专利名称：血管内皮因子及其拮抗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组治疗恶性肿瘤及其血管异常增生疾患的生物制品，确切地说它是一组血管形成刺激剂及血管增生抑制剂。
恶性肿瘤严重威胁着人类的健康和生命。在过去的50年中，人们始终在不断求索，力图寻找出一种有效的治疗方法；如某种药物在体外对靶细胞有杀伤作用，并且在体内也有效。与放射性同位素、化学药物、生物毒素、酶等偶联的单克隆抗体或效应抗体等在体外实验中对肿瘤相关抗原有较高的特异性，但由于其血管通透性、间质扩散系数和液压传导率均较高，体内肿瘤细胞对它们的摄取不充分，以及分布不均，限制了这些药物临床的应用。造成这些药剂在实体肿瘤中传递不良的生理因素包括血液供给不均、间质压力升高、间质中的较大的传输距离等，从中可看出现有技术虽已提供了多种治疗癌症的方法，但多不尽人意。近年来，研究人员对如何减少抗体异原性反应、增强抗体的穿透能力及克服抗原表达异质性等方面进行了深入的研究，以期明显提高肿瘤靶细胞对导向药物的摄取量，最大限度发挥抗体效应。在1973年第三届癌胚抗原会议上，Folkman首先报告其在Walker256鼠肿瘤细胞中分离出一种活性成分，并认为它是蛋白类的血管形成抑制剂，同时他第一次提出了肿瘤血管形成因子的概念(1973年在第三届国际癌胚抗原会议Tumor Angiogeneic Factor.TAF)，同时他推测抑制肿瘤血管形成将导致肿瘤生长的抑制。
血管增殖是正常组织生长发育所必须的一个过程，在成年人，除了女性的生殖系统及机体的修复过程发生血管增殖外，其它组织很少发生血管增殖，且血管增殖过程一般较短暂并受机体严格的调节。与之相反，在某些病理性疾病中常发生无控制血管形成，如糖尿病、视网膜血管增殖所涉及的血管瘤及实体瘤，研究表明肿瘤细胞在其形成和发展的过程中其本身释放血管形成因子作用于宿主的血管，以诱导内皮细胞增殖，形成供应肿瘤营养及排泄废物的肿瘤血管网络结构。1989年由Ferra等人从牛垂体滤泡星形细胞条件培养液中纯化出来一种具有旁分泌功能，并能特异地促进血管内皮细胞增殖与分裂的生长因子-血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF是一种内皮细胞特异的有丝分裂素(Ferra，NandHenzel，W.J.，1989，Biophs. Res.Comm，161851-858)。VEGF是一个高度糖基化的碱性蛋白，由两条24KD的单链组成同源二聚体，使用巯基还原剂可使之失去活性，由于mRNA的不同剪切方式使其共有四种形式即VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206，前两种是可溶性蛋白，后两种是不溶性蛋白，从细胞中分泌出来后直接与细胞膜和基底膜结合，人体内以VEGF165较为常见。VEGF除了特异地刺激内皮细胞增殖外还具有独特的促血管通透性的作用，能使注射部位血管内大分子泄露，但无基底膜的破坏和炎细胞的浸润。血管形成是由血管内皮细胞的增殖、迁移和浸润等一系列步骤所组成，这些过程由血管形成因子所调节。研究表明绝大多数肿瘤细胞均能分泌血管内皮生长因子，且血管内皮生长因子受体(flt-1，flk-1)都分布在新生肿瘤血管内皮上，而在正常组织血管内皮上没有或很少有分布。
通过研究证实VEGF分子有如下不同于其它血管形成活性分子的特点1)首先VEGF121及VEGF165是分泌性蛋白，通过旁分泌途径诱导肿瘤血管内皮细胞的增殖同时促进肿瘤形成；2)VEGF在体内是血管内皮细胞特异的有丝分裂素，而成纤维细胞生长因子(FGFs)和血小板源生长因子(PDGF)的作用是多向性(特异性较低)。3)VEGF在几个体内模型中均能够促进血管形成。并且通过研究证实VEGF作为一个旁分泌血管形成调节剂，它能够导致一个血管增殖的链锁式反应发生，并可以通过它的直接血管形成效应促进肿瘤形成；4)VEGFmRNA在许多血管丰富组织中如脑、心、肾、卵巢及许多肿瘤组织均有表达，从而给我们提供一个客观证据，VEGF是一个生理及病理血管形成过程中有效的调节剂；5)VEGF区别于其它因子的另一个显著特点，是其在不引起血管壁破坏情况下，增加血管通透性，引起纤维蛋白原及部分血浆蛋白的泄漏，而纤维蛋白胶的形成又给内皮细胞和肿瘤细胞的生长与迁移提供了一个较为理想的底物及环境。从而说明以VEGF作为导向治疗靶具有较大优越性。
目前，国外所制备的抗体主要是以合成VEGFN末端短肽为抗原，这样就造成其抗原性不完整，而且也不具有天然结构，制备的抗体靶特异性也就不强，限制其应用范围。
本发明的目的是提供一种VEGF及系列VEGF拮抗剂，以及它们的制备方法，该方法包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体的制备；上述的VEGF拮抗剂与放射性同位素的偶联方法，所述拮抗剂可以中和VEGF的促进血管形成的作用，并可应用于临床血管密度较高的肿瘤和视网膜血管增生、风湿性关节炎等症的治疗。
