蛋白错误折叠和神经保护的调节剂及使用方法

专利名称：：蛋白错误折叠和神经保护的调节剂及使用方法
技术领域：
：本发明涉及使用多核苷酸分子以及由此分子编码的蛋白的新方法，其用于诊断和治疗以神经元功能障碍、神经变性或蛋白错误折叠及随后的聚集为特征的神经病症的方法中。具体而言，本文描述了影响易聚集蛋白的错误折叠和随后的聚集的多个基因，并表明这些基因可用于与蛋白聚集相关的神经疾病的诊断和治疗。本文描述的基因在RNAi筛选被敲减时导致蛋白错误折叠和聚集的增加，特别是a-突触核蛋白的错误折叠和聚集的增加。对与此过程相关的基因的了解为开发诊断筛选方法、突变分析以及用于开发新的治疗性和神经保护性化合物的药物设计信息提供有力的手段。这些方法包括调节多个蛋白的活性以减少或预防蛋白错误折叠，或者提供神经保护。所述蛋白包括SURF蛋白家族、SEC22蛋白家族和酰基辅酶A氧化酶。因此，本发明的目的是提供用于检测和治疗与蛋白错误折叠和聚集相关的神经病症的方法和组合物。本发明的另一个目的是提供用于检测和治疗特别是帕金森病或由a-突触核蛋白错误折叠和聚集造成的病症的方法和组合物。本发明的另一个目的是提供用于检测某人是否患有神经变性病症的方法，其中所述病症的特征是与蛋白错误折叠和聚集相关的基因表达水平的改变或者该基因的一个或多个突变。本发明的另一个目的是提供用于检测其他神经元基因突变或多态性的方法，这些基因参与特定表型的产生，该特定表型在哺乳动物中引起与所述基因的神经解剖学表达相一致的明显临床症状。本发明的另一个目的是提供与人体内蛋白错误折叠和聚集相关的神经病症的诊断方法。优选地，本文提供用于诊断人体内是否存在所述病症方法；预测发展为所述病症的可能性或发展所述病症的易感性的方法。本发明的另一个目的是提供用于鉴定神经元基因突变或多态性的方法，其中所述神经元基因与导致神经元疾病易感性提高的蛋白聚集相关。本发明的另一个目的是提供通过比较化合物存在时蛋白错误折叠和聚集的数量与化合物不存在时蛋白错误折叠和聚集的数量，来筛选减少、抑制、改善或预防蛋白错误折叠和聚集的化合物的方法。本发明的另一个目的是提供通过比较化合物存在时神经变性的数量与化合物不存在时神经变性的数量，来筛选减少、抑制、改善或预防神经变性的化合物的方法。本发明的另一个目的是提供用于设计和开发治疗性化合物的方法，该化合物是为对促进蛋白聚集的环境易感的神经元提供神经保护的化合物，或者阻止或缓解蛋白错误折叠和聚集的化合物，或者溶解蛋白聚集体的化合物。5本发明的另一个目的是提供用于减少、终止、减轻、改善或预防由于蛋白聚集而造成的细胞功能紊乱的方法。本发明的另一个目的是提供含有效量组合物的药物配方，以降低需要治疗的动物中的蛋白错误折叠和聚集，或提供神经保护。本发明还涉及使用多核苷酸分子及其编码的多肽为对促进蛋白错误折叠和聚集的环境易感的神经元提供神经保护的方法。本发明的另一个目的是提供用于治疗与蛋白错误折叠和聚集相关的神经疾病的药物的制备方法。本发明的另一个目的是提供用于筛选治疗神经病症新疗法的转基因动物。本发明的另一个目的是提供用于诊断在人中是否存在神经变性病症的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测来自此人的样品中的基因突变的一种或多种试剂。在阅读以下具体实施方式和所附权利要求书后，可更清晰地了解本发明的这些及其他目的、特点和优点。图1提供显示a-突触核蛋白诱导的变性(其随动物衰老而发生)后，秀丽隐杆线虫(C.elegans)SEC22蛋白表达对多巴胺神经元的神经保护作用的图。图2提供本文所描述的核苷酸和蛋白序列的列表。发明详述通过参照下文所包括的对具体实施方式的详细描述，可以更容易地理解本发明。尽管已经通过参考某些实施方式的具体细节对本发明进行了描述，但并不意味着这些细节应被视为对本发明范围的限制。