专利名称：脑红蛋白在促进神经元突起生长中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及促进神经元突起生长技术，具体涉及脑红蛋白在促进神经元突起生长中的应用。
背景技术：
近年来，脑卒中、老年痴呆的发病率不断上升，因交通和建筑及工程等事故引发的脑/脊髓损伤也呈多发趋势。在脑卒中、老年痴呆、脑/脊髓损伤等疾病中，神经元突起的断损、缩短是导致脑功能障碍的重要原因。而促进神经元突起的生长、再生是治疗以上脑疾病的关键。寻找能够有效促进神经元突起生长的药物和方法，是当前医学和医药界面临的
重要课题。
发明内容
本发明的任务是提供一种能够促进神经元突起生长的物质。实现本发明的技术方案是本发明提供的能够促进神经元突起生长的物质是脑红蛋白(Neuroglobin,简称Ngb，译为脑红蛋白或神经红蛋白)。脑红蛋白Neuroglobin(简称Ngb,译为脑红蛋白或神经红蛋白)，为新近发现的脑组织、神经元特异表达的含血卟啉结构的血红蛋白家族成员。与已知的血红蛋白(hemoglobin)、肌红蛋白(myoglobin)的最大不同是脑红蛋白所含的血红素为六配位键，而非五配位键结构。Cytoglobin(简称Cygb,译为细胞红蛋白)是与脑红蛋白结构相近的另一新发现的血红蛋白家族成员，广泛表达于各种细胞和组织。脑红蛋白的生理功能还不清楚，迄今为止，国内外还未见有关脑红蛋白与神经突起生长的报道。本发明在原代培养的小鼠大脑皮层神经元中发现，随神经元突起的生长，脑红蛋白(Ngb)基因表达量显著增加，而细胞红蛋白(Cygb)的基因表达没有变化。在原代培养的小鼠大脑皮层神经元和小鼠神经瘤母细胞(neuroblastoma cell, N2a cell)中转染本课题组构建的脑红蛋白质粒，与对照组相比，脑红蛋白基因编码的蛋白表达量增加，神经元的突起明显增长。反之，采用RNA干扰技术抑制原代培养的小鼠大脑皮层神经元和小鼠神经瘤母细胞的内源性脑红蛋白蛋白的表达，与对照组相比，神经细胞的突起明显变短。本发明研究充分证明脑红蛋白具有促进神经元突起的生长作用。在小鼠神经瘤母细胞中转染脑红蛋白质粒两天后再予无氧无糖(体外模拟缺血)处理，与对照组相比，细胞的突起明显增长，证明增加脑红蛋白在缺血病理状态下仍具有促进神经元突起生长的作用。在脑卒中、老年痴呆、脑/脊髓损伤等疾病中，神经元突起的断损、缩短是脑功能障碍的重要原因，而促进神经元突起的生长或再生是治疗以上脑疾病的关键。因此，脑红蛋白促进神经元突起生长的这一新发现使得脑红蛋白基因及其编码的蛋白可用于制备治疗脑卒中、老年痴呆、脑/脊髓损伤等疾病药物。
实验资料实验目的I)明确脑红蛋白(neuroglobin, Ngb)与神经元突起生长是否相关；2)证明通过转染脑红蛋白基因，增加脑红蛋白的蛋白表达，可促进神经元突起的生长；3)证明通过RNA干扰技术抑制脑红蛋白基因和蛋白的表达，可抑制神经元突起的生长；4)证明在无氧无糖培养条件下，通过转染脑红蛋白基因，可促进神经细胞突起的生长。实验动物、实验细胞、试剂、实验步骤及实验结果与实施例中相应部分的内容一致，见实施例。本发明实验揭示I. Neuroglobin (脑红蛋白)mRNA表达量与神经元突起生长呈正相关；
2.转染脑红蛋白基因，提闻脑红蛋白的蛋白表达量，可以促进神经兀突起的生长和长度；3. RNA干扰可降低细胞内源性脑红蛋白的蛋白表达量，并阻断神经元突起的生长;4.转染脑红蛋白基因，可以促进受无氧无糖(即缺血)损伤的神经元的突起生长;5.利用基因或蛋白转染技术增加脑红蛋白的表达，对脑卒中、老年痴呆、脑外伤、脊髓外伤等疾病造成的神经突起断裂、回缩有潜在治疗作用。利用脑红蛋白(neuroglobin)促进神经元突起生长的功能,可将其用于治疗神经元突起损伤性疾病(包括脑卒中、老年痴呆、脑/脊髓损伤)的药物或直接作为治疗这类疾病的药物使用。具体可以利用基因或蛋白转染技术提高脑红蛋白表达，促进神经突起的生长或修复，达到治疗这类疾病的目的。
