异养硝化-好氧反硝化的门多萨假单胞菌及其培养和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株异养硝化-好氧反硝化的门多萨假单胞菌及其培养和应用。该菌株为门多萨假单胞菌（Pseudomonasmendocina）WZUF22，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC?No.7523。本发明的菌株WZUF22进行异养硝化和好氧反硝化的适宜pH和温度范围广，对NH4+-N、NO3--N和NO2--N的去除率高，可为同步硝化和反硝化提供种源。
【专利说明】异养硝化-好氧反硝化的门多萨假单胞菌及其培养和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株异养硝化-好氧反硝化的门多萨假单胞菌及其培养和应用。
【背景技术】
[0002]氮素给环境造成的污染问题近年来日益突出，其危害性也日益被人们认识和重视。如氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮有可能转化为致癌、致突变和致畸的亚硝胺；又如氮素流入水体造成水体富营养化，引起水质恶化以至湖泊退化。生物脱氮具有处理效果好、处理过程稳定可靠、操作管理方便等的优点而得到广泛应用。
[0003]传统的生物脱氮由自养硝化菌的硝化作用和厌氧反硝化菌的反硝化作用完成。20世纪80年代以后,人们发现许多细菌如突光假单胞菌(PsGudomorms flur- escens )、粪产喊菌(Alaligenes face alls )、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginos)等可以进行异养5肖化，月兑氣苜1J球菌(Paracoccus denitrificans) > Pseudmonas spp.和
faecal is等能进行好氧反硝化，Paracoccus pantotrophus等可以异养硝化_好氧反硝化(微生物学通报，2009，36 (2):255~260)。与自养型硝化菌比较，异养硝化菌的生长速率快，细胞产率高，需要的溶解氧浓度低，能耐受酸性环境且活性高，并且能够代谢各种形态的氮化合物，同时提高COD的去除率。好氧反硝化和异养硝化的发现打破了传统的生物脱氮理论，使得同步硝化和反硝化成为可能，不仅可以降低运行成本，减少工艺上繁琐的操作，还可以扩大自养硝化菌所不能处理的水质范围。
[0004]到目前为止，已有许多异养硝化或好氧反硝化或异养硝化-好氧反硝化的菌株被分离获得。分离自不同环境的菌株，其生理特性和除氮能力各具特色，它们可为实际应用或进一步的菌株改造提供丰富的种源。如李小龙等从鱼塘水样中分离到I株不动杆菌(Acinetobacter sp.),以 KNO3、( NH4)2 SO4、NaNO2 为唯一氮源的培养液中，可在 24h内将培养液中NO3--N从161.61 mg.1降至55.69 mg.?Λ去除速率为4.41 mg.1IT1 NOf-N ；15 h 内将 NH: -N 由 220.24 mg.1 降至 14.78 mg.?Λ 去除速率为 13.70mg.L 1Ii 1 NH4+ - N ； 12 h 内 NO2 -N 浓度由 101.27 mg.L 1 降至 21.85 mg.L 1,去除速率为6.62mgNO2--N ;但其脱氮的适宜pH为偏碱性的；20°C时不生长，40°C时在NH4+_N测定液中生长缓慢，在Ν02_-Ν测定液中不生长，最佳生长温度为30 V (微生物学报，2011，51
(8): 1062-1070)，其对pH值和温度的要求较高，适用范围小。又如Jibin Zhang等从猪粪污水中分离获得I株施氏假单胞菌iPsoudomorms stutzeri YZN-001),在10°C、20°C、30°C和 37。。下，NH:-N 的硝化速率分别约为 1.48、4.20、5.53 和 5.59 mg.Li1 NH: - N ;在 30°C下硝酸硝化率和亚硝酸硝化率分别为11.46 mg.L-V1 NO2--N和10.99 mg.L-1 h-1 Ν03_-Ν(Bioresource Technology, 2011，102: 9866 - 9869)，其去除铵态氮能力较弱。
