专利名称：一株分泌抗2型猪链球菌的型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法
技术领域：
本发明属于病原微生物免疫学检测技术领域，涉及一株分泌抗2型猪链球菌的型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。
背景技术：
2型猪链球菌(Sti^ptococcus suis serotype 2,SS2)是一种重要的人畜共患病的病原体。根据荚膜多糖的抗原性，SS可分为35个血清型，其中1、2、1/2、7、9、14型具有致病性，以2型(SS》致病性最强。同为SS2菌株，其致病性又有强、弱和无之分。SS2疫病流行范围很广，在加拿大、美国、丹麦、荷兰等国曾多次发生流行。我国于1991年首次在广东省猪群中发生疫情，20多年来在湖北、湖南、江苏、江西、安徽、四川等南方省份的猪群中经常有此病流行，目前已形成和维持着多处疫源地，在适宜气候和环境条件下存在大规模暴发流行的可能。猪群对此病普遍易感，感染后可有急性败血症、肺炎、脑膜炎、关节炎、心内膜炎及急性死亡等多种临床类型，如不及时治疗病死率可达40%甚至更高；病后幸存的猪生长缓慢，存栏时间大为延长。目前在我国，猪链球菌感染每年造成的直接经济损失达数十亿元。特别值得关注的是，近年来我国发生的两起SS2暴发流行感染猪和人的公共卫生事件1998年江苏病死猪10万余头，人群感染25例，其中中毒性休克综合征(Streptococcal toxic shock syndrome, STSS)患者 16 例，死亡 13 例(81. 3% ) ；2005 年四川省 30 余乡镇养殖的猪场流行该病，死亡猪几千头，人群感染204例，其中STSS型患者38例，死亡37例 (97.4%)。同期广东、香港也有病例报导，江苏虽无人感染病例，但猪群流行此病，病死8 万余头。与以往国际报导比较，这两次流行有以下特点国外人感染病例均为散发，我国则呈现群体染病特点；国外病例临床表现为败血症或脑膜脑炎，预后较好，国内这两次流行有高比例的病人出现STSS，病程短，病情凶险，病死率高(81. 3% 97.4% )。引起此次疫情的病原是具有荚膜多糖(capsular polysaccharide, CPS)、溶菌酶释放蛋白(muramidase releasedprotein, MRP)、胞夕卜因子(extracellular factor, EF)、溶血素(suilysin, SLY) 等毒力蛋白的2型猪链球菌强毒株，但致病机理尚不明确。单克隆抗体是研究细菌毒力因子的有用工具，国外研究者用抗B群链球菌，脑膜炎奈瑟菌和大肠杆菌荚膜的单抗进行动物保护性实验并能取得较好的效果。单克隆抗体对许多疾病的诊断和治疗都具有十分重要的意义。但细菌的表面抗原很丰富，做出的单抗常常有交叉反应，不能很专业的识别一种细菌。从目前的国内外的研究来看，猪链球菌的单抗也存在这种问题，只有靠预吸附其他链球菌来克服交叉问题。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述技术中存在的不能克服交叉反应的缺陷，提供一株抗2型猪链球菌的型特异性单克隆抗体细胞株。本发明的另一目的是提供该杂交瘤细胞的制备方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现—株分泌抗2型猪链球菌的型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株2A9，该杂交瘤细胞株通过如下方法制备(1)采用灭活的2型猪链球菌菌株05Ζ 133多次免疫雌性BALB/c小鼠，使小鼠体内抗体达到最高峰时分离脾脏B淋巴细胞；(2)将步骤(1)分离的脾脏B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合；(3)以甲醛灭活的05Ζ 133全菌抗原包被ELISA板，使用全菌ELISA筛选阳性克隆；再进一步以全菌裂解液为抗原用Western blot法再次验证ELISA筛选得到的阳性克隆，最终获得杂交瘤细胞株2A9。