专利名称：康乐霉素c的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种用于自身免疫溶血性贫血、肾炎、结蹄组织以及脏器移植排斥反应的新免疫抑制剂康乐霉素C的生产方法。
目前开发的免疫抑制剂，其药物选择性强，专一性地调节某一免疫细胞的亚族。代表药物如环孢菌素A，能选择性抑制T辅助细胞的克隆(无性繁殖系)的增殖，在器官移植方面取得了可喜的成绩，并已广泛用于临床。然而，也发现一些副作用，如个别患者用药后出现急性和慢性肾中毒、轻度震颤、神经病变、齿龈肥厚和多毛等副作用。最近发现的FK-506属于大环内酯类抗生素(C44H69NO12)，虽然实验研究结果满意，但因生产复杂，限制了临床上广泛应用。
本发明目的在于克服现有免疫抑制剂的各种缺点，寻找更理想替代药物。康乐霉素C的化学结构新颖，有别于迄今所有的免疫抑制剂，分子量小，结构简单，便于修饰。研究表明，康乐霉素C的免疫抑制作用与环孢菌素A相似或稍强，同时有抑制肿瘤细胞的作用，有可能成为更有特点的新一代免疫抑制剂。
本发明的特点是用一株奴卡氏菌进行培养发酵，然后用有机溶剂萃取、柱层析分离和纯化，其条件为(1)菌种培养基(%)KNO30.1、NaCl 0.5、K2HPO40.05、FeSO40.01、淀粉2、琼脂1.7、冷开水、PH7.0、28℃培养5～7天;
(2)种子培养基(%)葡萄糖2～5、酵母粉0.1～1.5、kCl 0.1～0.5、黄豆饼粉 0.1～2.5、K2HPO40.01～0.5、(NH4)2SO40.1～2、MgSO40.01～0.1、CaCO30.1～1、自来水100ml、自然PH;
(3)发酵培养基(%)葡萄糖2～5、酵母粉0.5～2、黄豆饼粉0.1～1.5、蛋白胨0.05～0.5、CaCO30.01～1.0、自来水100ml、自然pH。
以上培养基均15磅消毒30分钟备用。将斜面挖块接种于种子培养基摇瓶中(30～70ml装量/250ml)，置180～200转/(分钟)旋转摇床，25～32℃培养24～55小时后，以5～15%接种量转入发酵培养基摇瓶(30～100ml装量/500ml)，在180～200转/(分钟)旋转摇床25～32℃培养68～96小时供提取用。将发酵液过滤后，用无机酸调pH值在1～5范围，再用乙酸丁酯萃取，萃取液浓缩后，在硅胶柱上分离，用苯和甲醇混合液(30∶1)洗脱，收集活性部分并浓缩，在LH-20柱上纯化用乙醇洗脱，收集活性部分并浓缩，用乙醇重结晶，即得纯品。康乐霉素C为黄色棒状结晶，在170℃分解变成黑色，分子量为326，旋光度为+150°(10-4)，紫外光谱中在232纳米，356纳米有最大吸收，红外光谱中在3400cm-1、1690cm-1、1650cm-1、750cm-1等处有吸收，溶于极性有机溶剂，不溶于水和非极性有机溶剂。
0.5μg/ml的康乐霉素C对小鼠脾淋巴细胞转化的抑制率达96.9%。在小鼠脾细胞培养时，康乐霉素C(40μg/ml)没有表现出毒性，在1mg/ml浓度下，对精原细胞无作用。对小鼠静脉注射(2mg/kg)没有发生死亡现象，证明毒性较低。抑制k562白血病细胞增值小于0.1μg/ml，对Hela S3细胞的抑制浓度为1μg/ml。
本发明的优点和积极效果是，目前发现的免疫抑制剂中，康乐霉素C的分子量最小，化学结构全新，提取工艺简单，化学合成及结构改造较方便，免疫抑制作用强，毒性低，因而具有应用推广价值。
图1为康乐霉素C的紫外吸收光谱。
图2为康乐霉素C的红外吸收光谱。
实施例用一株奴卡氏菌进行培养发酵，然后用有机溶剂萃取、柱层析分离和纯化，其条件为(1)菌种培养基(%)KNO30.1、NaCl 0.5、K2HPO40.05、FeSO40.01、淀粉2、琼脂1.7、冷开水、PH7.0、28℃培养5～7天;