图I :脑红蛋白(Ngb)mRNA在原代培养的小鼠大脑皮层神经元中的表达图。a为反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)代表性结果；b为统计结果，证明脑红蛋白(Ngb)的相对表达水平(与内参肌动蛋白(β-actin)比值)随神经元生长时间显著上升，**表示与O天相比P <0.01 ;c为为统计结果,证明细胞红蛋白(Cygb)的相对表达水平(与内参β-actin比值)在神经元生长过程中无显著差异。图2 :小鼠脑红蛋白mRNA编码区全长序列克隆图。a为克隆犾得的小鼠脑红蛋白mRNA编码区(即开放读码框架)的全长核苷酸序列；其中第270个核苷酸为胸腺嘧啶(T，粗体)，在基因库小鼠脑红蛋白mRNA为胞嘧啶(C) ；b为所克隆的小鼠脑红蛋白mRNA编码的151个氨基酸序列，与蛋白数据库中的小鼠脑红蛋白(蛋白数据号NP_071859. 1，http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/NP_071859. I)的 151 个氨基酸序列完全一致。图 2 中用整个序列表不本研究使用系列和基因库系列，用区间编号范围表不共同序列。图3 :脑红蛋白(Ngb)真核表达载体的构建图。a为所构建的p-Ngb_GFP表达载体结构示意图，小鼠Ngb编码DNA序列被插入到p-EGFP-Nl载体的MCS (multiple cloningsite,多克隆位点)区；b为p-EGFP-Nl载体的MCS核苷酸序列图，脑红蛋白DNA序列连接到p-EGFP-Nl载体MCS区的Bgl II和Bam HI两个酶切位点之间；c为所构建的p_Ngb_GFP质粒测序结果，粗体下划线部分为Ngb序列，两端为载体序列。
图4:转染p-Ngb-GFP-Nl质粒增加细胞脑红蛋白的蛋白表达量结果图。a为小鼠神经瘤母细胞分别转染p-EGFP-Nl、p-Ngb-GFP-Nl、p-Cygb-GFP-Nl质粒2天后提取总蛋白、测定蛋白浓度；取2011 g总蛋白经SDS/PAGE胶电泳分离、转膜，用脑红蛋白(Ngb) —抗和相应的荧光二抗孵育，显色结果证明转染p-Ngb-GFP-Nl质粒表达Ngb-GFP蛋白；b为小鼠神经瘤母细胞转染p-Ngb-GFP-Nl质粒，一天后固定细胞，Ngb —抗和相应的TRITC-标记荧光二抗染色，结果证明转染P-Ngb-GFP-Nl使细胞内脑红蛋白的蛋白表达量增多(箭头指示细胞)；(显示转染P-EGFP-Nl质粒的细胞无脑红蛋白的高表达。所有图片放大倍数一致，标尺长度为10微米。图5 :过表达脑红蛋白促进神经元突起的生长结果图。a显示过表达脑红蛋白使神经元突起长度增加。b为转染细胞红蛋白质粒对照结果，显示神经元突起较短。c为转染绿色荧光蛋白质粒对照结果，显示神经元突起较短。本实验结果证明增加脑红蛋白表达具有促进神经元突起增长的作用。
图6 :转染p-Ngb-siRNA质粒抑制脑红蛋白表达结果图。其中a为合成的Ngb-siRNA的核苷酸结构和测序结果，粗体下划线部分为发挥RNA干扰作用的正向、反向序列山图为本研究所使用的RNA干扰序列与基因库序列比对结果脑红蛋白干扰序列与基因库小鼠脑红蛋白cDNA序列(BC024263. I)片段480-498 —致；c图为RT-PCR结果，证明转染p-Ngb-siRNA显著降低小鼠神经瘤母细胞内脑红蛋白基因的表达，Ngb质粒为阳性对照，N2a/Ngb-siRNA为转染p-Ngb-siRNA质粒的N2a细胞，N2a/vec为转染对照质粒的N2a细胞；内参为β-actin ;d图为Western blot结果,证明转染p-Ngb-siRNA显著降低N2a细胞内Ngb蛋白的表达。*，Ρ<0·05。图7 :siRNA干扰抑制脑红蛋白表达阻碍神经突起的生长结果图。在N2a神经瘤母细胞中分别转染脑红蛋白RNA干扰质粒(即Ngb-siRNA)和空载体(即vec)三天,换无血清培养基继续培养不同时间(0、3、6、12、24小时)，固定细胞，照相。结果显示转染Ngb-siRNA的细胞突起长度比vec组细胞及未转染的野生型细胞(wild type)明显变短。标尺,20微米。