本文提到的参考文献的内容通过引用全文并入本文。神经元尤其易受突变或错误折叠蛋白的毒性作用的攻击。基于对处理具有潜在毒性的不良蛋白的正常细胞机制的理解，本发明提供了用于消除错误折叠或聚集蛋白对神经元的作用的独特方法和组合物。突变或错误折叠蛋白不仅可以导致神经元的损伤、变性或死亡，而且还可造成神经元的功能紊乱，此时神经元存活，但细胞生理过程受损从而导致出现神经疾病的临床症状。除非文中另有清楚的说明，否则在本说明书和权利要求书中使用的单数形式〃一个〃、〃一种〃、〃这〃、〃该〃等包括复数的所指事物。应理解，尽管以下讨论特指人类患者，但本文讲授的内容也可用于表达表1中蛋白的任何动物。本文定义的术语"哺乳动物"是指任何脊椎动物，包括单孔目动物和有袋目动物。哺乳动物种的实例包括灵长类(如人、猴子、黑猩猩和狒狒)，啮齿类(如大鼠、小鼠、豚鼠和仓鼠)以及反刍动物(如牛和马)。在本发明范围内的"治疗"包括减少、抑制、改善或预防与如神经变性疾病的异常相关的症状或分子事件，其中所述神经变性疾病包括但不局限于帕金森病。优选地，可治疗蛋白聚集、由蛋白错误折叠和聚集造成的细胞功能失常，和与蛋白聚集相关的疾病。"神经病症"包括以神经元变性和/或损失为特征的临床病症。这些病症包括肌萎縮侧索硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、朊病毒病、额颞痴呆、多聚谷氨酰胺扩展病、脊髓小脑性共济失调、脊髓和延髓性肌萎縮、海绵状脑病、tau蛋白病、亨廷顿病和张力失常等。6本文所用术语"线虫(worm)"是指用于研究本发明蛋白聚集的模型系统，此模型生物源自线虫动物门。其含义包括特定的线虫动物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans或C.elegans)。正确折叠需要蛋白质在可能但不正确的构象群中选择一个具体结构。多肽没有选择其正确结构是对细胞功能和存活力的主要威胁。错误折叠的蛋白可能本身具有毒性，并且形成可能导致非常严重的后果(甚至致死)的聚集体。因此，已进化出精细的系统来保护细胞免受错误折叠蛋白的有害影响。本发明范围内的"蛋白"包括全长蛋白、同源物、糖基化改变的蛋白、蛋白片段、剪接变体、功能等同的变体、基本保留了与野生型蛋白相同的功能的突变体及其保守取代蛋白。本发明范围内的"蛋白聚集"包括至少两个多肽以某种方式彼此接触从而导致其中任何一个多肽处于去溶剂化(de-solvation)状态的现象。这也可以包括多肽天然功能或活性的丢失。本发明范围内的"与蛋白聚集相关的疾病"包括任何疾病、病症和/或痛苦，与蛋白聚集相关的疾病包括神经变性病症。在本发明还包括包含定义、方法和实施基本技术的手段的标准分子生物学教材以作为参考。参见，例如Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual，ThirdEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(2001);CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausebeletal(eds.)，JohnWiley&Sons,NewYork(2001)及其弓l用的多篇参考文献。本发明提供了编码与蛋白错误折叠/聚集和神经保护相关的蛋白的多个多核苷酸。某些候选基因编码功能或活性至今未知的假定蛋白。然而，本发明确定这些蛋白的至少一个共同功能或活性是防止蛋白错误折叠和聚集。在秀丽隐杆线虫模型中使用RNAi降低这些蛋白的活性导致蛋白的错误折叠和a-突触核蛋白的聚集。导致这些蛋白及其编码多核苷酸的表达和/或活性降低的改变也将导致蛋白错误折叠和聚集。这些蛋白中的某些还为如含多巴胺神经元的神经元提供神经保护。