专利名称：一种从绵羊毛囊组织中提取总rna的方法
技术领域：
:本发明属于RNA制备技术领域，具体涉及一种从绵羊毛囊组织中提取总RNA的方法。
背景技术：
:RNA是一种多功能分子，它作为DNA转录的产物及蛋白质的翻译模板，与DNA、蛋白质及RNA本身都存在许多互作。不同的RNA在生化过程中充当着信使、酶及结构组分等多种角色，在生命活动的各环节发挥着重要的作用。随着生物技术及计算机技术的不断发展，越来越多的方法可用于RNA的检测与研究，RNA种类及功能的多样性也不断的被发现。随着研究的深入，人们也意识到RNA的研究在揭示生命过程本质及疾病治疗等方面都有着重要意义。欲对RNA进行研究，首先要从组织中提取得到高质量的RNA。但RNA与DNA不同，极容易发生降解，RNA降解将对后续研究的真实性及可靠性产生极大的影像。引起RNA降解的主要因素是RNA酶(章国卫等，真核细胞中mRNA的降解机制；遗传；1999，21 (6):49-53.)。RNA酶有2种来源，一种是外源性的，一种是内源性的。因此在采集用于RNA提取的样品时，重点就在于如何防止外源性RNA酶污染及抑制内源性RNA酶活性上。外源性RNA酶可以通过DEPC等RNA酶抑制剂处理实验用品以及严格的实验操作和试验环境的控制来加以排除。而内源性RNA酶却很难去除，只能通过液氮或干冰制造低温或者组织样品保护液浸泡的方法来进行抑制(Mutter, G.L.et al.(2004).Comparison of frozen and RNALater solidtissue storage methods for use in RNA expression microarrays.BMC Genomics.5:88)。但对于某些组织来说，这样的处理很难达到预期效果，比如毛囊组织。由于毛囊组织体积极小，使用液氮冻存后不方便研磨，且角质化程度高，使用组织样品保护液无法快速渗透到组织内部，起不到抑制RNA酶的效果。这些都是影响毛囊组织RNA提取产量及质量的重要因素，特别是在野外现场对绵羊等动物进行毛囊采集时这种问题尤为明显，这些问题都阻碍了对毛囊组织基因RNA水平表达研究的进展。本发明就是为了解决以上难题而提供了一种从现场样品采集开始，包括样品运输、保存，到RNA提取的绵羊毛囊组织RNA提取方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种获得高质量RNA的方法。本发明提取的绵羊毛囊组织总RNA，不被外源或内源RNA酶降解到最低限度，能最大限度地保持被提取的总RNA的纯度，以利于后续试验的利用。本发明操作简单方便，成本低，无需液氮和RNA样品保护液。本发明获得的毛囊组织总RNA纯度高、完整度好，可用于反转录cDNA、PCR、QPCR等下游操作及mRNA与microRNA的检测等分子生物学的操作应用。实现本发明的技术方案如下所述:(1)现场采集毛囊组织及处理:
a)在活体状态下，从绵羊体侧成股拔取羊毛，用剪刀在距离羊毛根部毛囊泡Icm处将羊毛剪断，收集毛囊至装有700 μ L TRIzol的1.5mL锥形底离心管中，收集量至毛囊组织总体积占TRIzol液体体积的1/3即可；b)立刻用小型塑料研磨杵在离心管内研磨lmin，向离心管内补充300 μ L TRIzol使1.5mL离心管内的TRIzoI总量达lmL，盖好盖子甩动离心管让毛囊完全浸泡在TRIzoI液体中，将离心管放入离心管盒内，即完成采集；c)在避光条件下，于24小时内将研磨后装有样品的离心管放入-20°c暂时冻存。(2)样品运输:将装有样品的离心管从_20°C取出放入泡沫盒，同时放入足够量的冰袋，密封后进行运输，使运输过程中的冰袋不完全融化为准。(3)样品保存在室温下解冻浸泡在TRIzol中的样，于4°C 12000rpm离心lOmin,吸取TRIzol液体至新离心管，此时，TRIzol液体可放入_80°C保存，至少I个月毛囊RNA不会降解。(4) RNA 提取:a)在室温下解冻由步骤(3)中冻存的TRIzol样品液体，向每ImL TRIzol样品中加入200 μ L氯仿，剧烈 震荡混匀20s，室温静置5min ；b)于4°C 12000rpm离心15min,取400 μ L所得上清至新离心管;c)向所得上清中加入400 μ L异丙醇，上下颠倒混匀10次，室温静置IOmin ；d)于4°C 12000rpm离心lOmin,可见管底有白色沉淀,弃液体；e)向离心管中加入ImL 75%浓度的乙醇溶液(该乙醇溶液用RNase-Free ddH20稀释配制，使乙醇溶液的终浓度至75% )，用手指弹动离心管底，让沉淀悬浮于液体之中；f)于4°C 7500rpm离心5min，弃液体。用枪头吸干管底残液，不要触及沉淀，避免将沉淀吸走；g)室温晾干沉淀后,用RNase-Free ddH20溶解沉淀,得到绵羊毛囊组织总RNA样品O其中上述实验所用到所有耗材均经由0.1 %浓度的焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液浸泡8h后12CTC高压蒸汽灭菌30min。本发明的优点是:简单方便，成本低，无需液氮及RNA组织样品保护液，易于在羊场等野外环境下操作。所得到的总RNA完整度高，质量好，可用于下游的反转录cDNA、PCR或QPCR等实验。
