专利名称：一种发酵生产沙利霉素工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及沙利霉素的发酵工艺优化方法，特别是涉及一种菌体生长期补糖菌体产素期补油发酵生产沙利霉素工艺。
背景技术：
沙利霉素是一种聚醚类一元羧酸抗生素，具有特殊的环状结构，是典型的离子载体抗生素。沙利霉素是由白色链霉菌(Streptomysis albus)产生的聚醚类离子载体型动物专用抗生素，由于其广谱高效的抗球虫病性能而得到广大饲养者的认可。目前沙利霉素的生产主要通过生物发酵的方法进行，主要以豆油作为其主要的发酵碳源，例如中国专利CN1230596A公开的，但是随着近年来油的价格持续上升，沙利霉素的发酵成本相应有了很大的提高；并且由于油的自身特性，发酵基质中过多油的积累会造成发酵体系溶氧的降低，同时其还会附着于菌丝体表面，不利于菌体代谢，甚至还会出现发酵液结块的现象，对后期处理造成困难。2005年8月《山东大学学报(理学版)》第40卷第4期“盐霉素发酵补油工艺研究”中公开了一种菌体产素期补油的工艺，该文献虽然优化了补油工艺，即减少初始发酵培养基中的豆油含量，并在发酵过程中以豆油、脂肪酸含量分数和豆油消耗速率为指标进行补油，但是若不能使菌体代谢活力维持在一个较高的水平，依然会造成菌体对油的利用率不高，从而导致发酵水平的低下。因此，如何在菌体生长期增强菌体的代谢活力是提高发酵产量的关键因素。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种发酵生产沙利霉素工艺，菌体生长期补糖菌体产素期补油，可使沙利霉素效价提高的同时降低生产成本。一种发酵生产沙利霉素工艺，其特征在于包括以下工艺步骤
发酵培养将经斜面培养和种子培养所得种子液接种至装有培养基的发酵罐，接种量8-12%,培养温度 30-35 0C，压力 O. 04-0. 06MPa, DO 控制在 30%-100%,转速 250-500rpm ;发酵进行30-50小时开始补加糖，控制发酵液中还原糖含量为3-10g/l ;发酵进行到80-120小时，开始补加植物油，控制发酵液中脂肪酸含量为l_5wt% ;发酵进行290-310h放罐。本发明所述的菌体产素期是在发酵的次级代谢中产生沙利霉素的时间段。当发酵进行到30-50小时，培养基中的还原糖含量降低，不利于菌体的生长，本发明采用在此时间段内补加糖来促进菌体的进一步生长，根据糖浓度控制补糖速率，糖浓度控制在3-10g/l。80-120小时，菌体进入次级代谢，需补加植物油来提高发酵效价，本发明在此时间段内开始采用连续流加方式补油，根据脂肪酸含量控制补油速率，脂肪酸浓度控制在 l-5wt%。、
作为优选，所述的斜面培养是将菌株接种到斜面培养基上，26-30°C下培养6-8天。作为优选，所述斜面培养基的组成是可溶性淀粉1-3 wt%,硫酸镁O. 02-0. 08wt%，氯化钠 O. 02-0. 08 wt%，牛肉膏 O. 05-0. 2 wt%，硝酸钾 O. 05-0. 2 wt%，磷酸氢二钾O. 02-0. 08 wt%，亚硫酸铁O. 0005-0. 0015 wt%，琼脂l_3wt%，余量的蒸馏水；所述斜面培养基的pH值为6. 5-7. 5。
作为优选，所述的种子培养是将经斜面培养所得孢子接入种子培养基，在30-35°C>220-260 r/min 的条件下培养 25_30h。作为优选，种子培养基的组成是葡萄糖2-8 wt%，黄豆粉2-4 wt%，酵母粉O. 5-2wt%,轻质碳酸I丐O. 1-0. 4 wt%,余量的蒸懼水。作为优选，发酵罐中培养基的组成是蔗糖2-6 wt%，棕榈油2_8wt%，氯化钾O. 1-0. 4wt%，氯化钠 O. 05-0. 2 wt%，豆柏粉 O. 1-0. 8 wt%，胚芽粉 O. 2_lwt%，磷酸氢二钾O. 01-0. 02wt%，硫酸镁 O. 005-0. 02 wt%，乳化剂 O. 02-0. 08wt%，硫酸铵 0.1_lwt%，轻质碳酸钙O. 