因此，本发明提供了在神经变性疾病中进行干预治疗的新方法，所述方法包括将本文描述的多核苷酸用于对含多巴胺神经元的神经保护；这样本发明为帕金森病治疗的研发提供了另外一条途径。可以使用编码为多巴胺能神经元提供神经保护性能的蛋白的基因来开发基因和蛋白疗法、抗体疗法以及设计和筛选新药物，从而为多巴胺神经元提供神经保护。相似地，这些分子的改变会使神经元在不利的条件下易于受损和死亡。由这些基因编码的蛋白包括SURF蛋白家族、SEC22蛋白家族和酰基辅酶A氧化酶。表I中提供这些蛋白的列表。表I:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>sft-4基因编码假定的运输蛋白ERV29，其是与小鼠surf-4基因高度保守的SURF家族成员，并且保守区(conservation)包括所编码的参与小鼠蛋白的内质网定位的双赖氨酸基序。通过跨膜域锚定的SEC22在内质网和高尔基体顺面之间发挥正向转运(anterograde)禾口反向转运(retrograde)的功會g。酰基辅酶A氧化酶是过氧物酶体13_氧化途径中的第一个酶。本发明全文中"分离的"或"纯化的"是指从其自然环境中分离出来，并且基本不含有其他污染蛋白、多核苷酸和/或在细胞提取物中常见的其他生物物质。本发明全文中的"多核苷酸"通常是指多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA或者是修饰的RNA或DNA。多核苷酸分子可包括编码蛋白的基因和RNA或者是非编码的RNA或DNA。表I中所示的分子列出的是秀丽隐杆线虫开放阅读框(0RF)标识的名称，但本发明并不局限于秀丽隐杆线虫的序列。表I所列分子的其他物种同源物也适用于本发明，尤其是人同源物。本文提供了秀丽隐杆线虫及相应的人基因和蛋白的序列。表II中提供了相应的秀丽隐杆线虫核苷酸和蛋白序列以及人核苷酸和蛋白序列。表II:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本领域技术人员将意识到除人以外的生物也包含此类基因(例如真核生物，更具体地，哺乳动物(优选大猩猩、恒河猴和黑猩猩)、啮齿动物、线虫(优选秀丽隐杆线虫)、昆虫(优选，黑腹果蝇(D.melanogaster))、鸟类、鱼类、酵母和植物)。本发明旨在包括但不局限于从上述生物中分离出的编码表1所列蛋白的核酸分子。这些基因中许多都具有显著的进化保守度，这证明蛋白在物种之间的高度同源性。例如，人酰基辅酶A氧化酶(SEQIDN0:11和SEQIDNO:12)与秀丽隐杆线虫F55A4.1(SEQIDNO:9禾口SEQIDNO:10)同源，并且与黑腹果蝇(SEQIDNO:13禾PSEQIDN0:14)、斑马鱼(Daniorerio，SEQIDN0:15禾PSEQIDN0:16)、牛(SEQIDNO:17禾PSEQIDNO:18)、小鼠(SEQIDNO:19禾PSEQIDNO:20)和大鼠(SEQIDNO:21禾PSEQIDNO:22)的基因/蛋白同源。所有这些序列的e值都基本为O，这证明此基因在进化中高度保守。考虑到在结构上的高度同源性，这些序列以适当水平表达时应该具有减少神经变性、蛋白错误折叠和聚集的相同功能。本发明的分离核酸分子还包括化学合成的核酸分子。例如，可以设计带有编码基因表达产物的核苷酸序列的核酸分子，并且，如果需要，可将其分为适当的较小片段。然后，可以合成与此核酸分子或每一个分开的片段对应的寡聚物。此类合成寡核苷酸可以合成制备(Matteuccietal.，1981，JAm.Chem.Soc.103:3185-3191)，或者通过使用自动DNA合成仪制备。寡核苷酸可以通过合成或者克隆得到。如果需要，可以使用T4多核苷酸激酶将寡核苷酸5'-端磷酸化。对寡核苷酸5'-端使用激酶(kinasing)提供了通过例如向5'-端加入放射性同位素(通常是"P)来标记特定寡核苷酸的途径。