具体实施例方式实施例I动物孕16天昆明小鼠(购自华中科技大学同济医学院实验动物中心)；细胞原代小鼠大脑皮层神经元，小鼠神经瘤母细胞(N2a细胞，50代以内用于实验)；试剂过表达质粒p-Ngb-EGFP-Nl、p-EGFP-Nl、p-Cygb-EGFP-Nl 本课题组构建；RNA 干扰质粒Ngb-siRNA、N-control由本专利申请发明人应用计算机软件设计干扰序列,上海英潍捷基公司合成，本课题组构建；DMEM，0ΡΤΙ-ΜΕΜ，胎牛血清，Neurobasal (Gibco公司，美国)；限制性内切酶EcoR I, Hind III、BamH I和Sal I以及PCR试剂(TAKARA公司，中国)；Rnasin，oligo (dT) 15 Primer^PM-MLV reverse transcriptase (Promega 公司，美国)；引物(上海生工生物工程有限公司)；siRNA载体质粒pGenesil-Ι (武汉晶赛生物技术有限公司)；琼脂糖凝胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒(0MEGA公司，美国)；质粒大提试剂盒(QIAGEN 公司，美国)；Lipofectamine 2000 (Invitrogen 公司，美国)；Mouse NeuronNucleofector Kit (Amaxa 公司，德国)；neuroglobin 抗体(Santa Cruz 公司，美国)；核苷酸点突变试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)；仪器二氧化碳培养箱(Forma,美国)；倒置突光显微镜(Olympus 1X70,日本)；凝胶电泳分析系统(上海培新科技有限公司)；图像分析系统(Image pro-plus Kodak,美国)；厌氧舱(上海新苗科技有限公司)；多功能酶标仪SYNERGY2 (Bio-tech，美国)；紫外分光光度计(Pharmacia Biotech，美国)，共聚焦显微镜LSM 510(ZEISS，德国)。实验步骤I.脑红蛋白表达水平与神经元突起生长的相关性取孕16天小鼠胚胎，分离大脑皮层神经元，接种到35-mm细胞培养皿正常培养(细胞培养方法参见申请人已发表文章Chen et al.，J Neurosci Res 79 :114_8，2005)，分别提取培养 0、2、4、6、8 天的神经元总RNA，取RNA 2微克，随机引物(O. 5微克/微升)I微升，用无RNA酶水补足至12微升。在70°C 反应5分钟，再在4°C反应3分钟。依次加入5Xbuffer 4微升，RNasin (40单位/微升)I微升，dNTPs (10微摩尔)2微升；混匀后置室温5分钟。加逆转录酶M-MLV I微升后总体积为20微升。置室温10分钟后，在42°C反应60分钟，再70°C反应10分钟，合成cDNA，采用上海生工合成特异性小鼠脑红蛋白的PCR引物(正向引物5’ -catcgggcagtgggagtgaggc-3 ；反向引物5’-tccaggcggtccttgtagctg-3’),按PCR标准反应体系以94°C反应2分钟，94°C变性45秒，55°C退火30秒，72°C延伸50秒，25个循环，最后72°C延伸5分钟，同时扩增脑红蛋白和内参β-actin (肌动蛋白)，将PCR产物电泳进行定量分析，以同一样本的脑红蛋白/肌动蛋白比值代表脑红蛋白的相对表达水平，实验重复3次，SPSS统计软件分析脑红蛋白基因在神经元突起生长过程中的表达差异，RT-PCR方法参见Chen et al.