本研究所应用的抗原即血管内皮生长因子是通过现代的最新技术即分子生物学的手段，1)从人胎肝中克隆出人VEGF基因；2)将此基因再定向克隆在原核表达载体；3)经转化工程菌表达人重组VEGF，再经活性检测其有人脐静脉血管内皮细胞增殖活性、鸡胚绒毛尿囊膜血管形成活性及增加血管通透性的活性，这样就完全符合了天然VEGF分子的活性，我们所制备的抗原具有与天然物质一样的结构，并保持了其结构的完整性，使得我们所制备的抗体特异性更为专一，靶特异性更为专一。通过实验表明我们所制备的抗体具有中和活性，其不光以肿瘤血管内皮细胞为靶，而且还以肿瘤细胞为靶，这说明我们所制备的抗体具有“双功能”的效应。
抗体并不局限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab片段表达库所产生的肽段，并且优选那些有中和VEGF活性抗体，应用到疾病的诊断及治疗中；获得中和VEGF活性的抗体是通过如下方法实现的；首先，注射VEGF抗原免疫动物，但不限于兔子、小鼠、大鼠等，根据宿主的种类，使用各种佐剂以增强免疫应答，这些佐剂包括但不限于Freund′s(完全和不完全的佐剂)(Keck.p.j，Hauser.S.D.，Krivi，G.，Sanzo，K.，Warren.，Farber，J.，and Connolly，D.T.(1989)Science 246，1309-1312)、无机凝胶、氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、环氧乙烷-环氧丙烷多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、孔嘁血兰蛋白、二硝基苯酚以及潜在对人体有用的佐剂，如卡介苗(BCG)；VEGF多克隆抗体的获得是通过人重组VEGF，采用完全或不完全佐剂多次免疫动物，不限于兔、小鼠和大鼠，获得有结合活性的血清；可通过从传代细胞的培养物中提取抗VEGF单克隆抗体分子，其中包括提取这些抗体分子的任何技术。但不限于由Kohler and Milstein最早公开的杂交瘤(Hybridoma)技术(Nature，1975 256495-497)，人体细胞杂交瘤技术(Kosberet al.，1983，Immunology Today，472；Cote et al.，1983 Proc.Natl Acad.Sci.，802026-2030)和VEGF杂交瘤技术(Cole et al，1985，MonoconalAnt ibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)获得有中和活性的抗人血管内皮生长因子单抗并命名为3D3；应用氯氨T法或者Iogdogen法，可标记同位素。
本发明还包括通过使用来自具有编码与VEGF抗原特异结合的抗体分子基因与编码有生物活性人源性抗体分子的基因连接后表达的一“嵌合抗体”的技术(Morrisor et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.，816851-6855；Neubergeret al.，Nature，312604-608；Takeda et al.，1985，Nature，314452-454)；本发明包括抗VEGF单链抗体，单链抗体的制造技术(American Patent 4,946,778)，应用此技术进行VEGF单链抗体制备。单链抗体就是用分子生物学的手段将鼠源的单克隆抗体的重链基因和轻链基因连接在一起，以表达一种只编码抗体重链及轻链的蛋白；本发明中的小分子抗体，是应用多聚酶链反应(PCR)技术，通过所合成的适当引物将重链及轻链的基因扩增出来，插入表达载体中，测序验证之后，便可插入适当的表达载体中，在大肠杆菌中表达小分子抗体。
上述所获得的一系列抗体要经过三个标准来检测其是否存在中和活性。
首先是VEGF的内皮细胞增殖试验，离体24小时以内的人脐静脉内皮细胞培养按杨小平等(人脐静脉内皮细胞培养及形态观察，中华心血管杂志1988，16298-299)加以改进，消化时间为8-10分钟，内皮细胞培养液为RPIM1640，含30％FCS、2mM谷氨酰氨、90ng/ml肝素钠、1ng/ml氢化考的松、2ng/ml庆大霉素。96孔板以0.01％多聚赖氨酸包被后，加原代脐静脉内皮细胞，4×10/孔，加入不同浓度的VEGF，每个浓度有三个重复孔。5天后加入3H-TdR，1.0uci/孔，培养6小时后以Beckman液闪仪测其cpm值。人脐静脉内皮细胞的增殖要随着拮抗剂量的增加而减少；其次，鸡胚绒毛尿囊膜血管形成实验参考Tayor和Forkman(1982)方法，用PBS配制1.5％甲基纤维素，购买六天鸡胚置于5％CO2，38.5℃孵育箱中培养，每天上下翻转两次，第九天在无菌条件下，在卵壳开一0.5×1mm2的卵窗，将10μl甲基纤维素与5μl不同浓度的VEGF混合，滴于鸡胚绒毛尿囊膜上，24-48小时观察实验结果，照相随时记录实验结果，以无VEGF甲基纤维素作为阴性对照。鸡胚绒毛尿囊膜血管的增殖数目要随着拮抗剂量的增加而下降；第三，血管通透性实验参考Miles方法(Milesaa，J.Physiol 1952118-228)，麻醉豚鼠后切开颈部皮肤，经颈静脉注射1ml 0.5％(W/V)Enan′s Bluc，5分钟后在豚鼠背部皮内注射相同体积但(200ul)是不同浓度的VEGF，以PBS作为阴性对照体积为200μl。随着拮抗剂增加，血管通透性降低。
