 孙国强, 张彦, 葛慎光, 颜梅, 刘海云, 杨红梅, 马超
【申请人】济南大学
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月12日