，J NeurosciRes 79 :114-8,2005ο2.脑红蛋白(Ngb)促进小鼠神经瘤母细胞突起生长的作用小鼠神经瘤母细胞按4Χ IO5个细胞传35-mm细胞培养皿，正常培养约24小时至细胞有80-90 %融合时，将培养液替换成Iml OPTI-M继续培养I小时。将I. 5微升lipofectamine2000用500微升OPTI-M稀释并置室温5分钟，即为溶液A ;将质粒p-Ngb-EGFP-Nl或p-EGFP-Nl分别用500微升OPTI-M稀释，即为溶液B。将溶液B加到溶液A，混匀并置室温30分钟，即为转染缓冲液溶液C。用溶液C替换上述培养细胞的0ΡΤΙ-Μ，继续培养6小时后换成正常培养基(小鼠神经瘤母细胞培养及转染方法参见申请人已发表文章Li et al. , NeurochemRes32(8) :1375-80. 2007)。继续培养24小时后，I)提取总蛋白，Western blot方法检测转染细胞Ngb-EGFP蛋白的表达量；(Western blot方法参见申请人已发表文章Ye etal. , Pharmacologica Sinica 30:913-8,2009)。2)固定细胞，免疫突光染色检测脑红蛋白表达；(免疫荧光染色方法参见申请人已发表文章Li et al.，Neurochem Res 32 1375-80.2007)。3)换无血清培养液继续培养，在不同时间点固定细胞，显微镜照相，Image-Pro Plus 6. O软件测量50个以上转染细胞的突起长度；独立重复实验三次，SPSS统计软件分析数据。3.脑红蛋白(Ngb)促进原代培养的神经元突起生长的作用取孕16天小鼠胚胎，分离大脑皮层神经兀，按Mouse Neuron Nucleofector Kit说明书分别转染p-Ngb-EGFP-Nl或p-EGFP-Nl或p-Cygb-EGFP-Nl质粒，转染神经元并接种到35_mm细胞培养皿，正常培养3天，不同时间点固定细胞，显微镜照相，使用Image-Pro Plus 6. O软件测量50个以上神经元的突起长度，重复独立实验至少3次，SPSS统计软件分析数据。4.脑红蛋白(Ngb) siRNA干扰抑制小鼠神经瘤母细胞突起生长的作用小鼠神经瘤母细胞按4X IO5个/毫升的密度接种到35-mm细胞培养皿，正常培养24小时，按步骤2的方法分别转染Ngb-siRNA或p-Gensil空载体6小时，换新鲜正常培养液继续培养72小时，按4X IO5个/ml传35-mm培养皿，继续培养24小时，I)PCR或Western blot分别检测脑红蛋白基因和蛋白的表达；2)换无血清培养液继续培养不同时间，固定细胞，显微镜照相，使用Image-Pro Plus 6. O软件测量50个以上神经元的突起长度，重复实验3次，SPSS统计软件分析数据。5.脑红蛋白(Ngb) siRNA干扰抑制原代培养神经元细胞突起生长的作用取孕16天小鼠胚胎，分离大脑皮层神经元，按Mouse Neuron Nucleofector Kit说明书分别转染