随后，寡核苷酸可以退火并通过T4连接酶等进行连接。此外，利用来自表II中序列的引物，通过多聚酶链式反应(PCR)制备的DNA序列对本发明是有用的。此类寡核苷酸通常具有至少15个核苷酸的长度。本发明还涉及以相应方式来自表I中所列蛋白的氨基酸序列及其应用。根据本说明书和权利要求书的目的，下文所用的与核酸序列相关的术语"基本由……组成"是指与第三碱基简并性相关的核苷酸取代。本领域技术人员可知，由于第三碱基的简并性，几乎每一个氨基酸在核酸编码序列中都可以用不止一个三联体密码子表示。此外，少量碱基对改变可以导致所编码氨基酸序列的变异(保守取代)，而预期不会使基因产物的生物学活性产生实质改变。因此，编码本文公开的蛋白或肽的核酸序列在序列上可以进行轻微修饰(例如取代三联体密码子中的核苷酸)，但仍编码其具有相同氨基酸序列的相应基因产物。本文所用多核苷酸序列中的"改变"是指序列表达水平的差异，例如通过敲除或敲减基因导致的序列表达水平的升高或降低。也包括影响野生型蛋白所提供的蛋白正确折叠和神经保护的序列本身的差异。此类改变包括提高或降低多核苷酸分子或蛋白的表达、突变、截短和缺失。因此，与编码SURF蛋白家族、SEC22蛋白家族和酰基辅酶A氧化酶或其片段的多核苷酸分子杂交的DNA序列也是本发明的组成部分。本领域技术人员可以找到通过由专家发现的杂交方式鉴定DNA序列的指导，例如在〃TheDIGSystemUsersGuideforFilterHybridization"fromBoehringerMannheimGmbH(Ma皿heim，Germany,1993)手册中禾口在Liebletal.(InternationalJournalofSystematicBacteriology41:255-260(1991))中。杂交在严谨条件下进行，也就是说，只有探针和靶序列(即用探针处理的寡核苷酸)至少70%相同时才能形成杂合体。已知可以通过改变缓冲液组成、温度和盐浓度来影响和确定杂交(包括洗涤步骤)的严谨性。与洗涤步骤相比，优选在相对较低的严谨性下进行杂交反应(HybaidHybridisationGuide,HybaidLimited,Teddington，UK，1996)。例如，可将约5(TC-68°〇的5又SSC缓冲液用于杂交反应。这样探针也可以杂交与探针序列的同一性小于70%的多核苷酸。此类杂合体稳定性较差，并通过严谨条件下洗涤而除去。上述杂交可以通过下述条件来实现，例如通过将盐浓度降低到2xSSC和任选地随后降低至0.5xSSC(TheDIGSystemUser'sGuideforFilterHybridisation,BoehringerMannheim,Mannheim,Germany,1995)，同时益度确定为约50°C_68°C。也可任选地将盐浓度降低到0.lxSSC。可通过以每步约l-2t:的步幅将杂交温度从5(TC逐步升高到68°C，从而分离与所用探针序列具有如至少70%，或至少80%，或至少90%-95%同一性的多核苷酸片段。关于杂交的其他说明可以以所谓试剂盒的形式从市场获得(例如来自德国曼海姆RocheDiagnosticsGmbH的DIGEasyHyb，商品号1603558)。"突变"是遗传物质的任何可检测到的变化，其可以传递到子细胞中并且甚至可能转递到继代，从而产生突变细胞或突变个体。突变可以是影响到一个或多个脱氧核糖核苷酸的化学或物理组成、突变性、复制、表型功能或者重组中任何一个(或其组合)的可检测到的非天然变化；核苷酸可以被添加、缺失、取代，反转，或在反转或非反转的情况下转移到新位置上。本文所用术语"突变"还涉及在编码本文所述蛋白之一的核酸序列上的任何修饰。例如，突变可以是点突变或者是添加、缺失、插入和/或取代一个或多个核苷酸，或者是以上的组合。