对符合上述三项要求的抗体，才能确认为此种抗体是有中和活性的。
我们认为采用抗VEGF抗体有如下优点1)从抗原选择上应寻找对靶细胞有最大选择性的抗原以获得特异性更强抗体，由于肿瘤相关抗原异质性等原因，目前研制抗体很难达到如此效应。既然肿瘤连续的浸润性生长和扩散均依赖于肿瘤的脉管系统，因此，我们选用特异促进脉管系统内皮细胞迁移、增殖的蛋白作为导向治疗抗体的抗原决定簇，这种抗原决定簇消除了抗原异质性的弊端，能够使抗体分布更特异且靶部位摄取量更高，再者由于抗体封闭了VEGF的活性，从而抑制甚至于摧毁肿瘤赖以生存和转移的脉管系统，使肿瘤细胞丧失生存和转移的基础。2)肿瘤血管及组织间液体压力的增高是构成肿瘤屏障的两个主要因素，由于VEGF的受体仅位于肿瘤血管内皮细胞上，抗体及其偶联物特异结合，抑制并摧毁肿瘤血管，从而降低组织间液压，使抗体更容易向肿瘤核心扩散，提高肿瘤靶对于抗体的摄取量；3)VEGF为大多数肿瘤细胞所分泌，而在正常组织血管内皮上几乎无VEGF受体(flt-1，flk-1)的表达，从而使抗体靶特异性更强，对正常组织损伤更小。4)宿主血管的长入与质的形成是肿瘤细胞在肿瘤实质内迁移及远隔转移的基础，VEGF促进宿主血管内皮细胞分裂形成新生的肿瘤血管长入肿瘤，同时血管内皮生长因子又是血管通透性因子(VPF)，血管内血浆蛋白原外渗形成肿瘤细胞迁移及转移所依赖基质及通道，抗VEGF抗体封闭这种效应，抑制肿瘤细胞的转移；5)本实验拟在上述实验基础上，进行人原性抗体的制备，从而基本上消除异原性反应；6)本实验抗原及抗体是通过基因工程方法制备，可以大量生产。
实施例1VEGF重组蛋白的诱导、表达及纯化1. 小批量的重组蛋白的诱导及表达(1)在含有表达人重组VEGF质粒(VEGF表达载体的构建见
图1)过夜培养的1ml转化菌中，加入1ml 45℃预温的含氨基苄青霉素的LB培养基，42℃300rpm振荡培养4小时。(2)离心4000rpm 5分钟，弃上清，各加入50ul水及50ul PAGE样品液，混匀，100℃水煮5分钟，上样，在垂直电泳仪上设置恒流30mA，进行电泳。2. 大批量的重组蛋白的诱导及表达(1)将含有表达人VEGF基因片段的重组表达载体的POP-2136单个菌落，接种于100ml含氨基苄青霉素LB培养基中，30℃扩增至OD600为0.6时，加入100ml 50℃预温的新配制的培养基，42℃350rpm振荡培养4小时。(2)离心4000rpm 30分钟，弃上清。收获细胞。3. 包涵体制备(1)细菌的裂解按100ml培养液加50ml超声缓冲液的比例，将大批量诱导的菌体进行超声处理，超声条件设置为60W，在冰浴内进行超声，12分钟，并间歇进行超声。(2)包涵体的洗涤超声后的菌液10000rpm离心15分钟，弃上清，这时表达产物以包涵体的形式存在于沉淀中。测量包涵体的湿重，按每100mg包涵体用10ml包涵体洗液的比例进行洗涤，用VEGF包涵体洗液将包涵体充分的混匀，10000rpm离心15分钟，弃上清，洗涤三次。后再用相同体积的0.15mol/LPBS(pH7.4)洗涤两次。4. 包涵体的变性与复性a在包涵体中加入8M尿素，37℃水浴一小时，离心15000rpm 30分钟，将上清移至透析袋内(M.W. Cutoff12,000-14,000，SPECTRUM MEDICAL INDUSTRIES，INC.)。b用50mmol/L pH8.0Tris-HCl缓冲液进行稀释复性。PBS透析，4℃，24小时。5. 制备性SDS-PAGE纯化重组蛋白(1)将洗涤后的包涵体用8M尿素、2％SDS及20mmol二巯基乙醇进行变性，混匀，37℃孵育过夜。10000rpm离心30钟，在上清中加入PAGE样本缓冲液，37℃孵育一小时。(2)制备3mm厚PAGE板，在电泳槽中加入电泳缓冲液。加样，设置恒流电泳，电流为25mA。(3)电泳结束后取下胶，将胶置于平皿内，加入4℃0.1M氯化钾染色，切下目的蛋白带并将胶切成3×0.5cm2大小，置于透析袋内，加入0.5 PAGE电泳缓冲液。(4)将透析袋置于圆盘电泳洗脱装置内，加入0.25×PAGE电泳缓冲液，设置恒压电泳，电压为300V，洗脱6小时，吸出蛋白液，加入5倍体积的复性液(50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2uM的硫酸铜)，4℃磁力搅拌过夜复性。(5)复性液用0.15M PBS(pH7.4)透析，去除SDS，将收获的蛋白进行SDS-PAGE分析，用紫外OD280确定蛋白的含量。6. 反相-HPLC纯化重组蛋白(1)用SP 2000泵进行驱动，应用日本住友公司Cosmosi14.6×150mm，F09033，5C18-P-300C型层析柱。