1-0. 5 wt%，余量的蒸馏水；所述发酵液的pH值为6. 5-7. O。作为优选，所述糖为蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉的一种或多种。作为优选，所述植物油为棕榈油、豆油、菜籽油的一种或多种。作为优选，所述补糖方式为连续流加，根据还原糖浓度控制补糖速率，还原糖浓度控制在3-10g/l。作为优选，所述补油方式为连续流加，根据脂肪酸含量控制补油速率，脂肪酸浓度控制在2-4wt%0作为优选，本发明在发酵进行到38-42小时，开始补加糖。作为优选，本发明在发酵进行到90-110小时，开始补加植物油。本发明解决了由于前期油含量较高对菌体的影响，在增强菌体代谢活力的基础上，使初级代谢到次级代谢的转换更加顺畅，从而使发酵效价有较大的提高，同时提高了油的利用率，降低了生产过程中油的消耗，解决了发酵基质中过多油的积累造成发酵体系溶氧的降低，以及发酵液结块的技术问题，本发明的技术成熟，适合工业规模化生产。
具体实施例方式本发明中种子罐及发酵罐由上海国强生化工程装备有限公司生产，本发明中DO为溶解氧，还原糖糖浓度的测定使用DNS法，脂肪酸含量的测定使用酸解比色法。本实施例采用的沙利霉素生产菌种为白色链霉菌(Streptomyces albus)。培养基成分I :
配制斜面培养基(wt%):可溶性淀粉1，硫酸镁O. 08，氯化钠O. 02，牛肉膏O. 2，硝酸钾O. 05，磷酸氢二钾O. 08，硫酸亚铁O. 0005，琼脂3，pH 6.5，余量为蒸馏水；并进行灭菌
O配制种子培养基(wt%):葡萄糖2，黄豆粉4，酵母粉O. 5，轻质碳酸钙O. 4，余量为蒸馏水；
配制发酵培养基(wt%):蔗糖2，棕榈油8，氯化钾0.1，氯化钠O. 2，豆柏粉0.1，胚芽粉1，磷酸氢二钾O. 01，硫酸镁O. 02，乳化剂O. 02，硫酸铵1，轻质碳酸钙0.1，pH 7.0，余量为蒸馏水；并进行灭菌。培养基成分2
斜面培养基(wt%):可溶性淀粉3，硫酸镁O. 02，氯化钠O. 08，牛肉膏O. 05，硝酸钾0.2，磷酸氢二钾O. 02，硫酸亚铁O. 0015，琼脂1，余量的蒸馏水；所述斜面培养基的pH值为7.5。种子培养基(wt%):葡萄糖8，黄豆粉2，酵母粉2，轻质碳酸钙0.1，余量为蒸馏水。发酵罐的培养基(wt%):蔗糖6，棕榈油2，氯化钾O. 4，氯化钠O. 05，豆柏粉O. 8，胚芽粉O. 2，磷酸氢二钾O. 02，硫酸镁O. 005，乳化剂O. 08，硫酸铵O. I，轻质碳酸钙O. 5，余量为蒸馏水；所述发酵液的PH值为6. 5。 培养基成分3
斜面培养基(wt%):可溶性淀粉2，硫酸镁O. 06，氯化钠O. 04，牛肉膏O. 1，硝酸钾0.1，磷酸氢二钾O. 05，硫酸亚铁O. 001，琼脂2，余量为蒸馏水；所述斜面培养基的pH值为 7. O。种子培养基(wt%):葡萄糖5，黄豆粉3，酵母粉1，轻质碳酸钙O. 3，余量为蒸馏水。发酵罐的培养基(wt%):蔗糖3，棕榈油5，氯化钾O. 3，氯化钠O. 15，豆柏粉O. 5，胚芽粉O. 8，磷酸氢二钾O. 015，硫酸镁O. 01，乳化剂O. 05，硫酸铵O. 5，轻质碳酸钙O. 3，余量为蒸馏水；所述发酵液的pH值为6. 8。
实施例I :
使用培养基成分I
(1)斜面培养将白色链霉菌菌株接种到新鲜斜面上，26°C下培养8天；
(2)种子培养将步骤(I)所得孢子接入种子培养基，在30°C、260r/min的条件下培养
30h ；
(3)发酵培养将步骤(2)所得种子液接种至发酵罐(15L罐，灭菌后大概8升发酵培养基)，接种量8%，培养温度30-35°C，压力O. 05MPa，D0控制在30-40%，转速400-500rpm，发酵进行到30小时，开始以8-12ml/H连续流加质量百分含量为20%的蔗糖水溶液，控制发酵液中还原糖含量为3g/l，发酵进行到90小时，开始以3-5ml/H连续流加棕榈油，控制发酵液中脂肪酸含量为2wt%，发酵290小时放罐。