【发明内容】
[0005]为了解决上述技术问题，本发明提供了一株异养硝化-好氧反硝化的门多萨假单胞菌及其培养和应用。
[0006]本发明提供的一株异养硝化_好氧反硝化的门多萨假单胞菌，该菌株为门多萨假 单胞菌iPseudomonas mendocina) WZUF22,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC N0. 7523。
[0007]本发明还提供上述门多萨假单胞菌的培养方法，包括如下步骤：
1)保藏菌株WZUF22接种于LB培养基中，培养12h以上，离心，得菌体，菌体用无菌水 洗涤后制成0D-为0. 900?1. 000的菌悬液；
2)步骤1)得到的菌悬液接种于硝化培养基或反硝化培养基中，进行培养；
其中，所述硝化培养基的构成为：氮源，碳源，Mg S04, K2HP04, NaCl，MnS04，FeS04, H20,所 述碳源为柠檬酸钠、丁二酸钠或乙酸钠的其中一种或其组合，所述氮源为含铵离子的化合 物提供；所述反硝化培养基的配方为：碳源，氮源，1(2即04，？必04，1%304，1120，所述碳源为柠檬 酸钠、丁二酸钠或乙酸钠的其中一种或其组合，所述氮源为含硝酸根或亚硝酸根的化合物。
[0008]优选地，：氮源的NH:的质量 0. 34 g，碳源，Mg S04 ? 7H20 0. lg，K2HP04 0. 5g， NaCl 0. 2g, MnS04 ? 4H20 0. 02g, FeS04 0 . 02g, H20 1000 ml, pH 值为 5. 0?10，所述碳源与氮 源的NH:的质量比为5:0. 34?15:0. 34 ;反硝化培养基：碳源，氮源，K2HP04 lg, FeS04 ? 7H2 0 0. 20g, MgS04 ? 7H20 0. 10 g, H20 1000 ml, pH值为5. (TlO，所述氮源为含硝酸根的化合 物时，氮源中硝酸根的质量为o. 61g,所述碳源与N<V的质量比为5:0. 61"15:0. 61,所述氮 源为含亚硝酸根的化合物时，氮源中亚硝酸根的质量为0. 67g，所述碳源与N02_的质量比为 5:0. 0. 67?15:0. 67。
[0009]优选地，步骤1)保藏菌株WZUF22接种于LB培养基中，于20?40°C，溶氧3. 5? 6.1 mg* r1的条件下培养；步骤2)的菌悬液接种于硝化培养基或反硝化培养基中，于 20?40°C，溶氧3. 5?6. 1 mg ? I71下培养。
[0010]优选地，所述硝化培养基或反硝化培养基的pH值为5. (TlO，pH以HC1或NaOH水 溶液进行调节。
[0011]优选地，步骤2)中所述菌悬液以5%的体积比接种于硝化培养基或反硝化培养基 中。
[0012]本发明还提供上述的门多萨假单胞菌的应用，将所述门多萨假单胞菌WZUF22接 种于含氮水溶液中，进行异养硝化脱氮和/或好氧反硝化脱氮。
[0013]作为优选技术方案，所述含氮水溶液为含有NH4+、N03_和N02_的一种或其组合的水 溶液。
[0014]优选地，所述门多萨假单胞菌WZUF22异养硝化脱NH4+-N与好氧反硝化脱N03__N和 no2_-n的碳源含有柠檬酸钠、乙酸钠或丁二酸钠的其中一种或其组合。含氮水溶液中的氮 源只为NH4+-时，碳源与含氮水溶液中NH4+的质量比为5:0. 34^15:0. 34 ;含氮水溶液中的氮 源只为N03_-时，碳源与含氮水溶液中N03_-的质量比为5:0. 6ri5:0. 61 ;含氮水溶液中的 氮源只为N02_-时，碳源与含氮水溶液中N02_-的质量比为5:0. 67^15:0. 67。
[0015]作为优选技术方案，所述门多萨假单胞菌WZUF22异养硝化脱NH/-N与好氧反硝化 脱 NCV-N 和 NCV-N 的 pH 为 4 ?10. 5。