突变可以是错义或移码突变。修饰可以是，例如保守的或者不保守的，天然的或者非天然的修饰。进一步可知，在蛋白N和/或C末端的变化不会产生实质性的损坏，甚至可以稳定其功能。本文中的信息可以由专家发现，其中可在Ben-Bassatetal.(JournalofBacteriology169:751-757(1987))、0'Reganetal.(Gene77:237-251(1989))、Sahin-Tothetal.(ProteinSciences3:240-247(1994))、Hochulietal.(BioTechnology6:132H325(函))以及已知的遗传和分子生物学教材中发现。可以通过与表II所列多核苷酸分子或其片段相应的多核苷酸分子的杂交来分离突变。本发明还包括使用多种多肽分子，例如涉及防止蛋白错误折叠的蛋白的方法及其使用方法。蛋白在表I中描述，氨基酸序列在表II中列出。优选将这些蛋白纯化或分离成不含污染蛋白、多核苷酸或其他污染化合物的基本纯净状态。本文所用的蛋白中的"改变"是指蛋白在辅助蛋白正确折叠和提供如野生型蛋白所提供的神经保护能力方面的变化。此类改变可包括，例如蛋白表达的变化、蛋白序列的突变和可选择的剪接形式，不过也包括改变蛋白活性的其他改变。在另一个实施方式中，多肽具有表II所述的氨基酸序列或其突变体或种变体；或与其具有至少70%同一性，进一步至少80%的同一性或更进一步至少90%同一性(优选至少90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性或至少95%、96%、97%、98%或99%的相似性)，或至少6个连续氨基酸(优选其至少10、15、20、25或50个连续氨基酸)。可以以糖基化或非糖基化的形式提供本发明的蛋白。糖基化蛋白质或其片段的制备是本领域内已知的，通常包括在真核细胞中表达编码该肽的重组DNA。同样，本领域公知在原核(例如细菌)细胞中表达编码该肽的重组DNA可获得非糖基化的肽。这些和其他改变糖蛋白的糖部分的方法可见于EssentialsofGlycobiology(1999)，EditedByAjitVarki，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork，其内容通过引用并入本文。本发明还涉及基本由表I所列蛋白质的多肽序列组成的多肽分子。本发明的蛋白质可以包含一个或多个受保护的氨基酸残基。受保护的氨基酸是通过已知方法用一个或多个保护集团保护其一个或多个官能团的氨基酸，并且可商购多种受保护的氨基酸。蛋白质或其片段也可以包含一个或多个修饰氨基酸。此类氨基酸的列表可参见美国专利公开第2003/0235823号，其全文通过引用并入本文。虽然导入氨基酸序列变异的位点是预设的，但突变本身并不需要预设。例如，为了在期望活性方面对特定多肽的性能进行优化，可以在多肽的靶密码子或区域进行随机突变，并筛选具有最佳期望活性的表达变体。在序列已知的DNA的预设位点进行取代突变的技术是已知的，例如定点突变。氨基酸序列缺失通常在1-30个残基，更优选1-10个残基的范围内。氨基酸序列插入包括在氨基和/或羧基端融合长度从一个残基到基本不受限制的多肽，还包括在序列内插入一个或多个氨基酸残基。序列内插入(即，在完整蛋白序列内的插入)通常在约i-io个残基，更优选1-5个残疾的范围内。第三组变体是至少一个氨基酸残基，优选只有一个残基被去除并在其位置插入不同残基的那些多肽分子。功能或免疫特性的实质性变化是通过选择保守性较低的取代来实现的，即选择在维持其对以下方面的作用区别更为显著的残基a)在取代区域内多肽骨架的结构，如片层构象或螺旋构象，b)靶点分子的电荷或疏水性，或c)侧链体积(bulk)。保守取代是取代氨基酸(天然存在或修饰的)与将被取代的氨基酸在结构上相关，即与将被取代的氨基酸具有几乎相同的大小和带电性质的取代。