其中，步骤(1)优选选用雌性BALB/c小鼠，采用甲醛灭活的05Ζ 133分离株为免疫原，注射菌量为IO7Cfu/只鼠，间隔2周追加免疫共3次，在融合前3天加强免疫一次，菌量为IO8Cfu/只鼠。一种制备分泌抗2型猪链球菌的型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，包含如下步骤(1)采用灭活的2型猪链球菌菌株05Ζ 133多次免疫雌性BALB/c小鼠，使小鼠体内抗体达到最高峰时分离脾脏B淋巴细胞；(2)将步骤(1)分离的脾脏B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合；(3)以甲醛灭活的05Ζ 133全菌抗原包被ELISA板，使用全菌ELISA筛选阳性克隆；再进一步以全菌裂解液为抗原用Western blot法再次验证ELISA筛选得到的阳性克隆，最终获得分泌抗2型猪链球菌的型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。其中，步骤(1)优选选用雌性BALB/c小鼠，采用甲醛灭活的05Ζ 133分离株为免疫原，注射菌量约IO7Cfu/只鼠，间隔2周追加免疫共3次，在融合前3天加强免疫一次，菌量为IO8Cfu/只鼠。有益效果本发明的抗2型猪链球菌的型特异性单克隆抗体具有很好的特异性，在猪链球菌 35个血清型的全菌裂解液的western blot分析中，只有2型猪链球菌菌株与该单抗反应。 在对7株荷兰分离和4株中国分离的2型猪链球菌菌株western blot分析时，所有2型猪链球菌菌株都能与该单抗反应，最后用7株非猪链球菌的链球菌全菌裂解液与抗体反应， 发现7株非猪链球菌株的链球菌都不与该抗体反应。说明该抗体是抗2型猪链球菌的型特异性单抗，对2型猪链球菌菌株具有识别作用，可以用做鉴定该病原的有力工具。
图1是抗2型猪链球菌的型特异性单克隆抗体通过western blot验证其识别的特异性。各泳道分别为:1, S10* ；2，32132(阴性对照)；3，S735* ；4，NTCT撤34 ；5,9801# ； 6,98012# ；7，05ZYH33# ；8,8012* ；9,8014* ；10,8011* ； 11,8004* ；12,8019* ；13,5428(阴性对照)；14，HAbb#。*为荷兰分离的2型猪链球菌菌株。#中国分离的2型猪链球菌菌株。NTCT10234 国际标准株猪链球菌35个血清型中的2型分离株。
32132 无乳链球菌。5428 国际标准株猪链球菌35个血清型中的1型分离株。图2是单抗的调理能力分析图HNNS,用热灭活的正常人血清调理的细菌组。2A9，用抗2型猪链球菌的型特异性单抗调理的细菌组。Polyclonal serum，用抗2型猪链球菌菌株(0Μ 133)的超免多抗兔血清条理的
细菌组。代表两组之间比较差异极显著(P < 0. 001)。 具体实施方案实施例1 免疫和细胞融合、筛选及克隆化选用7周龄雌性BALB/c小鼠。采用甲醛灭活的05Ζ 133分离株为免疫原，注射菌量约IO7Cfu/只鼠，间隔2周追加免疫共3次，在融合前3天加强免疫一次，菌量为IO8Cfu/ 只卿ο2.细胞融合、筛选及克隆化小鼠加强免疫3天后无菌取脾脏细胞O X IO8)和SP2/0细胞G X IO7)，再加入预热的50% PEG1500进行融合，融合细胞悬浮于HAT培养基中，分布于含饲养细胞的的96孔板中，0. Iml/孔，置37°C、5% C02培养箱中培养，每3_4天半量换HAT培养基，7天后改用 HT培养基，14天后改用完全1640培养基。取杂交瘤细胞分泌上清以菌体ELASA方法进行抗体检测，阳性克隆通过有限稀释法进行3-4次克隆化。实施例2 全菌ELASA方法检测抗体每孔加入50 μ 1的0. 1 %多聚赖氨酸(PLL)，温育两小时，移去PLL，加入 50口11060伪的2丫/!133菌悬液，60(^离心101^11，移去菌液，每孔加入6(^10. 