(2)洗脱条件的设置1-10分钟入流动相A；10-40分钟入40％流动相B；40-50分钟入75％流动相B；50分钟后入100％流动相B，以线性梯度进行洗脱，洗脱速度为1ml/min。(3)用PE LC 90 Bio紫外分光光度计检测洗脱下的样品，用gallenkamp.winosc ribe记录仪计录，走纸速度为0.05Aufs。(4)先走一空白梯度，与样品峰进行对照。(5)用微量注射器加样100ul，样品为SDS-PAGE纯化后经PAGE分析纯度较好呈单一条带的重组蛋白，样品真空冷冻干燥后，溶于流动相A，样品的浓度为250ug/ml。(图2及图3为VEGF表达纯化的SDS-PAGE分析)四、血管内皮生长因子的活性鉴定1. 内皮细胞增殖实验a内皮细胞的培养(按扬小平法加以改进)① 取产后24小时以内的新鲜脐带，置于无菌的PBS溶液中，一般取15-20cm长为佳。② 在脐静脉内放置一乳胶管并结扎紧，连接输液器，用注射器吸温浴后的PBS反复的冲洗数次，直至观察到从脐带的另一端流出的为无色透明的液体。③ 从乳胶管的一端向脐静脉内注入0.125％胶原酶待脐带的另一端有液体出现后立即用止血钳夹紧，徐徐的注入充满血管后，然后用止血钳夹紧脐带的另一端。④ 将血管置于37℃温箱内，消化8-12分钟。⑤ 吸出含有内皮细胞的消化液，用1ml小牛血清终止消化反应，再用无菌的PBS反复冲洗消化腔，将收集到液体置于无菌离心管中。⑥ 1000rpm离心10分钟，弃上清用配制好的内皮细胞培养液吹打混匀，制成细胞悬液，接种于培养器皿或96孔板中，置5％CO237℃孵育箱内培养。bVEGF对血管内皮细胞的增殖效应① 以0.01％多聚赖氨酸包被96孔板，使用量按每平方厘米加50ul的溶液计算，室温下静止5分钟后，吸出多余的液体。② 再用灭菌蒸馏水(100ul/mm2)洗涤涂有基质的表面，然后尽量将水份吸净。③ 用0.125％胶原酶(II型)消化原代培养的细胞6分钟，用内皮细胞培养液轻柔的吹打细胞，在计数板下计数，稀释成2×104个/ml，200ul/孔，4×103/孔。④ 培养24小时后，加入不同浓度的过滤后的VEGF，每个浓度有三个平行孔，以未加VEGF的内皮细胞培养液作为阴性对照。4天后加入3H-TdR(上海生物制品研究所)，0.5uci/孔，六小时后用多头吸样器收集于滤纸上，Beckman LS-3801型β液闪仪检测cpm值。(图4为VEGF对人脐静脉内皮细胞的增殖影响)2. 鸡胚绒毛尿囊膜血管形成实验① 购买六天鸡胚置于5％CO2、38.5℃孵育箱中培养，每天上下翻转两次，并用照卵灯观查鸡胚的生长情况。② 第九天在无菌条件下在卵壳空气腔处开一0.5×1mm2的卵窗，用一无菌的注射器针头刺破壳膜，然后慢慢滴入生理盐水，使鸡胚绒毛尿囊膜与壳膜分离下沉，用无菌剪刀修整壳膜，在照卵灯观查鸡胚绒毛尿囊膜血管生长情况，后用消过毒的Parafilm封闭卵窗。③ 用1.5％的甲基纤维素10ul与5ul不同浓度的VEGF混合，混匀后滴到鸡胚绒毛尿囊膜上，12-48小时观察实验结果，照像随时计录实验结果，以无VEGF甲基纤维素作为阴性对照。3. 血管通透性实验参考Miles方法，麻醉豚鼠后切开颈部皮肤，经颈静脉注射1ml0.5％(W/V)Evan′sBlue，30分钟后在豚鼠背部皮内注射不同浓度的VEGF，以PBS作为阴性对照，注射的体积均为200ul，VEGF剂量范围为10ng-100ng，15分钟后观察注射部位已与血浆蛋白结合的Evan′s Blue的泄漏情况。实施例2VEGF抗体的制备、纯化与中和活性的测定一、试剂1. VEGF为经原核表达、纯化并证实有生物活性的蛋白。2. 不完全佐剂(IFA)羊毛脂12ml(防化学院实验化工厂)，石腊油(长沙市有机试剂厂)20ml研磨后分装，高压灭菌消毒，4℃保存。3. 完全佐剂(CFA)死卡介苗(卫生部北京生物制品研究所)与不完全佐剂混合，抗原与佐剂以等体积的比例相混合，死卡介苗15mg/只/次。4. 正常兔血清及羊血清均采自北京医科大学第一附属医院动物中心。5. 牛血清白蛋白，华美公司。6. 溴化氢活化的Sepharose-CL-4B，Pharmacia公司。7. 二氨基联苯胺(DAB)，Sigma公司。二、 抗体的制备1. 抗原抗原VEGF由原核表达，制备性SDS-PAGE纯化，反相HPLC鉴定，纯度较高且有良好的生物活性，浓度为1mg/ml，1-2mg/只/次。2. 动物新西兰白兔购自北京医科大学第一附属医院动物中心，雄性，4月龄，2.5-3Kg。3. 免疫程序及途径首次免疫，等体积的VEGF与CFA用电动搅拌器混匀，形成油包水，于兔双后掌及背部皮内多点注射。四周后第二次加强免疫，IFA与VEGF等体积混合，背部皮内多点注射。之后每隔一个月加强免疫一次，并于加强免疫后第10天取耳血1ml，用免疫双扩散法测抗体效价。末次免疫10天后以免疫双扩散法测其效价并用ELISA测抗体有效稀释度，放血，收集血清。4. 抗体的检测及收集将收集的血静置于4℃内，2小时后用玻璃棒沿容器周围轻轻分离凝血块，收集析出的血清，-20℃冻存备用。