因此，取代氨基酸的侧链中可具有与原氨基酸相同或相似的官能团。提供功能相似的氨基酸的保守取代表在本领域内是已知的。下述六个组，每组都包含可互相保守取代的氨基酸1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T);2)天门冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天门冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V);禾口6)苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。进一步的取代可以包括a)甘氨酸和/或脯氨酸被另一个氨基酸取代，或者被缺失或插入；b)用亲水残基(例如丝氨酰或苏氨酰)取代疏水残基(例如亮氨酰、异亮氨酰、苯基丙氨酰、缬氨酰或丙氨酰)；c)用半胱氨酸残基取代其他任何残基；d)用具有带正电侧链的残基(例如赖氨酰、精氨酰或组氨酰)取代具有带负电的残基(例如谷氨酰或天门冬氨酰)；或e)用具有大侧链的残基(例如苯基丙氨酸)取代不具有此类侧链的残基(例如甘氨酸)。—些缺失、插入和取代预期不对蛋白质的性质产生根本的变化。本领域技术人员理解，通常可以使用动物模型(如本文公开的动物模型)以及化学和体内筛选试验来评估取代的效果。在一个实施方式中，本发明涉及使用表I中所述蛋白的表位以引发抗体响应的方法。选择抗原表位片段的方法在本领域是已知的(Sutcliffeetal.，1983，Science.219:660-666)。本发明的带有抗原表位的肽和多肽可用于产生特异识别此多肽的免疫应答。本发明的带有抗原表位的肽和多肽包含可以通过DNA突变制备的表I中所列蛋白的氨基酸序列变体蛋白的至少4个氨基酸(优选6、7、9、10、12、15或20个氨基酸)。这样的变体包括，例如对本文所述氨基酸序列内的残基进行缺失、插入或取代。只要最终结构具有期望的活性，还可以通过缺失、插入和取代的任意组合来获取最终的构建体。在一个实施方式中，使用本文所述蛋白制备与此蛋白的野生型或改变型对应的多肽序列的特异性抗体。抗体也可用来作为探针或用于预防性或治疗性处理。本发明提供了参与错误折叠和蛋白聚集的蛋白的筛选方法。例如表I中所列的序列是从使用过表达人a-突触核蛋白GFP融合蛋白的转基因线虫系的RNAi文库筛选中得到的。也可以以融合蛋白的形式与a-突触核蛋白一起表达如GFP、RFP、BFP、YFP和荧光素酶的其他报告分子。可以以此方式过表达其他易聚集蛋白，从而研究其他神经疾病的蛋白错误折叠和聚集，例如但不局限于阿尔茨海默病的tau蛋白和P-淀粉样蛋白、亨廷顿病(或多聚谷氨酰胺扩展病)中的突变亨廷顿蛋白，肌萎縮侧索硬化中的S0D1蛋白和神经丝，以及脊髓性和延髓性肌萎縮中的突变雄性激素受体。特别是帕金森病，在秀丽隐杆线虫中过表达a-突触核蛋白导致可通过荧光显微镜检测的可见a-突触核蛋白聚集体的形成。基因表达在unc-54启动子的控制下，以定向表达在体壁(bodywall)上，从而便于观察。发现T0R-2是可使过表达a-突触核蛋白的秀丽隐杆线虫中的蛋白聚集减少的蛋白。包含a-突触核蛋白GFP+T0R-2的转基因线虫系可用于与错误折叠和蛋白聚集相关的候选基因的RNAi筛选。对于多聚谷氨酰胺依赖性蛋白聚集，此前已有报道称T0R-2对错误折叠和蛋白聚集具有相似的抑制作用(Caldwelletal.HumMoIGenet.2003Feb1;12(3):307-19)。该转基因生物提供了通过向包含a-突触核蛋白GFP+T0R_2的转基因线虫体壁肌肉内饲喂(feeding)RNAi而进行快速筛选的方法，用来发现通过RNAi敲减基因表达而恢复a-突触核蛋白聚集的基因。