专利名称：烟草干旱响应基因NtRHF1及其编码蛋白的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，特别涉及一种烟草干旱响应基因NtRHFl及其编码蛋白的应用。
背景技术：
近年来，随着全球气候变暧，干旱已成为我国作物生产中频繁发生的自然灾害。畑草作为中国重要的经济作物，在整个生育期对水分的要求很高。中国大部分畑区处于干早、 半干旱环境中，而且优质烟区多位于丘陵山区，常因土壌干旱而影响烟株的生长发育，导致烟叶的产量和品质降低，干旱已成为制约我国烟叶产量与品质提高的主要限制因子之一。 因此，加强烟草抗旱基因资源的挖掘和利用，对于烟草抗旱新品种培育，实现烟草农业可持续发展具有重大意义。自20世纪80年代以来，国内外学者在干旱对烟草生长、发育、代谢的影响等方面做了大量研究，取得了ー些重要进展。归纳起来主要有以下几个方面第一，干旱对烟草生理的影响，主要表现在(1)干旱胁迫影响了叶绿素的合成，促进了叶绿素的分解，从而影响了叶片的光合效率(Plant Molecular Biology，1979，20 :37-44) ； (2)干旱胁迫导致植株氮素代谢关键酶-硝酸还原酶(NR)的活性降低，而蛋白水解酶活性增强引起脯氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和缬氨酸等大量积累；C3)干旱胁迫导致叶片膜脂过氧化作用增强，膜透性増加，丙ニ醛(MDA)含量升高，出现电解质外滲。抗氧化保护酶S0D、P0D、CAT等酶活性显著下降。第二，干旱对烟草生长发育的影响，主要表现在(1)干旱胁迫降低了种子的萌发和幼苗的成活；(2)抑制了根系的生长，从而影响了矿质营养的吸收；(3)干旱胁迫导致植株矮小，节间短，叶片小，易早衰。这些研究较好地阐明了干旱对烟草生长、发育及代谢影响的生理生化基础，但缺乏对烟草抗旱分子遗传机理的研究。近年来，随着分子生物学和基因组学研究的深入，抗旱基因的发掘成为目前作物抗逆遗传资源与品种改良研究的热点，越来越多的抗旱相关基因相继被克隆和鉴定。按照抗旱基因的功能，可以把植物抗旱相关基因分为两大类第一类基因为功能基因，主要在植物抗性中起保护作用。这ー类基因主要包括滲透调节基因如海藻糖合成酶基因TPSlJf 氨酸合成酶基因P5CS、甘露醇合成基因mtlD、甜菜碱合成酶级以内BADH、及多按合成基因 Odc等；保护生物大分子的活性基因如脱水蛋白基因BDW、水通道蛋白基因AQP和晚期胚胎发生丰富蛋白LEA等。第二类基因为调节基因，主要在信号传导和逆境基因表达过程中起调节作用，主要包括一些转录因子基因如DREB、MYB、bZIP、WRKY、NAC等。这些基因已在植物基因工程中得到应用。泛素化是生物体内蛋白质翻译后的重要修饰之一，是蛋白质降解的信号。泛素连接酶E3是泛素化过程中的关键酶类，决定了泛素化修饰的特异性，在植物激素调控、花发育和病原菌防卫反应中起着重要的作用(Plant J,2010,61 :1029-1040 ;J Exp Bot，2007， 58 :221-227)。目前烟草中E3连接酶编码基因的克隆与功能鉴定的报道较少。
发明内容
本发明提供一种受干旱胁迫诱导表达的烟草基因RHFl (RING-H2 Finger 1)及其编码蛋白的应用；烟草干旱响应基因NtRHFl，核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示；该基因编码ー种具有锌指结构的泛素E3连接酶，过量表达能提高植物对干旱胁迫的抗性，尤其是能够提高植物的抗旱能力。本发明的有益效果为本发明中，干旱处理的烟草幼苗叶片中，所述的泛素E3连接酶编码基因RHFl被诱导表达。本发明所述的蛋白NtRHFl是植物泛素化蛋白降解途径中的关键酶类，所以调控 NtRHFl的表达能够调节植物对干旱的抗性。因此所述的干旱响应的基因NtRHFl在植物抗旱领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。。
图1 :NtRHFl的PCR产物电泳图；图2 烟草幼苗叶片中NtRHFl基因响应干旱胁迫的表达模式柱状图；图3 =NtRHFl基因植物表达载体构建示意图；图4 转NtRHFl基因的烟草株系表达水平柱状图；图5 =NtRHFl基因过量表达的烟草植株对干旱胁迫处理的生长表型照片；图6 =NtRHFl基因过量表达烟草植株对干旱胁迫处理的生理指标变化的柱状图。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例1 材料干旱胁迫处理云畑87种子经15%次氯酸钠消毒后，放于含蒸馏水的培养皿中，在温度为 M-26°C、湿度为60%、光暗交替周期为1池/1池的光照培养室中培养。待幼苗长至ニ叶一心(约14天)吋，倒掉蒸馏水，进行20% PEG 6000溶液胁迫处理实验。处理的时间分别为 1、3、6、12、24小时；胁迫处理后的烟草作为实验者，未做胁迫处理的烟草幼苗作为对照組， 用于RHFl的表达分析。