实施例2
使用培养基成分2
(1)斜面培养将白色链霉菌菌株接种到新鲜斜面上，30°C下培养6天；
(2)种子培养将步骤(I)所得孢子接入种子培养基，在35°C、220r/min的条件下培养
28h ；
(3)发酵培养将步骤(2)所得种子液接种至发酵罐(30L罐，灭菌后大概16升发酵培养基)，接种量12%，培养温度30-35°C，压力O. 06MPa, DO控制在80_100%，转速250_300rpm，发酵进行到42小时，开始以18-22ml/H连续流加质量百分含量为20%的葡萄糖水溶液，控制发酵液中还原糖含量为10g/l，发酵进行到110小时，开始以8-12ml/H连续流加豆油，控制发酵液中脂肪酸含量为5wt%，发酵300小时放罐。
实施例3
使用培养基成分3
(1)斜面培养将白色链霉菌菌株接种到新鲜斜面上，28°C下培养7 天；
(2)种子培养将步骤(I)所得孢子接入种子培养基，在32°C、240r/min的条件下培养
26h ；
(3)发酵培养将步骤(2)所得种子液接种至发酵罐(50L罐，灭菌后大概24升发酵培养基)，接种量10%，培养温度30-35°C，压力O. 04MPa, DO控制在60_80%，转速300_400rpm，发酵进行到40小时，开始以18-22ml/H连续流加质量百分含量为15%的可溶性淀粉溶液，控制发酵液中还原糖含量为6g/l，发酵进行到100小时，开始以4-6mL/H连续流加菜籽油，控制发酵液中脂肪酸含量为lwt%，发酵310小时放罐。
实施例4
使用培养基成分I
(1)斜面培养将白色链霉菌菌株接种到新鲜斜面上，26°C下培养8天；
(2)种子培养将步骤(I)所得孢子接入种子培养基，在30°C、260r/min的条件下培养
30h ；
(3)发酵培养将步骤(2)所得种子液接种至发酵罐(15L罐，灭菌后大概8升发酵培养基)，接种量8%，培养温度30-35 °C，压力O. 04MPa, DO控制在30_50%，转速400-500rpm，发酵进行到38小时，开始分别以4-6mL/H流加方式补加质量百分含量为20%的可溶性淀粉水溶液和质量百分含量为20%的蔗糖水溶液，控制发酵液中还原糖含量为3g/l，发酵进行到80小时，分别以3-5mL/H流加方式补加棕榈油和豆油，控制发酵液中脂肪酸含量为2wt%，发酵290小时放罐。
实施例5
使用培养基成分2
(1)斜面培养将白色链霉菌菌株接种到新鲜斜面上，30°C下培养6天；
(2)种子培养将步骤(I)所得孢子接入种子培养基，在35°C、220r/min的条件下培养
25h ；
(3)发酵培养将步骤(2)所得种子液接种至发酵罐(30L罐，灭菌后大概16升发酵培养基)，接种量12%，培养温度30-35°C，压力0.05MPa，DO控制在40_60%，转速350_450rpm，发酵进行到50小时，开始分别以8-12mL/H流加方式补加质量百分含量为20%的可溶性淀粉水溶液和质量百分含量为20%的蔗糖水溶液，控制发酵液中还原糖含量为8g/l，发酵进行到120小时，分别以6-10mL/H流加方式补加菜籽油和豆油，控制发酵液中脂肪酸含量为4wt%,发酵300小时放罐。实施例6
使用培养基成分3
(1)斜面培养将白色链霉菌菌株接种到新鲜斜面上，28°C下培养7天；
(2)种子培养将步骤(I)所得孢子接入种子培养基，在32°C、240r/min的条件下培养
28h ；
(3)发酵培养将步骤(2)所得种子液接种至发酵罐(30L罐，灭菌后大概24升发酵培养基)，接种量10%，培养温度30-35°C，压力0.06MPa，DO控制在50_70%，转速250_350rpm，发酵进行到40小时，开始分别以4-6ml/H连续流加质量百分含量为15%的可溶性淀粉水溶液、质量百分含量为20%的葡萄糖水溶液和质量百分含量15%的为蔗糖水溶液，控制发酵液中还原糖含量为6g/l，发酵进行到90小时，开始以8-12mL/H连续流加菜籽油、豆油和棕榈 油，控制发酵液中脂肪酸含量为3wt%，发酵310小时放罐。
对比实施例I