可以使用RNAi通过常规方法对秀丽隐杆线虫基因文库进行筛选，从而通过可重复的结果确定基因敲减对a-突触核蛋白聚集的影响。通常，对于被评为参与蛋白聚集的靶基因，在约80%的受检a-突触核蛋白GFP+T0R-2生物体中出现聚集表型。可使用NCBIBLAST(NCBI，NationalLibraryo预edicine，NIH，Bethesda，MD)确定同源序列。在另一个实施方式中，本发明的基因编码为神经元提供神经保护性的蛋白。根据本文的讲授，可筛选秀丽隐杆线虫基因文库以确定候选基因是否为神经元提供保护。例如，在秀丽隐杆线虫模型中使用神经毒素6-0HDA的处理可导致多巴胺能神经元的损失。所选基因的过表达阻止了由6-0HDA处理导致的多巴胺能神经元损失。使用6-0HDA的处理通过形成活性氧导致损伤和死亡。因此，6-0HDA处理提供了用于分析与活性氧形成相关的神经疾病的神经保护的模型。同样可以建立表达参与神经疾病的易聚集倾蛋白的神经疾病模型。例如，在秀丽隐杆线虫的多巴胺神经元中过表达人a-突触核蛋白重现了帕金森病的神经变性特征，这是因为这些动物随年龄表现出多巴胺神经元损失(Caoetal，JNeurosci.2005Apr13;25(15):3801-12)。在本文中，转基因线虫代表了用于鉴定特定化合物和基因的神经保护功能的模型系统。由在神经元特异性启动子控制下表达荧光蛋白(如GFP、RFP、BFP或荧光素酶等)的转基因线虫开始制备过表达靶基因的秀丽隐杆线虫。神经元特异性启动子是本领域常规可用的启动子，包括但不局限于控制神经递质合成酶和神经递质转运子的启动子，例如酪氨酸羟化酶、多巴胺P羟化酶、多巴胺转运子、5-羟色胺转运子和膜泡乙酰胆碱转运子等。在另一个实施方式中，本发明涉及使用核酸探针特异性检测样品中是否存在相关核酸的方法，所述相关核酸包括相应于上述核酸分子或至少其片段的DNA或RNA分子，其在严谨杂交和洗脱条件下与此核酸探针(nucleicacid)杂交。在某些应用中，可将本文所述的多核苷酸检测并入用于说明与神经变性疾病相关的蛋白错误折叠或聚集的存在或倾向的诊断分析。在一个优选的实施方式中，本发明涉及由10-1000个核苷酸(优选10-500、10-100、10-50、10-35、20-1000、20-500、20-100、20-50或20-35个核苷酸)组成的优选与RNA或DNA片段杂交的分离核酸探针，其中所述核酸探针是由至少10个连续核苷酸(优选15、18、20、25或30个核苷酸)组成或与至少10个连续核苷酸(优选15、18、20、25或30个核苷酸)互补的核苷酸序列，所述连续核苷酸来自于包含与一个或多个下述序列具有90%同一性的多核苷酸序列的核酸分子编码表II所列多肽的核苷酸序列；与任一上述核苷酸序列互补的核苷酸序列；以及上文所述的任一核苷酸序列。可以通过，例如放射性标记、荧光标记、生物素/亲和素标记和化学发光等的标准标记技术对本发明的杂交探针进行标记，以用于检测。在杂交后，可以使用已知的方法使探针可视化。在另一个实施方式中，本发明涉及通过在可使杂交发生的特定杂交条件下使样品与上述核酸探针接触，并检测是否存在与核酸分子结合的探针，从而检测样品中是否存在13此核酸的方法。本领域技术人员可基于如上所述本领域已知的技术选择核酸探针。待测样品包括但不局限于来自人体组织的RNA或DNA样品。适用于本发明核酸探针方法的待测样品包括，例如，细胞或细胞的核酸提取物或者生物液体。在本文所述方法中使用的样品可随分析方式、检测方式以及分析中使用的组织、细胞或提取物的性质而变化。制备细胞核酸提取物的方法是本领域内已知的，并且易于调整以得到与所采用的方法相适应的样品。本发明还提供了通过检测与错误折叠/聚集相关的蛋白或提供神经保护的蛋白中的改变来诊断神经疾病的方法。