[0016]作为优选技术方案，所述门多萨假单胞菌WZUF22异养硝化脱NH/-N与好氧反硝化 脱N03--N和N02--N的温度为10°C?40°C。[0017]作为优选技术方案，所述门多萨假单胞菌WZUF22异养硝化脱NH4+_N与好氧反硝化脱 NOf-N 和 NOf-N 的溶氧为 1.3 ~7.3mg.L' 更优选 3.5~6.1 mg.I71。
[0018]本发明能够达到以下技术效果:
1、本发明的菌株WZUF22进行异养硝化和好氧反硝化的适宜pH和温度范围广，对nh4+-n、no3_-n和Ν02_-Ν的去除率高，可为同步硝化和反硝化提供种源。
[0019]2、本发明经研究提供了适合菌株WZUF22培养的硝化、反硝化培养基和培养方法，可培养获得大量菌体。
[0020]3、在菌株WZUF22的最佳脱氮条件下，含氮水溶液中的NH4+_N的去除率能够达到70%以上，并且无NO3--N和NO2--N积累；N03--N和NOf-N的去除率能够达到100%。
[0021]4、利用本发明的菌株能够有效地对废水进行处理，降低废水C0D，并且脱氮效果良好。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是采用MEGA4.1软件，邻位连接法显示菌株WZUF22与相关种的16S rDNA序列系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50%数值,上标的“T”表示模式菌株(P., Pseudomonas')。
[0023]图2是菌株去除人工配制的NH4+-N污水进程。
[0024]图3是菌株去除人工配制的Ν03_-Ν污水进程。
[0025]图4是菌株去除人工配制的Ν02_-Ν污水进程。
[0026]菌株保藏
本发明的门多萨假单胞菌iPsGudomorms mendocina ) WZUF22,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏中心登记入册编号为CGMCC N0.7523，保藏起始日期为2013年4月26日。
【具体实施方式】
[0027]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0028]实施例一:异养硝化-好氧反硝化的门多萨假单胞菌菌株的分离
样品为取自温州西片污水处理厂的活性污泥，采用常规分离法，将一定量活性污泥接种于富集培养基(NH4Cl lg，柠檬酸钠 5g，Mg SO4.7H20 0.lg, K2HPO4 0.5g，NaCl 0.2g，MnSO4.4H20 0.02g, FeSO4 0.02g, H2O 1000 ml, pH 7.0)于 30°C 160 ~180 rpm 下进行富集培养3~4天，待长出细菌后转接新的富集培养基继续富集培养，如此重复4~5次。然后将经适当稀释的菌液涂布于分离培养基(琼脂18g吨―1，其他成分同富集培养基)于30°C下培养48 h，挑取单菌落转接新的分离培养基进行划线纯化，直至经镜检为纯培养物，然后转接保藏培养基(牛肉膏10g，蛋白胨10g，NaCl 5g,琼脂18g，H2O 1000 ml，pH 7.0)于30°C下培养后保藏。
[0029]分别将保藏菌株接种于硝化培养基(柠檬酸钠IOg.L—1，其他成分同富集培养基)于30°C 160~180 rpm下培养(250ml锥形瓶装培养基100ml)，定时取样分别用纳氏试剂、格利斯试剂I和II以及二苯胺检测nh4+-n、no2_-n和Ν03_-Ν，根据Ν03_-Ν和Ν02_-Ν的生成和降解情况以及nh4+-n的降解情况，对保藏菌株的异养硝化-好氧反硝化性能进行初步筛选。对初步筛选获得的异养硝化-好氧反硝化菌株进行反硝化性能测定，测定方法按文献进行(东秀珠，常见细菌系统鉴定手册，北京:科学出版社，2001)，以进一步确定异养硝化-好氧反硝化性能。