转基因烟草植株的干旱处理，采用人工控制浇水法。待植株长至5 片叶(约30天)吋，停止浇水14天，观察各株系生长情況。实施例2 :RHF1 (RING-H2 Finger 1)基因的克隆1.畑草叶片第一链cDNA合成畑草叶片总RNA的分离和纯化參照TRIZOL试剂盒(Invitrogen，USA)说明书进行。将所述的烟草叶片总RNA吸取1-2 μ g于1. 5ml离心管中，按照i^ermentas公司的 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit产品说明进行反转录，得到烟草叶片第一链 cDNA。2. NtRHFl 基因的 PCR 扩增以所述的第一链cDNA为模板，进行NtRHFl基因的PCR扩增，得到PCR扩增产物。ホ艮 ig 网立占 http //www. ncbi. nlm. nih. gov/ 巾:]0 胃ま: ·歹[J ホ示 f (Expressed Sequence Tag, EST)信息设计烟草的NtRHFl基因的全长cDNA引物
上游引物5‘ -ATGAGTTTTGTTTTCCGAG-3 ‘；下游引物5'-CTACACCATATCATA AGCATC-3‘。将所述的PCR产物在1. 0%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶照相系统检测扩增产物(如图 1所示)，获得822bp长的片段。3.电泳结束后，用生エ生物工程上海公司的胶回收试剂盒，按照产品说明回收纯化所述的PCR扩增产物，并送至北京华大基因公司测序，验证其正确性。实施例3 =NtRHFl基因的表达分析1.本实例中利用荧光定量RT-PCR方法来分析NtRHFl基因在20% PEG 6000胁迫下的表达情況。实验样品为实施例1中所述的实验者和对照组中的烟草叶片。每个样品中， 按照实施例2中所述的方法，取5 μ g的总RNA反转录成第一链CDNA作为模板。根据NtRHFl基因全长cDNA序列设计荧光定量PCR特异引物为上游引物5，-TTGGTGCTCGGTGTCTTCTTTAT-3，；下游引物5，-GTGCCCTCAGTGTTTCGTAATCT-3，。应用BioRad iQ5实时定量PCR仪进行PCR扩增，扩增产物为M4bp。2.每个样品分别以上游引物5，-TGGCATCACACTTTCTAAAC-3，和下游引物 5’ -CAACGGAATCTCTCAGCCCT-3’来扩增烟草Actin基因片段作为内參基因。3.反应结束后分析荧光值变化曲线和融解曲线。将Ct值导入Microsoft Excel 2003中，按照公式2_ΔΔ\计算目的基因的相对表达量，并绘制基因表达差异柱状图。计算
公式为Δ Ct目标基因= しT目标基因_レTUbiquitinΔ ACt目标基因=处理组Δ Ct目标基因-对照组C施—in4. NtRHFl在干旱胁迫下的表达分析将生长14天的烟草幼苗移至20% PEG 6000溶液中进行1、3、6、12J4小时的胁迫处理。NtRHFl在干旱胁迫下的表达模式如图2所示，在胁迫处理的M小时内，NtRHFl基因在干旱处理后的3小时表现出明显的升高，一直持续到M小时，仍保持较高的表达量。这表明NtRHFl受干旱胁迫表现出较强的诱导表达。实施例4 =NtRHFl基因转化烟草及转基因植株检测1.植物表达载体的构建以实施例2中构建的NtRHFl全长cDNA片段为模板，用含有EcoRI和BamHI接头序列的特异引物进行PCR扩增，扩增产物经EcoRI和BamHI双酶切、回收后，正向插入植物双元表达载体PART27的CaMV 35S启动子之后的EcoRI和BamHI位点之间，得到重组载体 pART27-NtRHFl (图 3)。引物序列如下上游引物5，-AGTGAATTCATGAGTTTTGTTTTCCGAG-3，；下游引物5，-ACAGGATCCCTACACCATATCATAAGCATC-3，。2.农杆菌介导的基因转化烟草及转基因植株的鉴定经PCR、质粒酶切鉴定正确的重组质粒利用冻融法转化农杆菌LBA4404，经菌落 PCR检测正确后，利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草品种云烟87。具体方法如下(1)农杆菌的活化从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到5mL LB液体培养基中(Rif 100μ g/mL、Specl00y g/mL”8°C，180rpm 摇床震荡培养 20-24h 至 0D600 达至Ij0. 6-0. 8。( 转接活化后的菌液按1 50的比例，转入含有相应抗生素的LB液体培养基中沘で，180rpm摇床震荡培养4_6h左右，0D600达到0. 3-0. 5时可用于转化。(3)侵染于超净工作台中，取无菌珊西烟苗的幼嫩、健壮叶片，去主脉，将叶片剪成0. 5cm2的小块，放入菌液中浸泡5-15min。取出叶片置于无菌滤紙上吸去附着的菌液。