序列表SEQID NO:1是本发明的应用实施例中扩增的18S基因的部分核苷酸序列(119bp)。序列表SEQID NO:2是本发明的应用实施例中扩增的GAPDH基因的部分核苷酸序列(15Ibp)。序列表SEQID NO:3是本发明的应用实施例中扩增的KRTAP11.1基因的部分核苷酸序列(127bp)。序列表SEQID NO:4和5是应用实施例中扩增18S基因片段的引物序列(上、下游引物)。序列表SEQ ID NO:6是应用实施例中扩增GAPDH基因片段的引物序列(上游引物)。序列表SEQ ID NO:7和8是应用实施例中扩增KRTAP11.1基因片段的引物序列(上、下游引物)。序列表SEQ ID NO:9是本发明的应用实施例中扩增的5S基因部分核苷酸序列(116bp)。序列表SEQ ID NO: 10是本发明的应用实施例中扩增的U6基因的部分核苷酸序列(91bp)。序列表SEQ ID NO:11和12是本发明的应用实施例中扩增5S基因片段的引物序列(上、下游引物)。序列表SEQ ID NO:13和14应用实施例中扩增U6基因片段的引物序列(上、下游引物)。序列表SEQ ID NO:15和16是应用实施例中扩增miR_31基因片段的引物序列(上、下游引物)。序列表SEQ ID NO: 17是应用实施例中扩增的miR_31基因的部分核苷酸序列(65bp)ο序列表SEQ ID NO:18是应用实施例中反转录miR_31基因的茎环引物序列(44bp)。
序列表SEQ ID NO:19是应用实施例中扩增GAPDH基因片段的引物序列(下游引物)。图1:毛囊采集时所用到的1.5mL离心管(如图左所示)及小型塑料研磨杵(如图右所示)。图2:利用本发明提取的绵羊毛囊组织RNA电泳结果。泳道1、2、3分别对应编号为1、2、3的三只不同的绵羊个体的毛囊组织RNA。图3:18S、GAPDH、KRTAP11.1 基因 PCR扩增产物电泳结果。泳道M为 IOObp Marker,I为18S扩增产物，2为GAPDH扩增产物，3为KRTAP11.1扩增产物。图4:5S、U6、miR-31基因PCR扩增产物电泳结果。泳道M为50bp Marker, I为5S扩增产物，2为U6扩增产物，3为miR-31扩增产物。图5:18S、GAPDH、KRTAP11.1基因QPCR扩增曲线图。图中:纵坐标为荧光强度，横坐标为PCR循环数。其中:1为18S扩增曲线，2为GAPDH扩增曲线，3为KRTAPl1.1扩增曲线。图6:5S、U6、miR-31基因QPCR扩增曲线图。图中:纵坐标为荧光强度，横坐标为PCR循环数。其中:1为5S扩增曲线，2为U6扩增曲线，3为miR-31扩增曲线。
具体实施例方式实施例1:从西藏绵羊毛囊组织中提取总RNA本实验在西藏林芝地区羊场采样，在湖北武汉华中农业大学进行RNA提取。实验所用试剂包括=TRIzol购买于Invitrogen公司(货号:15596026) ；RNase-Free ddH20购买于天根生化科技有限公司(货号:RT121);焦碳酸二乙酯(DEPC)购买于Sigma公司(货号:D5758)。1.样品采集(I)在羊场从绵羊体侧成股拔取羊毛，用剪刀在距离羊毛根部毛囊泡Icm处将羊毛剪断，收集毛囊至装有700 μ L TRIzol液体的1.5mL锥形底离心管中。收集量为毛囊体积占TRIzoI液体体积的1/3。(2)用小型塑料研磨杵在离心管内研磨lmin，向离心管内补充300 μ L TRIzol，使毛囊全部浸泡在TRIzol液体中。样品当天在_20°C下过夜。2.样品运输次日样品同若干冰袋一起放入泡沫盒中进行空运，2日后到达实验室。开封检查，冰袋并未完全融化。3.样品保存将样品解冻，于4°C 12000rpm离心lOmin,吸取TRIzol液体至新离心管,弃去沉淀毛囊。将吸出的TRIzoI液体样品放入_80°C冰箱冻存。4.RNA 提取(I) I个月后，解冻TRIzoI液体样品，向ImLTRIzol样品中加入200 μ L氯仿，剧烈震荡混匀20s，室温静置5min。(2)在4°C 12000rpm离心15min，取400 μ L所得上清至新离心管。