[0030]将初筛获得的异养硝化-好氧反硝化菌株进行异养硝化性能的复筛，方法为将菌株接种于硝化培养基(柠檬酸钠IOg.L—1，其他成分同富集培养基)于30°C 160~180 rpm下培养24 h (250ml锥形瓶装培养基100ml),然后于8000rpm下离心IOmin后测定上清液的nh4+-n、no2_-n和Ν03_-Ν浓度，计算NH4+-N的去除率和Ν02_-Ν和Ν03_-Ν的积累情况，筛选nh4+-n去除能力强no2_-n和no3_-n积累低甚至没有积累的优良菌株。
[0031]然后对异养硝化-好氧反硝化菌株进行好氧反硝化性能的复筛，方法为将菌株接种于反硝化培养基(丁二酸钠 log, KNO3 1.0g, K2HPO4 lg, FeSO4.7H2 O 0.20g, MgSO4.7H200.10 g, H2O 1000 ml, pH 7.0)于 30°C 160 ~180 rpm 下培养 24 h (250ml 锥形瓶装培养基100ml),然后于8000rpm下离心IOmin后测定上清液的NOf-N和NOf-N浓度,计算NOf-N的去除率和Ν02_-Ν的积累情况，筛选N03_-N去除能力强Ν02_-Ν积累低甚至没有积累的优良菌株。
[0032]经上述方法获得I株优良的异养硝化-好氧反硝化菌株，编号为WZUF22。
[0033]其中，Ν03_-Ν测定采用酚二磺酸法分光光度法，Ν02_-Ν测定采用N- (1-萘基)-乙二胺光度法，NH/-N测定采用纳氏试剂比色法(国家环境保护局.水和废水监测分析方法(第三版).北京:中国环境科学出版社，1989)。
[0034]NH4+-N去除率(%)=(培养前上清液NH/-N浓度-培养后上清液NH4+-N浓度)/培养前上清液NH4+-N浓度X 100%
NO3--N去除率(%)=(培养前上清液NO3--N浓度-培养后上清液NO3--N浓度)/培养前上清液NOf-N浓度X 100%
实施例二:异养硝化-好氧反硝化菌株的鉴定
菌株WZUF22在分离培养基培养48h后菌落呈圆形、半透明、表面不光滑、边缘不整齐、菌落呈淡黄色，菌细胞短杆状，大小0.7~0.8 X 1.5~3.2 μ m，无芽孢，革兰氏阴性，单极鞭毛。
[0035]以细菌基因组DNA为模板扩增16SrDNA，扩增采用一对通用引物:上游引物(Pl):5’ -AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3’，下游引物(P6):5’ -TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’，PCR产物的纯化和测序由上海生物工程有限公司完成，测序结果通过GeenBankBlast进行比对分析。与GeenBank中的假单胞菌属iPseudomorms sp.)的16SrDNA序列具有很高同源性，与P.mendocina的同源性为99.4%。采用MEGA4.1软件，邻位连接法显示菌株WZUF22与相关种的16S rDNA序列系统发育树见图1。
[0036]门多萨假单胞菌mendocina ) WZUF22,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏中心登记入册编号为CGMCC N0.7523，保藏起始日期为2013年4月26日。
[0037]实施例三:菌株WZUF22去除NH4+_N和NOf-N的特性
采用单因子试验法，研究菌株WZUF22分别进行异养硝化去除NH/-N和好氧反硝化去除NO3--N的特性。[0038]实验过程为:保藏菌株WZUF22 (2.0ml冷冻管融化的菌液)接种于装有200ml LB培养基(牛肉膏 IOg,蛋白胨 10g, NaCl 5g,琼脂 18g，H2O 1000 ml, pH 7.0)的 500ml 锥形瓶中，于30°C, 150rpm下培养24 h,在8000rpm下离心IOmin后得菌体,用无菌水洗漆2次后制成OD680为0.900~1.000的菌悬液； 菌悬液按5%体积比的接种量转接于装有100ml硝化培养基(NH4Cl，碳源，Mg SO4.7H20，K2HPO4, NaCljMnSO4.4H20, FeSO4, H2O, pH 4~10.5)或反硝化培养基(碳源，KNO3, K2HPO4, FeSO4?7H2 0，MgSO4.7Η20，Η20，ρΗ 4~10.5)的 250ml 锥形瓶中，于一定温度(1(T40°C )、一定转速(O~250rpm)下培养24 h, 8000rpm下离心IOmin后测定上清液的NH4+_N浓度、NOf-N浓度和Ν03_-Ν浓度，异养硝化过程计算NH/-N的去除率和Ν02_-Ν和Ν03_-Ν的积累情况，好氧反硝化过程计算NCV-N的去除率和Ν02_-Ν的积累情况。