5. 抗体的纯化(1)50％饱和硫酸胺沉淀兔血清，PBS透析，最后用交联缓冲液透析。(2)CNBr-Sepharose-CL-4B活化a称取CNBr-Sepharose--CL-4B 1g溶于40ml1mmol/L HCl，4℃20分钟(每克干粉可以溶胀成终体积为3.5ml的胶，而每毫生胶可与5-10mg蛋白进行结合)。b将溶胀好的胶立即置于G4漏斗中抽滤洗涤。c然后立即用交联缓冲液200ml在G4漏斗中进行抽滤洗涤。(3)将纯化及浓缩后的VEGF(1mg/ml)对碳酸交联缓冲液(PH8.3)透析，透析后测OD280值，按每毫升溶胀的胶与5mg纯化的蛋白比进行交联。(4)置摇床(上下摇)，4℃过夜。离心1000rpm 10分钟，上清测OD280。计算交联率，再用5倍体积的交联缓冲液洗涤。(5)10ml 1M乙醇胺封闭残留的活性基团，置摇床，室温2小时。(6)用10ml洗脱液A抽滤洗涤。(7)用10ml交联缓冲液抽滤洗涤，检测洗脱后的液体，此时的OD280应小于0.01。(8)用10ml洗脱液C混匀后置摇床轻摇，室温30分钟，测洗脱后液体的OD280应小于0.01，用PBS(pH7.4)洗涤胶至中性，加入0.1％NaN3，4℃保存，保存中的VEGF-CNBr-Sepharose-CL-4B，亲和层析柱可反复使用。(9)用洗脱液洗涤已制备好的亲和层析柱，检测洗涤后液体的OD280应小于0.01。(10)血清与VEGF-CNBr-Sepharose-CL-4B混合，置摇床上下慢摇，4℃过夜。(11)PBS洗去不相关的蛋白，直至洗脱后液体的OD280小于0.01。(12)洗脱液C洗脱免抗人VEGF抗体，洗脱下的抗体立即用1MTris中和，并立即置PBS透析，分装、保存。ISA检测抗体的有效稀释度并与相同浓度的未纯化的血清相对比。6.酶联免疫吸附试验检测抗体的滴度(1)用ELISA铺板液稀释纯化的VEGF抗原，浓度为10ug/ml，100ul/孔，96孔板，4℃过夜。(2)0.05％Tween-20PBS洗两次，1％BSA封闭，200ul/孔，室温一小时。(3)洗涤液洗两次，加入不同稀释度的抗血清，每个稀释度取三个平行孔，50ul/孔，室温一小时。(4)PBS洗四次，加羊抗兔-HRP，50ul/孔，室温一小时。(5)PBS洗四次，加底物反应液，200ul/孔，避光显色，显色后，加50ul/孔终止液，ELISA READER测OD492nm。三、Western-blot1. SDS-PAGE与前述方法一致。2. 跑完胶，将胶置于转移缓冲液内浸泡5分钟，裁剪略小于胶的硝酸纤维素膜及滤纸，硝酸纤维素膜浸在甲醇内3分。3. 膜对阳极，胶对阴级，Bio-Rad转移电泳仪转移蛋白，恒压100V 10℃过夜转移。4. PBS洗膜两次，用2％BSA封闭，4℃过夜。5. VEGF抗血清(1∶500稀释)孵育一小时。6. 0.05％Tween PBS洗四次，加入羊抗兔-HRP(1∶500)，室温45分钟。7. 0.05％Tween PBS洗四次，DAB37.5mg，H20220ul，PBS50ml显色。四、VEGF抗体中和活性的检测1. VEGF抗体中和VEGF内皮细胞增殖活性(1)应用第一部分内皮细胞活性测定方法进行内皮细胞的培养。(2)内皮细胞铺于96孔板后，将10ng/mlVEGF与不同浓度已纯化的抗体预孵育30分钟后，将其加入到各孔中，孵育5天，加入3H-TdR，1uci/孔，6小时后用多头吸样器将其吸到玻璃滤纸上，β计数仪上进行cpm计数。2. VEGF抗体中和VEGF增强血管通透性的活性应用Miles方法，从颈静脉注入1ml Evan′s Blue，30分钟后，在豚鼠皮内注射已预孵育30分钟100ng的VEGF与不同比例的VEGF抗体的混和液，注射的终体积相同，均为200ul，30分钟后在注射部位出深浅不同的篮斑(由于染料与血浆蛋白结合后泄漏所致)。实施例3VEGF单克隆抗体的制备1.免疫程序取6-8周龄的Blab/c雌性小鼠6只，基础免疫7-10天后，不限于皮下及皮内静脉加强免疫一次，3-4天后用于细胞的融合，免疫时是否采用佐剂和抗原是否需要预处理，依据抗原性的强弱而定。
2.制备免疫小鼠脾细胞3.制备饲养细胞4.复苏及培养骨髓瘤细胞将细胞从液氮中取出，放入37℃水浴中，用无血清培养液洗涤一次，加入15-20毫升小牛血清培养液，镜下观察细胞生长情况，融合前一天，加入饲养细胞。
5.融合按常规配制HAT，及PEG(30-50％，W/V)(1)将1毫升30-50％PEG一滴滴加入细胞团中，30-60秒内加完，并不时轻微的转动离心管或用于轻轻的弹动离心管。
(2)在不断的转动离心管时加入无血清培养液1毫升，30-90秒内加完
(3)于5分钟内慢慢的加完20毫升无血清培养液。
(4)离心500-1500rpm/M，5-10分钟，去上清液，在10-20分钟内加入完全培养液100毫升悬浮，轻轻的混匀。
(5)96孔板中每孔加入50-200ul(6)用5％COy温箱中培养，加入HAT选择性培养基(7)融合后的细胞2-3周出现杂交瘤集落(8)待集落长至1/3孔时，应用ELISA法进行抗体检测。