p-Ngb-siRNA-GensiI 或 p-N-control-Gensil 或 p-Cygb-siRNA-Gensi 质粒，转染神经兀并接种到35-_细胞培养皿，正常培养5天，不同时间点固定细胞，显微镜照相，测量转染神经元的突起长度，重复实验至少3次，SPSS统计软件分析数据。6.脑红蛋白(Ngb)促进无氧无糖条件下N2a细胞突起生长的作用小鼠神经瘤母细胞按4X IO5个细胞传35-mm细胞培养皿，正常培养约24小时至细胞有80-90%融合时，采用Iipofectamine 2000转染方法(同前)转染p-Ngb-EGFP-Nl或p-EGFP-Nl质粒6小时。继续正常培养24小时后，换无糖无血清培养液在厌氧舱37°C无氧条件下继续培养0、3、6、9小时(无糖无氧培养具体方法参见申请人已发表论文Chen et al，Glia 42:315-324，2003 ；Chen et al, J Cereb Blood Flow Metab 25 :338_347，2005)，固定细胞，显微镜照相，Image-Pro Plus 6. O软件测量50个以上转染细胞的突起长度；独立重复实验三次，SPSS统计软件分析数据。实验结果I.在原代培养的小鼠大脑皮层神经元，随时间的延长神经元突起逐步增长，用反转录(RT)-PCR方法证明脑红蛋白mRNA表达量也随神经元突起生长时程显著增加，见图la，b,而细胞红蛋白(Cygb)mRNA表达不变,见图Ic ;表明神经元突起的生长与脑红蛋白的表达正相关。2.采用RT-PCR方法从小鼠脑组织提取的总RNA中克隆出编码小鼠脑红蛋白的cDNA全长序列(456个核苷酸),经上海英潍捷基(Invitrogen)公司测序，图2a结果显示所克隆的编码小鼠脑红蛋白的cDNA全长序列；将测序结果通过http://blast. ncbi. nlm.nih. gov网页的neucleotide BLAST程序与基因库mRNA序列相比对,结果显示所克隆的小鼠脑红蛋白cDNA序列全长中仅第270个核苷酸不同(C — T)，见图2a中粗体；blastx程序显示所克隆的小鼠脑红蛋白cDNA序列编码的氨基酸序列，见图2b，与蛋白数据库中小鼠脑红蛋白序列完全一致(蛋白数据号NP_071859. I, http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/NP_071859. I)。小鼠脑红蛋白基因编码的脑红蛋白蛋白全长与人源脑红蛋白基因编码的蛋白有94%的同源性。3.用Bgl II和Bam HI酶将编码脑红蛋白的DNA片段双酶切，与相同处理的p-EGFP-Nl载体经T4连接酶相连接，构建成表达Ngb-GFP融合蛋白的p-Ngb_GFP质粒，结构见图3a ;图3b图显示脑红蛋白基因插入p-EGFP-Nl载体MCS区的核苷酸序列；经上海英潍捷基公司测序显示所插入的脑红蛋白序列正确，见图3c粗体部分，脑红蛋白终止密码序列被去除以表达突光融合蛋白。绿色突光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作为指示蛋白，在荧光显微镜下可以直接观察到。同样方法制备了 P-Cygb-GFP表达质粒。4.将p-Ngb-GFP、p-Cygb-GFP、p-EGFP-Nl质粒分别转染小鼠神经瘤母细胞(N2a)，Western blot方法证明只有转染p-Ngb-GFP质粒的细胞表达大量的Ngb-GFP蛋白，该蛋白可被脑红蛋白(Ngb)抗体特异识别，见图4a ;细胞免疫荧光方法也证明转染p-Ngb-GFP质粒的细胞表达大量的Ngb-GFP,该蛋白可被Ngb抗体识别，见图4b (箭头指示细胞)，而转染p-EGFP-Nl质粒的细胞表达大量的绿色荧光蛋白(GFP)，该蛋白不被脑红蛋白抗体识别，见图4c。这些结果均证明转染p-Ngb-GFP质粒可以提高细胞脑红蛋白的量。5.小鼠神经瘤母细胞分别转染p-Ngb-GFP、p-Cygb-GFP、p-EGFP-Nl质粒，换无血清培养液继续培养3、6、9、18小时，测量细胞最长突起长度(> 50个细胞)，计算平均长度，统计分析，结果证明过表达脑红蛋白明显促进小鼠神经瘤母细胞突起的长度(表I)。
表I :过表达脑红蛋白增加无血清培养基处理诱导的小鼠神经瘤母细胞突起长度(X +5, η = 50-150)