同实施例1，不同的是发酵培养时只补糖不补油，具体是将步骤(2)所得种子液接种至发酵罐(15L罐，灭菌后大概8升发酵培养基)，接种量8%，培养温度30-35°C，压力O. 05MPa，DO控制在30-40%，转速400_500rpm，发酵进行到38小时，开始以8_12ml/H连续流加质量百分含量为20%的蔗糖水溶液，控制发酵液中还原糖含量为3g/l，发酵290小时放罐。
对比实施例2
同实施例2，不同的是发酵培养时只补油不补糖，具体是将步骤(2)所得种子液接种至发酵罐(30L罐，灭菌后大概16升发酵培养基)，接种量12%，培养温度30-35°C，压力O. 06MPa，D0控制在80-100%，转速250_300rpm，发酵进行到42小时，开始以6-lOml/H连续流加豆油，控制发酵液中脂肪酸含量为4wt%，发酵300小时放罐。
对比实施例3
同实施例3，不同的是发酵培养时先补油后补糖，具体是将步骤(2)所得种子液接种至发酵罐(50L罐，灭菌后大概24升发酵培养基)，接种量10%，培养温度30-35°C，压力O. 04MPa，DO控制在60-80%，转速300_400rpm，发酵进行到40小时，开始以8_12mL/H连续流加菜籽油，控制发酵液中脂肪酸含量为3wt%，发酵进行到100小时，开始以16-20ml/H连续流加质量百分含量为8%的可溶性淀粉溶液，控制发酵液中还原糖含量为6g/l，发酵310小时放罐。
对比实施例4
同实施例4，不同的是发酵培养时发酵液中糖含量为lg/1。
对比实施例5
同实施例4，不同的是发酵培养时发酵液中脂肪酸含量为6wt%。对比实施例6
同实施例6，不同的是发酵培养时只补糖不补油，具体是将步骤(2)所得种子液接种至发酵罐(15L罐，灭菌后大概8升发酵培养基)，接种量8%，培养温度30-35°C，压力O. 05MPa，DO控制在30-40%，转速400_500rpm，发酵进行到100小时，开始以4_6ml/H连续流加质量百分含量为20%的蔗糖水溶液，控制发酵液中还原糖含量为3g/l，发酵290小时放罐。
对比实施例7
同实施例6，不同的是发酵培养时只补糖不补油，具体是将步骤(2)所得种子液接种至发酵罐(30L罐，灭菌后大概16升发酵培养基)，接种量12%，培养温度30-35°C，压力
O.06MPa, DO控制在80-100%，转速250_300rpm，发酵进行到100小时，开始以8_12ml/H连续流加豆油，控制发酵液中脂肪酸含量为4wt%，发酵300小时放罐。结果见下表。表I
^賴咸茶m的利_.率效价(u/ i)丨实麄《与34丨实鹿例_对
(元/公斤) (%)比例成幕比比例效&比
____较( )较(W
I 38.5 I 82 I 70125 | -26,82124.4
对比实 IIWl 52.660S31256
实廳例 2__ST1S__86 __72531-8.965. SI
对 fctl 施侧 2 41.376%SST39
实_ 3__36^2__90%__75425-16.9818.73
对比实施W 3 43.672%63527
实IfcW 4__37.088 __73423-13.5512.21
对比 实施 ffiU 42.875%85432
实MlW 537.786%72351-27,.222T, 53
ΕΙΕΙΤ 5 1 5jL 8 I 7T% IjII
实Il例 g38.6__83%_ 70138-24. 76BI, 32
对比3 施We 51.365%36754
‘批实SI 例 7 41.2m68 3 2
由以上实施例和对比实施例可以看出，本发明实施例通过菌体生长期补糖菌体产素期补油发酵生产沙利霉素工艺，与仅在菌体生长期补糖(对比实施例I)、仅在菌体生长期补油(对比实施例2)、菌体生长期补油菌体产素期补糖(对比实施例3)、仅在菌体产素期补糖(对比实施例6)、仅在菌体产素期补油(对比实施例7)相比，本发明工艺不仅可以使效价增加，同时可以使原料成本大为降低，所得沙利霉素产品质量稳定可靠，本发明提供的补糖工艺适合大规模工业化生产。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保 护。