6.抗体的检测(1)用纯化的VEGF包板，包板缓冲液为碳酸盐(pH9.6)，VEGF浓度为5ug/ml，50ul/孔，4℃过夜，PBS洗板，用2％BSA封闭，室温1小时。
(2)含0.05％Tween-20的PBS洗板，收集有杂交瘤细胞集落生长孔的上清，每孔加50ul，每个集落孔有两个平行孔，室温反应1小时。
(3)含0.05％Tween-20的PBS液洗板四次，加二抗(羊抗兔辣根过氧化酶1∶1000)，50ul/孔，室温反应1小时。
(4)含0.05Tween-20的PBS夜洗板，加底物反应液，200ul/孔，避光反应，12.5％硫酸终止反应，200ul/孔。
(5)在ELISA READER上读OD492值，本组实验以SP/20的上清作为阴性对照，根据OD值挑选阳性孔，再进一步亚克隆。实施例4
VEGF单链抗体的制备一.细胞系主要采用分泌小鼠抗人血管内皮生长因子单克隆抗体3D3的杂交瘤细胞系，此杂交瘤细胞系由本所生化室自建。
二.PCR引物设计MK5 5′-CGGGATCCTCTAGACATTGTGATGACCCAGTCTCCAA-3′MK3 5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTTC(T)ATTTCCAGCTTGGTG(C)C-3′MH5 5′-GGCCGTCGACGTG(C)A(C)AGCTGGTGG(C)AGTCT(A)GG-3′MH3 5′-CCCGAATTCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTC(G)A(G)CCCCAG-3′三.测序引物设计5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3′四.载体与菌株载体PUC19，PGEMI1ZF(+)大肠杆菌XL-BLUE菌株方法(《分子克隆》第二版，7页)1.总RNA的提取将约2×105-2×108个处于对数生长期的杂交瘤细胞离心，10000-15000rpm/m，弃上清，室温下10-30分钟。采用不限于异硫氢酸。Teflon等常规提取RNA的方法，然后同饱和酚搅拌，异丙醇沉淀，10000rpm-15000rpm/M，低温下离心10-30分钟，再用75％的乙醇洗涤，溶于用DEPC处理的水中备用。
2.逆转录-PCR(RT-PCR)
取5-50ug RNA，50℃-70℃变性3-10分，立即进入低温。采用常规逆转录方法，40-50℃水浴30-90分钟，100℃水浴5-10分钟，变性AMV，在此液中加入5′3′PCR引物dNTP MgCl2Taq酶，在DNA热循环仪上90-96℃，变性30-60秒；40-60℃，退火30-60秒；68-75℃，延伸60-90分钟，共循环30-38圈进行DNA的扩增。PCR产物氯仿抽提一次，后进行纯化。
4.DNA的回收和纯化我们采用六种方法回收PCR产物(1)低溶点琼脂糖法(2)酚冻融法(3)电洗脱法(4)透析带电洗脱法(5)各种DNA纯化的Kit回收载体片段5.PCR扩增产物的克隆纯化的PCR产物及载体用相应的酶进行消化，消化的产物纯化后，将片段与载体以摩尔比3-5∶1混合于10-20ul连接体系中，14-24℃进行16-24小时连接反应，转化大肠杆菌，酶切筛选重组子。
6.感受态细胞的制备及转化挑单个菌落接种于培养液中，37℃培养过夜，将其转移致10倍体积的培养液中，继续培养2小时致OD值0.5，4000rpm/M，10-20M，弃上清，将细胞悬浮在50-100MCaCl2，冰浴30-60分钟，4000rpm/M，5-15M，再用CaCl2悬浮，冰浴中备用。
将连接产物与感受态混合，冰浴30分钟，30-42℃热休克3-6分钟，冰浴2-5分钟，加入培养液后，30-37℃培养1-2小时，取100-1000ul涂于含苄青霉素的固体培养基上，30-37℃温箱培养过夜。
7.阳性菌落的筛选挑单个菌落于培养液中过夜培养，常规DNA提取方法提取DNA，用相应的酶进行酶切鉴定。
8.DNA序列的测定DNA序列测定采用双脱氧方法，按USB产品说明书进行实施，用6-8％的测序胶进行电泳，电泳结束后，将胶平展于烤胶仪，抽干，压片，暴光24-72小时，读片。实施例5VEGF嵌合抗体的制备1.CDNA的合成富集5-10×105细胞(产生鼠抗人血管内皮生长因子的杂交瘤细胞)(《分子克隆》第二版，396页)，PBS洗2-3次，液氮冻存或立即提取，提取RNA的方法与在单链抗体中RNA的提取方法相同。
RNA与引物退火50-60℃10-20分钟，其中VL区应用OligodT为引物，VH区用反意义链引物。
退火后模板冰上冷却，第一条链eDNA buffer，及反转录酶，40-50℃孵育45-90分钟，-20℃保存，备PCR用。
PCR反应，与单链抗体的PCR反应一样。
2.亚克隆与测序PCR产物用酚氯仿抽提(1)直接亚克隆于Bluescript-FA(于ECOR V处消化为平末端)(《分子克隆》第二版，280页)ddTTP利用转移酶接尾，连接于FA载体中。