时间(小时)I GFP组(微米)Cygb组(微米) Ngb组(微米)
~O11.2 + 6. I14. 7 + 3. I24.3+12.6*
316.8 + 5. 317. 5 + 4. 726.8+14. 3*
~620.6 + 8.922.2 + 6.832.3+16. Γ*
~921. 5 + 7. 724.0+10. I41.7+18.8***
~1825. 1+8.626.6 + 9.939.6 + 16. 5****, P < O. 05 与 GFP 和 Cygb 组比较;**，P < O. 01 与 GFP 和 Cygb 组比较;林*，P< O. 001与GFP和Cygb组比较·6.将质粒p-Ngb-GFP-Nl、p-Cygb-GFP-Nl、p-EGFP-Nl分别转染到原代培养的神经元，培养3天，转染p-Ngb-GFP-Nl质粒的神经元其突起明显比p-Cygb-GFP-Nl或p-EGFP-Nl对照细胞的增长，见图5和表2。表2:过表达脑红蛋白促进原代培养小鼠大脑皮层神经元突起长度±s，n =30-50)
GFP组(微米)Cygb组(微米) Ngb组(微米)~
突起平均长度(微米) 12. 2 + 5. 611. 8 + 7. 236. 8 + 9. 8******，P < O. 001 与 GFP 和 Cygb 组比较7.采用Invitrogen公司设计软件针对小鼠脑红蛋白mRNA编码区480-498 nt段(gb IBC024263. I)设计RNA干扰序列，由上海英潍捷基公司合成表达短链发卡RNA的DNA片段，序列见图6a。将该DNA片段与siRNA表达载体p-Gensil按说明书构建脑红蛋白的RNA干扰真核表达质粒(p-Ngb-siRNA),测序结果经neucleotide BLAST证实与基因库脑红蛋白序列100%—致,见图6b。将p-Ngb-siRNA、p-Gensil (vec,空载体)分别转入小鼠神经瘤母细胞，RT-PCR(见图6c)、Western blot,见图6d,方法证明p-Ngb-siRNA成功抑制细胞内源性脑红蛋白基因(见图6c)和蛋白(见图6d)的表达。将转染细胞予撤血清处理(无血清培养)，在不同时间点测量突起长度，结果证明，转染p-Ngb-siRNA的小鼠神经瘤母细胞突起较vec组、未转染组(wild type)明显变短,见图7和表3。表3 :转染p-Ngb-siRNA质粒抑制内源性脑红蛋白表达换无血清处理诱导的小鼠神经瘤母细胞突起生长( ± S·，η = 100)
权利要求
1.一种表达突变脑红蛋白的基因，其特征在于脑红蛋白基因编码区第270个核苷酸由胞嘧啶突变为胸腺嘧啶。
2.一种表达载体，其特征在于，它包含权利要求I所述的表达突变脑红蛋白的基因。
全文摘要
本发明在原代培养的小鼠大脑皮层神经元中发现，随神经元突起的生长，脑红蛋白基因表达量显著增加。在原代培养的小鼠大脑皮层神经元以及小鼠神经瘤母细胞中转染本发明构建的脑红蛋白质粒，与对照组相比，脑红蛋白基因编码的蛋白表达增加，神经元的突起明显增长，证明增加脑红蛋白具有促进神经元突起的生长作用。在原代培养的小鼠大脑皮层神经元以及小鼠神经瘤母细胞中转染本发明构建的脑红蛋白RNA干扰质粒，与对照组相比，内源性脑红蛋白表达减少，神经细胞突起明显变短，证明内源性脑红蛋白具有促进神经元突起生长的生理作用。在小鼠神经瘤母细胞中转染脑红蛋白质粒后再予无氧无糖处理，与对照组相比，神经细胞的突起明显增长，证明增加脑红蛋白具有促进受损神经元突起的生长作用。
文档编号C12N15/85GK102816765SQ20121002444
公开日2012年12月12日 申请日期2010年8月20日 优先权日2009年12月10日
发明者陈晓钎, 余上斌, 赖晓晶, 李莉, 罗振钊, 刘倩蓉 申请人:华中科技大学