权利要求
1.一种发酵生产沙利霉素工艺，其特征在于包括以下工艺步骤 发酵培养将经斜面培养和种子培养所得种子液接种至装有培养基的发酵罐，接种量8-12%,培养温度 30-35 0C，压力 O. 04-0. 06MPa, DO 控制在 30%-100%,转速 250-500rpm ;发酵进行30-50小时开始补加糖，控制发酵液中还原糖含量为3-10g/l ;发酵进行到80-120小时，开始补加植物油，控制发酵液中脂肪酸含量为1_5被％;发酵进行290-310h放罐。
2.根据权利要求I所述的一种发酵生产沙利霉素工艺，其特征在于所述的斜面培养是将菌株接种到斜面培养基上，26-30°C下培养6-8天。
3.根据权利要求2所述的一种发酵生产沙利霉素工艺，其特征在于斜面培养基的组成是可溶性淀粉1-3 wt%，硫酸镁O. 02-0. 08 wt%，氯化钠O. 02-0. 08 wt%，牛肉膏O. 05-0. 2 wt%,硝酸钾O. 05-0. 2 wt%,磷酸氢二钾O. 02-0. 08 wt%,亚硫酸铁O. 0005-0. 0015 wt%，琼脂l_3wt%，余量的蒸馏水；所述斜面培养基的pH值为6. 5-7. 5。
4.根据权利要求I所述的一种发酵生产沙利霉素工艺，其特征在于所述的种子培养是将经斜面培养所得孢子接入种子培养基，在30-35°C、220-260 r/min的条件下培养25-30h。
5.根据权利要求4所述的一种发酵生产沙利霉素工艺，其特征在于种子培养基的组成是葡萄糖2-8 wt%,黄豆粉2-4 wt%,酵母粉O. 5-2wt%,轻质碳酸I丐O. 1-0.4 wt%,余量的蒸馏水。
6.根据权利要求I所述的一种发酵生产沙利霉素工艺，其特征在于发酵罐中培养基的组成是鹿糖2-6 wt%,棕榈油2-8wt%,氯化钾O. 1-0. 4wt%,氯化钠O. 05-0. 2 wt%,豆柏粉O. 1-0. 8 wt%，胚芽粉 O. 2-lwt%，磷酸氢二钾 O. 01-0. 02wt%，硫酸镁 O. 005-0. 02 wt%，乳化剂O. 02-0. 08wt%,硫酸铵O. l-lwt%,轻质碳酸I丐O. 1-0. 5 wt%,余量的蒸懼水；所述发酵液的PH值为6. 5-7.0。
7.根据权利要求I所述的一种发酵生产沙利霉素工艺，其特征在于所述补加的糖为蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉的一种或多种。
8.根据权利要求I所述的一种发酵生产沙利霉素工艺，其特征在于所述植物油为棕榈油、豆油、菜籽油的一种或多种。
9.根据权利要求I或7所述的一种发酵生产沙利霉素工艺，其特征在于补糖方式为连续流加，根据还原糖浓度控制补糖速率，还原糖浓度控制在3-10g/l。
10.根据权利要求I或8所述的一种发酵生产沙利霉素工艺，其特征在于补油方式为连续流加，根据脂肪酸含量控制补油速率，脂肪酸浓度控制在2-4wt%。
全文摘要
本发明公开了发酵生产沙利霉素工艺，当发酵进行到30-50小时，开始补加糖，发酵进行到80-120小时，开始补加植物油，发酵290-310小时放罐。本发明解决了由于菌体生长期油含量较高对菌体的影响，使初级代谢到次级代谢的转换更加顺畅，从而使发酵单位有较大的提高，同时提高了油的利用率，降低了生产过程中油的消耗，解决了发酵基质中过多油的积累造成发酵体系溶氧的降低，以及发酵液结块的技术问题，本发明的技术成熟，适合工业规模化生产。
文档编号C12P17/18GK102643880SQ201210129748
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月28日 优先权日2012年4月28日
发明者储消和, 沈建, 蔡群芳, 陈中兵, 高圣君, 黄会鸽, 黄海涛 申请人:内蒙古拜克生物有限公司, 浙江升华拜克生物股份有限公司