(2)种子培养基(%)葡萄糖2.5、酵母粉0.5、kCl 0.25、黄豆饼粉0.5、K2HPO40.02、(NH4)2SO40.5、MgSO40.02、CaCO30.5、自来水100ml、自然PH;
(3)发酵培养基(%)葡萄糖3、酵母粉1、黄豆饼粉0.5、蛋白胨0.2、CaCO30.1、自来水100ml、自然pH。
以上培养基均15磅消毒30分种备用。将斜面挖块接种于种子培养基摇瓶中(50ml装量/250ml)，置180～200转/(分钟)旋转摇床，28℃培养48小时后，以10%接种量转入发酵培养基摇瓶(50ml装量/500ml)，在180～200转/(分钟)旋转摇床28℃培养72小时供提取用。将发酵液过滤后，用无机酸调pH值到4，再用乙酸丁酯萃取，萃取液浓缩后，在硅胶柱上分离，用苯和甲醇混合液(30∶1)洗脱，收集活性部分并浓缩，在LH-20柱上纯化用乙醇洗脱，收集活性部分并浓缩，用乙醇重结晶，即得纯品。康乐霉素C为黄色棒状结晶，在170℃分解变成黑色，分子量为326，旋光度为+150°(10-4)，紫外光谱中在232纳米，356纳米有最大吸收，红外光谱中在3400cm-1、1690cm-1、1650cm-1、750cm-1等处有吸收。溶于极性有机溶剂，不溶于水和非极性有机溶剂。
权利要求
1.一种康乐霉素C的生产方法，其特征是用一株奴卡氏菌进行培养、发酵，然后用有机溶剂萃取、柱层析分离和纯化。
2.按权利要求1所述的生产方法，特征是培养和发酵包含菌种培养基、种子培养基、发酵培养基三种培养基和发酵条件。
3.按权利要求2所述的生产方法，其特征是菌种培养条件为KNO30.1%，NaCl0.5%，K2HPO40.05%，FeSO40.01%，淀粉2%，琼脂1.7%，冷开水，pH7.0，28℃培养5～7天。
4.按权利要求2所述的生产方法，其特征是种子培养基条件为葡萄糖2～5%，酵母粉0.1～1.5%，KCl0.1～0.5%，黄豆饼粉0.1～2.5%，K2HPO40.01～0.5%，(NH4)2SO40.1～2%，MgSO40.01～0.1%，CaCO30.1～1%，自来水100ml，自然pH值。
5.按权利要求2所述的生产方法，其特征是发酵培养基条件为葡萄糖2～5%，酵母粉0.5～2%，黄豆饼粉0.1～1.5%，蛋白胨0.05～0.5%，CaCO30.01～1.0%，自来水100ml，自然pH。
6.按权利要求4、5所述的生产方法，其特征是将斜面挖块接种于种子培养基摇瓶中(30～70ml装量/250ml)，在180～200转/(分钟)旋转摇床上，25～32℃培养24～55小时后，以5～15%接种量转入发酵培养基摇瓶(30～100ml装量/500ml)，在180～200转/(分钟)旋转摇床上25～32℃培养68～96小时供提取用。
7.按权利要求6所述的生产方法，其特征是将发酵液过滤后，用无机酸调pH值1～5范围，再用乙酸丁酯萃取，萃取液浓缩后，在硅胶柱上分离，用苯和甲醇混合液(30∶1)洗脱，收集活性部分并浓缩，在LH-20柱上纯化，用乙醇洗脱，收集活性部分并浓缩，用乙醇重结晶，即得纯品。
全文摘要
康乐霉素C是从一株奴卡氏菌的发酵液中，经过滤去菌丝，用酸调pH值至酸性，用有机酯类萃取，将萃取液浓缩后，在硅胶柱上分离用苯和甲醇混合液洗脱，收集活性部分并浓缩，在LH-20柱上纯化，用醇类有机溶剂洗脱，收集活性成分并浓缩，用醇类有机溶剂重结晶即得纯品。该化合物溶于极性有机溶剂，免疫抑制作用与环孢菌素A相似，并有抗肿瘤作用，毒性很低。本发明提取工艺简单，化学合成及结构改造较方便。
文档编号C12P1/04GK1064504SQ9110112
公开日1992年9月16日 申请日期1991年3月1日 优先权日1991年3月1日
发明者王南金, 杨贤树 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所