5%的戊二醛， 温育15min，用PBST洗板两次，再用的BSA封闭lh，吸去封闭液，该板即可用于检测。检测时加入50 μ 1的细胞上清或腹水稀释液，温育lh，再用PBST洗板三次，加入酶标二抗，温育Ih，PBST洗板三次，OPD显色。结果显示通过方阵法确定全菌ELASA中包被抗原和酶标抗体的最适浓度，菌体抗原包被的最适浓度为106cfu，酶标抗体的最适稀释度为1 10000。经筛选及克隆化共获得6株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1A8、1B4、2A9、3C2、4B4、4B9。应用这六株杂交瘤制备的腹水经全菌ELASA检测，2A9抗体效价为1 25600，其他五株抗体效价在 1 1600 1 6400 之间。实施例3 =Western bloting 检测将35种血清型猪链球菌标准株、荷兰分离株、32220，肺炎球菌等(表1)超声裂解，取上清进行12%的SDS-PAGE电泳，电泳完毕后电转移至硝酸纤维素膜上，于4°C下转移 90分钟；取出膜，37°C封闭60分钟，TBST洗三次；将膜与1 1000稀释的腹水抗体4°C孵育过夜，第二日摇床上37°C反应60分钟，TBST洗三次；将膜浸在HRP-羊抗鼠(1 10000) 中，37 V反应60分钟，TBST洗三次；以底物DAB/CoC12/H202显色，待有条带出现，立即用蒸馏水清洗以终止反应。可以得出以全菌超声裂解液上清进行SDS-PAGE电泳并转膜后，以2A9株腹水型抗体进行Western blot结果显示，抗体与猪链球菌标准株中的1型，1/2型，3_35型超声裂解的上清未见反应条带，只与2型株在约90KD处有反应条带；抗体与和荷兰分离的2型猪链球菌株超声裂解的上清都有反应条带；抗体与05Ζ 133、Habb、9801、98012超声裂解的上清中约90KD的蛋白有反应条带；抗体与粪肠球菌32220、肺炎球菌超声裂解液的上清蛋白未见反应条带；抗体与菌株W^festern bloting如图。实施例4 单克隆抗体的初步纯化饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体。将腹水用生理盐水对倍稀释，电磁搅拌下缓缓加入饱和硫酸铵(事先用浓氨水调至PH7. 8)至终浓度50%，4°C下静置1小时，4000转/分钟 4°C离心20分钟，沉淀生理盐水溶解，电磁搅拌下缓缓加入饱和硫酸铵至终浓度33%，4°C 下静置1小时，室温放置5分钟，4000转/分钟4°C离心20分钟，沉淀再用生理盐水溶解， 33%饱和度再重复沉淀3次，最后一次沉淀溶于尽量少的生理盐水中，放入处理好的透析袋中，IOOOml去离子水中透析3小时，换液3次。最后在0. OlM PBS中透析过夜。将透析好的样品加入终浓度20%的甘油，-20°C保存备用。实施例5 抗体的调理吞噬实验利用成品的Protein-Α的亲和层析柱对饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体进一步提纯， 再用成品的人中性粒细胞分离液分离健康人的中性粒细胞。分别用热灭活的健康人血清 (阴性对照)，纯化的单抗70yg和按1 5稀释的0MYH33超免的兔多抗血清(阳性对照)对05Ζ 133在37°C调理30min，分别收集处理过的细菌，按细菌细胞为10 1的比例与分离的人中性粒细胞混合，并在37°C，5% C02的细胞培养箱中放置lh，最后加入无菌水反复吹打，充分破碎细胞，并涂布于THB平板上计数，存活率的计算公式如下(CFUpmn+/ CFUpmnJ*100%。该实验分别重复了 3次。结果发现用热灭活的健康人血清调理的细菌的存活率为19. 6% 士2. 64%，用单抗调理过的细菌的存活率为4. 2% 士0.916%，差异极显著。同时，阳性对照的调理过的细菌的存活率为士0. ；3464%。实施例6 抗体的保护性实验实验共有三个组，每组15只SPF级的BABL/c小鼠，第一组只注射IO8CFU是猪链球菌05Ζ 133，第2组注射05ZYH33与0. 8mg纯化的单抗混合液，第三组注射05Ζ 133与 05ZYH33超免的兔多抗血清混合液。结果见表1，由表1得出只注射IO8CFU是猪链球菌05Ζ 133的实验组15只小鼠在3天内全部死亡，注射05Ζ 133与0. 8mg纯化的单抗混合液的实验组，15只中只有6只死亡，保护率为60%。表 权利要求