[0039]NH/-N、NO2--N和NO3--N的测定以及NH4+_N和Ν03__Ν去除率计算同实施例一。
[0040]主要探讨碳源、碳源与氮源(NH4Cl或KNO3)的重量比、温度、pH和溶氧对菌株WZUF22去除NH/-N和Ν03_-Ν的影响，结果如表1~表5所示。
[0041 ] 1、碳源对菌株WZUF22去除NH4+_N和NOf-N的影响
菌悬液按5%体积比的接种量转接于装有100ml硝化培养基(NH4Cl Ig (NH4+ 0.34g),碳源 10g, Mg SO4.7H20 0.lg, K2HPO4 0.5g, NaCl 0.2g, MnSO4.4H20 0.02g, FeSO4 0.02g,H2O 1000 ml,pH 7.0)或反硝化培养基(碳源 IOg，KNO3 1.0g(NOf 0.61 g),K2HPO4 IgjFeSO4?7H2 O 0.20g,MgSO4.7Η20 0.10 g，H20 1000 ml,pH 7.0)的 250ml 锥形瓶中，于温度 30°C、转速150rpm (溶氧4.9mg.171)下培养24 h, 8000rpm下离心IOmin后测定上清液的NH4+_N浓度、no2_-n浓度和Ν03_-Ν浓度，异养硝化过程计算NH4+-N的去除率和Ν02_-Ν和Ν03_-Ν的积累情况，好氧反硝化过程计算NO3--N的去除率和NO2--N的积累情况。
[0042]表1碳源对菌株WZUF22去除NH4+_N和Ν03__Ν的影响结果
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乙7135未Si?.06未检出由表1可知，菌株WZUF22异养硝化和好氧反硝化的适宜碳源均为柠檬酸钠、丁二酸钠和乙酸钠，它们为碳源时，NH/-N去除率超过70%，NO3--N去除率超过90%，且无Ν03_-Ν、Ν02--Ν的积累。
[0043]2、碳源与氮源(NH4Cl或KNO3)的重量比对菌株WZUF22去除NH4+_N和Ν03__Ν的影响
菌悬液按5%体积比的接种量转接于装有100ml硝化培养基(NH4Cl Ig (NH4+ 0.34g)，碳源(其与 NH4Cl 的质量比为 2:1~15:1)，Mg SO4.7H20 0.lg, K2HPO4 0.5g，NaCl 0.2g，MnSO4.4H20 0.02g, FeSO4 0.02g, H2O 1000 ml, pH 7.0)或反硝化培养基(碳源(其与 KNO3的质量比为 2:1~15:1)，KNO3 1.0g(NOf 0.61g)，K2HPO4 lg, FeSO4.7H2 O 0.20g, MgSO4
?7H20 0.10 g, H2O 1000 ml, pH 7.0)的 250ml 锥形瓶中，于温度 30°C、转速 150rpm (溶氧
4.9mg.L—1)下培养24 h，8000rpm下离心IOmin后测定上清液的NH4+_N浓度、Ν02__Ν浓度和Ν03_-Ν浓度，异养硝化过程计算NH/-N的去除率和Ν02_-Ν和Ν03_-Ν的积累情况，好氧反硝化过程计算NCV-N的去除率和Ν02_-Ν的积累情况。
[0044]表2碳源与氮源重量比对菌株WZUF22去除NH4+_N和Ν03__Ν的影响的结果
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【权利要求】
1.一株异养硝化-好氧反硝化的门多萨假单胞菌，其特征在于，该菌株为门多萨假单胞菌iPsGudomorms mendocina ) WZUF22,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC N0.7523。