(2)将PCR产物用适当的酶切后，克隆在Bluescript载体中。
将上述两种连接产物转化感受态菌，铺氨苄青霉素(+)培养盘，挑克隆，然后酶切鉴定。
对于阳性克隆测序(应用T7DNA聚合酶双脱氧法测序)。
3.利用突变构建克隆位点(1)将SaLI BamH I人V基因片段(2.5-3.5)从表达载体克隆入ML3mp19中，利用一突变寡聚物在118-119位氨基酸处引入Nhe I位点(《分子克隆》萨姆布卢克J，科学出版社，第二版，176页)。
(2)构建一含有VH-VL的载体中，其中4.3Kb的含CK的SaI I-BamH I片段克隆于MI3mp19zhong1，在108-109氨基酸处引入BgI II。
(3)为使VL能在剪切后拼接于CK含鼠JK的HindIII片段克隆于M13mp19中，于JK5的3′端引入一Sal I位点。
(4)提供起动子以anti-dalsy1杂交瘤27.44中，起动子的2.2Kb长BamH I片段克隆于MI3mp18中，于-10到-5之间引入ECOR V位点。
4.重组子转染和筛选用BSPCI消化重组DNA使之线性化，用电打孔或金属离子沉淀法进行，所用的细胞为非分泌型骨髓瘤细胞。
将转染的细胞置于96孔板中，1×104/孔。于48小时后加入筛选介质(筛选药物的浓度依赖于所用的细胞株)12天后对生长的克隆的上清进行ELISA检测重链(H)及轻链(L)的分泌。实施例6VEGF拮抗剂的筛选1.用纯化的人重组VEGF(纯度＞95％)铺板，用PH9.6碳酸缓冲液作为稀释液，VEGF的浓度为5-10ug/ml，50-200ul/孔，4℃过夜。
2.以鼠阳性血清作为阳性对照(以1∶1000倍稀释)，以SP2/0细胞培养液作为阴性对照，50-200ul。同时每孔分别加入多抗、单抗、单链、嵌合、小分子肽50-200ul，室温1小时。
3.用0.05TWEEN-20PBS液反复洗板3-6次，加入羊抗鼠辣根过氧化酶(HRP)，50-200ul/孔，室温下反应30-60分钟。
4.用0.05TWEEN-20PBS液反复洗板数次，配制反应底物液，37.5mgOPD+50mlPBS+20ulH2O2，200ul/孔，观察反应，后用12.5％H2SO4终止反应。实施例7拮抗剂与放射性同位素及毒素的偶联方法1.应用氯氨T法或Iodogen法(Colcher D.JNucl Med 1987；281924-1925)标记同位素以Iodogen法标记同位素，并经SephadeX G-50纯化。
2.应用SPSD等连接剂进行毒素与VEGF抗体的偶联。实施例8VEGF抗体对原发肿瘤生长的抑制一、动物、细胞及试剂人胃癌细胞株MGC-803由本所传代培养。S180小鼠肉瘤细胞系由北京市肿瘤研究所药理室王耐勤教授提供。抗VEGF多抗的制备及纯化如前所述。本研究所采用的VEGF抗体均为亲和层析纯化。裸鼠为Balb/c Nu/nu，6-10周龄，购自北京实验动物中心。昆明小鼠，6-8周龄，由北京市肿瘤研究所动物室提供。二、VEGF抗体对鼠源性S180肉瘤影响的设计昆明小鼠40只，随机分为四组，每组10只，在昆明小鼠右腋皮下接种鼠S180肉瘤细胞，每只小鼠接种2×106个细胞/0.2ml，VEGF抗体分成三个剂量组50ug/只/天、100ug/只/天及200ug/只/天。以PBS作阴性对照。接种肿瘤细胞后第二天开始注射抗体，连续注射5天，触及肿瘤后每隔三天用游标卡尺测量肿瘤的长轴(L)及短轴(W)，以1/2LW2计算肿瘤的体积。14天后处死小鼠，处死后称小鼠瘤重。(结果见附图5及附表1)三、VEGF抗体对人胃癌MGC803影响的设计裸鼠14只，随机分为两组，每组7只，在右腋皮下接种人胃癌细胞MGC803细胞，每只接种2×106/0.2ml，接种后第二天，腹腔内注射VEGF抗体，200ug/只/天，连续14天，以相同体积的PBS作为阴性对照，触及肿瘤后每隔三天用游标卡尺测量肿瘤的长轴(L)及短轴(W)，并以1/2LW2计算肿瘤的体积，持续观察27天处死裸鼠，处死裸鼠称瘤重。(结果见附图6及附表2)四、VEGF抗体与131I标记的抗胃癌单克隆抗体3H11联合应用对胃癌细胞系MGC803裸鼠移殖瘤影响的设计
裸鼠10只，随机分为两组，每组5只，右腋皮下接种人胃癌细胞MGC803，每只接种2×106细胞/0.2ml。一组于接种后第一天腹腔内单纯注射131I-3H11，150uci/只。另一组在注射131I-3H11的基础上，从第二天至第15天，腹腔内注射VEGF抗体，200ug/次/天，连续14天。触及肿瘤后每隔三天用游标卡尺测量肿瘤的长轴(L)及短轴(W)，以1/2LW2计算肿瘤体积。持续观察36天后处死裸鼠，称瘤重。(结果见附图7及附表3)实施例9VEGF抗体对肿瘤转移的抑制作用一、动物1. 采用6周龄TA2X615F1雌性小鼠，由中国医科院肿瘤医院动物室提供。2. 肿瘤细胞来源系一只348日龄雌性津白II型小鼠，其右侧乳腺处患一肿物，呈多囊性，取原发瘤，以1∶5生理盐水稀释，研磨成悬液，按每只小鼠0.1ml(1×105)，接种于六周龄同源雌鼠右后侧皮下进行传代。