1.一株分泌抗2型猪链球菌株的型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株2A9，其特征在于该杂交瘤细胞株通过如下方法制备(1)采用灭活的2型猪链球菌菌株05ZYH33多次免疫雌性BALB/c小鼠，使小鼠体内抗体达到最高峰时分离脾脏B淋巴细胞；(2)将步骤(1)分离的脾脏B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合；(3)以甲醛灭活的05ZYH33全菌抗原包被ELISA板，使用全菌ELISA筛选阳性克隆；再进一步以全菌裂解液为抗原用Western blot法再次验证ELISA筛选得到的阳性克隆，最终获得杂交瘤细胞株2A9。
2.根据权利要求1所述的分泌抗2型猪链球菌的型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株2A9，其特征在于(1)选用雌性BALB/c小鼠，采用甲醛灭活的05Ζ 133分离株为免疫原， 注射菌量为IO7Cfu/只鼠，间隔2周追加免疫共3次，在融合前3天加强免疫一次，菌量为 IO8Cfu/ 只鼠。
3.一种制备分泌抗2型猪链球菌的型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，其特征在于包含如下步骤(1)采用灭活的2型猪链球菌菌株05ZYH33多次免疫雌性BALB/c小鼠，使小鼠体内抗体达到最高峰时分离脾脏B淋巴细胞；(2)将步骤(1)分离的脾脏B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合；(3)以甲醛灭活的05ZYH33全菌抗原包被ELISA板，使用全菌ELISA筛选阳性克隆；再进一步以全菌裂解液为抗原用Western blot法再次验证ELISA筛选得到的阳性克隆，最终获得分泌抗2型猪链球菌的型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
4.根据权利要求3所述的制备分泌抗2型猪链球菌的型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，其特征在于(1)选用雌性BALB/c小鼠，采用甲醛灭活的05ZYH33分离株为免疫原，注射菌量为IO7Cfu/只鼠，间隔2周追加免疫共3次，在融合前3天加强免疫一次，菌量为IO8Cfu/只鼠。
全文摘要
本发明属于病原微生物免疫学检测技术领域，涉及一株分泌抗2型猪链球菌的型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。本发明分泌抗2型猪链球菌的型特异性鼠源单克隆抗体细胞株是通过以甲醛灭活的2型猪链球菌菌株(O5ZYH33)为免疫原免疫小鼠，在免疫后的小鼠体内抗体达到最高峰时，用免疫后鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/O)融合，用全菌ELISA筛选出抗2型猪链球菌的型特异性鼠源单克隆抗体细胞株得到的。本发明的抗体具有很好的特异性和调理作用，并在小鼠的动物保护模型中具有部分的保护性。
文档编号C12R1/91GK102533667SQ20121002335
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月2日 优先权日2012年2月2日
发明者唐家琪, 李先富, 潘秀珍, 王忠灿, 王长军 申请人:中国人民解放军南京军区军事医学研究所