(3)向所得上清中加入400 μ L异丙醇，上下颠倒混匀10次，室温静置lOmin。(4)在4°C 12000rpm离心lOmin,可见管底有白色沉淀,弃液体。(5)向离心管中加入ImL 75%浓度的乙醇溶液(用RNase-Free ddH20配制，使乙醇溶液的终浓度至75% )，用手指弹动离心管底，让沉淀悬浮于液体之中。(6)在4°C 7500rpm离心5min，弃液体。用枪头吸干管底残液，不要触及沉淀，避免将沉淀吸走。(7)室温晾干沉淀后，用20 μ L RNase-Free ddH20溶解沉淀，得到毛囊组织总RNA样品。(8)用该发明提取了 3只西藏绵羊的毛囊组织总RNA，浓度及纯度检测结果如表1，总RNA电泳结果见图2。表1:3只西藏绵羊毛囊组织总RNA浓度及纯度检测
样品编号浓度(ng/μΙ.)OD260/280OD260/230
_I_90.76_L99_h90_
2 97.62 1.99 1.93_3_90.94_Z03_h95_从结果可以看出，使用本发明提取的RNA纯度较高，电泳得到的28S、18S、5S条带清晰，28S条带亮度近似18S的2倍，说明RNA完整度良好，无明显降解现象。说明使用本发明可以获得较高质量的绵羊毛囊组织总RNA。实施例2:用本发明从绵羊毛囊组织中提取的总RNA进行基因mRNA水平表达的PCR检测1.使用实施例1中提取的毛囊组织总RNA进行反转录合成cDNA。试剂使用宝生物工程大连有限公司的“P「imeSc「ipt RT reagent Kit With gDNA Eraser”试剂盒(货号:DRR047S)，仪器为Bio-red公司的MyCycler PCR仪。具体操作步骤如下:(I)基因组DNA的去除反应，反应体系(总体积)10 μ L，反应液配方如下:
权利要求
1.一种从绵羊毛囊组织中提取总RNA的方法，其特征在于以下步骤: (1)现场采集: a)取绵羊毛囊至装有700μ L TRIzol的1.5mL锥形底离心管中，毛囊组织的收集量至毛囊组织总体积占TRIzol液体体积的1/3 ； b)立刻用小型塑料研磨杵在离心管内研磨lmin，向离心管内补充300μ L TRIzol使1.5mL离心管内的TRIzoI总量达ImL ;盖好盖子甩动离心管让毛囊完全浸泡在TRIzoI液体中，将离心管放入离心管盒内，即完成采集； c)在避光条件下，于24小时内将研磨后装有样品的离心管放入_20°C暂时冻存； (2)样品运输: 将装有样品的离心管从_20°C取出放入泡沫盒，同时放入足够量的冰袋，密封后进行运输，使保证运输时冰袋中的冰不完全融化为准； (3)样品保存: 在室温下解冻浸泡在TRIzol液体中的样品，于4°C 12000rpm离心lOmin，吸取TRIzol液体至新离心管，将TRIzoI液体放入-80°C保存，保存期至少为I个月至毛囊RNA不被降解；(4)RNA 提取: a)在室温下解冻由步骤(3)中冻存的TRIzoI样品液体，向每ImLTRIzol样品中加入`200 μ L氯仿，剧烈震荡混匀20`s，于室温下静置5min ；` b)于4°C12000rpm离心15min，得上清，取400 μ L所得的上清至新的离心管； c)向所得的上清中加入400μ L异丙醇，上下颠倒混匀10次，于室温下静置IOmin ； d)于4°C12000rpm离心lOmin，可见管底有白色沉淀，弃液体，保留管底的白色沉淀； e)向离心管中加入ImL75%浓度的乙醇溶液，用手指弹动离心管底，让沉淀悬浮于液体之中； f)于4°C7500rpm离心5min，弃液体，用枪头吸干管底残液，不要触及沉淀，避免将沉淀吸走；` g)于室温下晾干沉淀后，用RNase-FreeddH20溶解沉淀，得到绵羊毛囊组织总RNA样品O
全文摘要
本发明属于RNA制备技术领域，具体涉及一种从绵羊毛囊组织提取总RNA的方法。其特征包括，从野外现场采集绵羊毛囊，样品低温运输、保存和RNA提取步骤得到毛囊总RNA。本发明提取毛囊总RNA，不会被外源或内源RNA酶降解到最低限度，能最大限度地保持被提取的总RNA的纯度，以利于后续试验的利用。本发明操作简单方便，成本低，无需液氮和RNA样品保护液。本发明获得的毛囊组织总RNA纯度高、完整度好，可用于反转录cDNA、PCR、QPCR等下游操作及mRNA与microRNA的检测应用。
文档编号C12N15/10GK103243085SQ20121002376
公开日2013年8月14日 申请日期2012年2月3日 优先权日2012年2月3日
发明者余梅, 柳广斌, 赵书红, 李新云, 曹建华, 李小平, 李长春, 朱猛进, 陈若男 申请人:华中农业大学