(4)共培养将侵染后的烟草叶片铺放于含有共培养基(MS基本固体培养基+Img/ L6-BA+0. lmg/LNAA)培养皿上，用封ロ膜封好培养皿，28°C黑培养1_2天。(5)选择分化培养将共培养后的烟草叶片转接到含有选择分化固体培养基(共培养基+600mg/LCef+100mg/LKm)的平皿上，用封ロ膜封好培养皿，在温度为25で，光照强度为2000-100001ux，16h/8h光暗条件下选培养。(6)生根培养选择分化培养约2-3周后，待烟草不定芽长到l-2cm左右吋，切下不定芽并移到含有生根培养基(MS基本固体培养基+0. 3mg/L NAA+100mg/L Km+600mg/L Cef)的三角瓶里进行生根培养。(7)移栽待根生长至2-3cm。苗高7-lOcm左右吋，移出三角瓶洗去根部培养基， 移栽于花盆中，温室培养。3.利用生エ生物工程上海公司的植物基因组提取试剂盒，按照产品说明提取转基因烟草幼苗的基因组DNA，利用本实例中所述的引物进行PCR扩增，进ー步检测和筛选阳性植株，从15株再生植株中检测到10株阳性植株。4.按照实例2中所述方法提取野生型植株和10株转NtRHFl基因Ttl代植株的总 RNA，按照实例3中所述的方法进行荧光定量RT-PCR分析，进ー步分析不同株系的表达情况。荧光定量PCR所用的畑草内參基因Actin如实施例3中所述。结果表明，在10株转NtRHFl基因的Ttl代植株中，有5株表达量较高，而在野生型对照中未检测到该基因的表达(图4)。将分子鉴定阳性的植株单株收种子，各单株种子分别播种，用卡那霉素继续筛选以观察Tl代的分离情況，如此重复直至T3代获得遗传稳定的转基因株系，共获得5个稳定遗传的转基因株系。选择稳定遗传的转基因株系中的表达量高的2个株系(0E-4和OE-の进行下一歩的干旱胁迫处理实验。实施例5 转NtRHFl过量表达烟草植株对干旱胁迫的抗性表型鉴定1.实验方法将野生型(WT)和2个转基因系(0E-4-和0E_5)烟草种子先经4°C 冰箱春化，然后于超净工作台里用15%的次氯酸钠溶液消毒并用灭蒸水洗浄，均勻播于含营养土的小盆中，置于光照培养室中培养。待幼苗长至5片叶时(30天)，停止浇水2周，观察植株生长情況，并记录相关数据。实验共设三次重复，毎次重复所测试的各株系植株均为 10株。2.实验结果烟草植株经干旱处理14天后，与对照相比，NtRHFl转基因畑草生长基本正常，叶片表现部分萎焉，而野生型植株生长受到明显抑制，大部分叶片萎焉，受伤程度较重，植株明显比转基因的要小(图幻。表明NtRHFl过表达的转基因烟草对干旱胁迫表现出较好的抗性。实施例6 转NtRHFl基因烟草植株对干旱胁迫处理后的生理指标变化1.实验方法将干旱处理14天后的转NtRHFl烟草株系(0E_4_和0E_5)和野生型(WT)幼苗，每个株系挑5株，分別称量鲜重，并计算平均值。对每个株系的5株剪取叶片，分別称重后，以未处理的株系叶片的含水量为对照，计算叶片相对含水量。2.实验结果图6A中显示经干旱处理14天后的转NtRHFl烟草株系(0E_4、0E_5) 和野生型(WT)烟草植株的平均鲜重。从图中可以看出，处理14天后，转NtRHFl烟草株系 (0E-4、0E-5)比野生型(WT)在生物量上分別提高96%，和125%，表明转NtRHFl基因植株对干旱胁迫有较高的抗性，生长影响较小。图6B中显示经干旱处理14天后的转NtRHFl烟草株系(0E_4、0E_5)和野生型(WT) 烟草植株叶片的相对含水量的变化。从图中可以看出转NtRHFl基因的烟草植株叶片含水量降低幅度较小，而野生型植株叶绿素含量降低的幅度较大。经处理后的野生型植株叶片含水量仅为46%，而2个转基因系叶片含水量在80%以上。这ー结果也与实施例5中观察到的植株生长表型一致。以上实验充分证明烟草中过量表达所述的NtRHFl基因能够显著提高植物的抗旱能力。
权利要求
1.烟草干旱响应基因NtRHFl，核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
2.根据权利要求1所述的烟草干旱响应基因NtRHFl的编码蛋白的应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，该蛋白过量表达能提高植物对干旱胁迫的抗性。
全文摘要
本发明公开了烟草干旱响应基因NtRHF1及其编码蛋白的应用；烟草干旱响应基因NtRHF1核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示；过量表达该基因能提高植物对干旱胁迫的适应性，NtRHF1在烟草抗旱领域具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/52GK102533802SQ20121002472
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月6日 优先权日2012年2月6日
发明者夏宗良, 张小全, 朱伟, 苏新宏 申请人:河南农业大学