2.权利要求1所述门多萨假单胞菌的培养方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)保藏菌株WZUF22接种于LB培养基中，培养12h以上，离心，得菌体，菌体用无菌水洗涤后制成 为0.900~1.000的菌悬液； 2)步骤I)得到的菌悬液接种于硝化培养基或反硝化培养基中，进行培养； 其中，所述硝化培养基的构成为:氮源，碳源，Mg SO4, K2HPO4, NaCl，MnSO4, FeSO4, H2O,所述碳源为柠檬酸钠、丁二酸钠或乙酸钠的其中一种或其组合，所述氮源为含铵离子的化合物；所述反硝化培养基的配方为:碳源，氮源，K2HPO4, FeSO4, MgSO4, H2O,所述碳源为柠檬酸钠、丁二酸钠或乙酸钠的其中一种或其组合，所述氮源为含硝酸根或亚硝酸根的化合物。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤I)保藏菌株WZUF22接种于LB培养基中，于20~40°C，溶氧3.5~6.1 mg* 1-1的条件下培养；步骤2)的菌悬液接种于 硝化培养基或反硝化培养基中，于2(T40°C,溶氧3.5~6.1 mg.L—1下培养。
4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述硝化培养基的配方为:氮源的 NH4+ 的质量 0.34 g，碳源，Mg SO4.7H20 0.lg, K2HPO4 0.5g，NaCl 0.2g，MnSO4.4H200.02g, FeSO4 0.02g, H2O 1000 ml，pH值为5.(TlO，所述碳源与氮源的NH4+的质量比为5:0.34~15:0.34 ;反硝化培养基:碳源，氮源，K2HPO4 lg, FeSO4.7H2 O 0.20g, MgSO4.7H200.10 g，H20 1000 ml，pH值为5.(TlO，所述氮源为含硝酸根的化合物时，氮源中硝酸根的质量为0.61g,所述碳源与NOf的质量比为5:0.61"?5:0.61,所述氮源为含亚硝酸根的化合物时，氮源中亚硝酸根的质量为0.67g，所述碳源与N02_的质量比为5:0.0.67^15:0.67。
5.权利要求1所述的门多萨假单胞菌的应用，其特征在于，将所述门多萨假单胞菌WZUF22接种于含氮水溶液中，进行异养硝化脱氮和/或好氧反硝化脱氮。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述含氮水溶液为含有NH4+、N03-和NO2-的一种或其组合的水溶液。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，门多萨假单胞菌WZUF22异养硝化脱nh4+-n与好氧反硝化脱no3_-n和no2_-n的碳源含有柠檬酸钠、乙酸钠或丁二酸钠的其中一种或其组合。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述门多萨假单胞菌WZUF22异养硝化脱NH/-N与好氧反硝化脱NO3--N和NO2--N的pH为4~10.5。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述门多萨假单胞菌WZUF22异养硝化脱NH/-N与好氧反硝化脱NO3--N和NO2--N的温度为10°C~40°C。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述门多萨假单胞菌WZUF22异养硝化脱NH/-N与好氧反硝化脱Ν03_-Ν和Ν02_-Ν的溶氧为L 3~7.3mg.L'
【文档编号】C02F3/34GK103484398SQ201310380437
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年8月28日 优先权日:2013年8月28日
【发明者】周茂洪, 赵肖为, 叶海仁, 蒋张亮 申请人:温州大学