经病理检测证实为小鼠乳腺癌，属Dunn分类之B型，并命名为IVTA2MA-891。3. 615小鼠自发性肺腺癌肺及淋巴结双向转移模型，由中国医科院肿瘤医院动物室提供。二、VEGF抗体抑制肿瘤转移的设计1. 将传代的肿瘤研磨成悬液后接种于小鼠右后腿皮下，1×105细胞/只，9天后将小鼠随机分成三组，其中注射VEGF抗体组为7只，正常兔血清(NRS)组为4只，PBS组为8只.2. 于接种肿瘤细胞后第九天开始腹腔内分别注射VEGF抗体、NRS及PBS，其中VEGF抗体200ug/只/天，体积为0.2ml；正常兔血清(NRS)200ug/只/天，体积为0.2ml；PBS0.2ml/只/天，分别连续注射14天，注射停止三天后处死小鼠，称瘤重、肺重，并检测肺转移灶数目及大小(用游标卡尺检测转移灶肿瘤的大小)。(结果见附表4及表5)以上生物制品可制备成各种剂型，例如胶囊、片剂、颗粒剂、口服液、注射液、局部制剂等，也可以制备成控释剂和缓释剂等。表1.VEGF抗体对鼠S180肉瘤的影响组肿瘤发生率瘤重(g，X±SD)抑制率(％)P值PBS 10/10 1.56±0.2150ug 10/10 1.32±0.23 15.38 ＞0.05100ug10/10 1.21±0.23 22.4 ＞0.05200ug10/10 0.92±0.11 41.0 ＜0.05表2. VEEGF抗体对人胃癌细胞MGC-803裸鼠移殖瘤的影响组肿瘤发生率 瘤重(g，X±SD)抑瘤率(％) P值PBS 7/7 2.81±0.94VEGFAb 6/6 0.68±0.28 76.15 ＜0.01表3. VEGF抗体与3H11抗体联合应用对人胃癌细胞裸鼠移植瘤的影响组成瘤率 瘤重(g，X+SD)抑制率(％)P值131I-3H114/5 0.25±0.16131I-3H11+Anti-VEGFAb 1/5 0.04±0.08 84＜0.01表4. VEGF抗体对IVTA2MA-891模型肺转移的影响组 肺转移率 肺转移数(个)抑制率(％)P值PBS 8/841.86±11.61正常兔Ig 4/450.75±6.81 ＞0.05VEGF Ab 7/711.29±3.82 73.03 ＜0.01表5. VEGF抗体对IVTA2MA-891模型肺转移灶大小的影响组 肺转移率 肺转移灶直径大于抑制率(％)P值0.5mm的比例(％)BS8/8 62.09正常兔Ig 4/4 51.16VEGF Ab 7/7 10.13 83.70 P＜0.0权利要求
1.一类治疗肿瘤、血管异常增生疾患的生物制品，包括血管内皮生长因子(VEGF)、多克隆抗体、单克隆抗体，嵌合抗体、单链抗体，其特征在于VEGF在体内体外均有生物学活性，VEGF拮抗剂体内体外可中和VEGF抗原活性，而且体内可抑制肿瘤的生长和转移。
2.根据权利要求1所述的VEGF，在体外可明显刺激内皮细胞的增生，体内可增加血管的通透性及明显促进血管形成。
3.根据权利要求1所述的一种治疗肿瘤、血管异常异常增生疾患的多克隆抗体，其特征在于该抗体可特异地与VEGF抗原结合，体内体外中和VEGF的活性。
4.根据权利要求1所述的一种治疗肿瘤、血管异常增生疾患的单克隆抗体，其特征在于可特异地与VEGF抗原结合，体内体外中和VEGF的活性。
5.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于该抗体被连接在细胞毒素上。这种偶联物能明显抑制肿瘤生长及转移。
6.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于该抗体被连接在放射性同位素上，所形成的偶联物能明显抑制肿瘤生长及转移。
7.根据权利要求2、3或4所述的VEGF、多克隆或单克隆抗体，其特征在于它们可用于筛选或用作鉴定VEGF的拮抗剂。
8.根据权利要求3或4所述多克隆或单克隆抗体，其特征在于二者可分别用于鉴定VEGF活性。
9.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于可用于制备VEGF的单链抗体，在体内或体外均具有中和抗人VEGF活性的能力。
10.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于可制备VEGF嵌合抗体，在体内或体外均具有中和抗人VEGF活性的能力。
全文摘要
一类治疗肿瘤、血管异常增生疾患的生物制品－血管形成及血管增生抑制剂,包括有:多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体,其特征在于VEGF在体内体外均有生物活性,VEGF拮抗剂在体内体外可中和VEGF活性,而且体内可抑制肿瘤生长和转移,临床用于治疗肿瘤、类风湿性关节炎及牛皮癣等疾病。
文档编号A61K38/18GK1169317SQ96106550
公开日1998年1月7日 申请日期1996年6月20日 优先权日1996年6月20日
发明者董志伟, 王贵齐, 徐光炜, 汤健 申请人:中国医学科学院肿瘤研究所