在这些方法中，将来自个体的组织样品进行分析以获得如下蛋白发生的改变，这些蛋白选自SURF蛋白家族、SEC22蛋白家族和酰基辅酶A氧化酶，其中出现改变表明对神经疾病易感神经疾病或存在神经疾病。本文所用"组织"是指来自个体的生物样品。此类样品的实例包括但不限于细胞样品、单个细胞、体液样品(例如血液、淋巴或唾液，其中所述样品中可能存在或不存在细胞)。在另一个实施方式中，用于检测样品中选自SURF蛋白家族、SEC22蛋白家族和酰基辅酶A氧化酶的蛋白的方法包括在形成免疫复合物的条件下使样品与上述抗体(或蛋白)接触，和检测是否存在与所述多肽接合的抗体。可以将特异结合的抗体或蛋白与可检测的标签偶联。详细而言，该方法包括将待测样品与一种或多种本发明抗体一起温育，并分析所述抗体是否与待测样品结合。与正常水平相比较，样品中蛋白水平或活性的改变能够表明特定的疾病。在另一个实施方式中，本发明涉及检测样品中表I中蛋白的特异性抗体的方法，所述方法包括在形成免疫复合物的条件下使样品与表I中的蛋白接触，和检测与抗体接合的蛋白或与蛋白接合的抗体的存在。详细而言，该方法包括将待测样品与一个或多个本发明的蛋白一起温育，并分析抗体是否与待测样品结合。抗体和待测样品的温育条件有多种。温育条件依赖于所采取的分析方式、所采取的检测方式和分析中所用抗体的类型和性质。本领域的技术人员可认识到常规可用的免疫学分析方式(例如放射性免疫测定、酶联免疫吸收测定、底层扩散平板(diffusionbasedOuchterlony)或快速免疫荧光领lj定(rocketinim皿ofluorescentassays))中的任何一种都可以经调整而适合用于本发明的抗体(Chard，In:AnIntroductiontoRadioimmunoassayandRelatedTechniques,ElsevierSciencePublishers,Amsterdam,TheNetherlands(1986);Bullock，etal.，In-TechniquesinImmunocytochemistry，AcademicPress,Orlando,FIa.Vol.1(1982)，Vol.2(1983)，Vol.3(1985);Tijssen，In-PracticeandTheoryofenzymelmmunoassays-LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,ElsevierSciencePublishers,Amsterdam,TheNetherlands(1985))。本发明的免疫分析待测样品包括细胞、蛋白或细胞的膜提取物，或者生物液体，如血液、血清、血浆或尿液。在上述方法中使用的待测样品可随分析方式、检测方法的性质和用作待分析样品的组织、细胞或提取物而变化。细胞的蛋白提取物或膜提取物的制备方法是本领域已知的，并且易于调整以得到所采用系统能够利用的样品。本发明使用了可测定聚集并引起神经疾病的蛋白的几个合适的分析方法。合适的分析方法包括免疫方法，例如放射性免疫测定、酶联免疫吸收测定(ELISA)和化学发光测14在多个优选的实施方式中，免疫技术通过混合型抗体(即，一个或多个抗体)的方式检测表I中蛋白的水平，所述混合型抗体包括单克隆和/或多克隆抗体，及其混合物。例如，这些免疫技术可以使用多克隆和/或单克隆抗体的混合物，例如鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的混合物。本领域技术人员可以得到针对适当免疫原的抗体，所述免疫原例如分离的和/或重组的蛋白或者其部分或片段(包括合成分子，例如合成的肽)。在一个实施方式中，制备针对表I所列的分离的和/或重组的蛋白，或者其部分或片段(例如肽)的抗体，或者针对表达这些重组蛋白之一的宿主细胞的抗体。此外，可以将表达重组蛋白的细胞，如转染细胞，用作免疫原或用于筛选与蛋白结合的抗体。根据此方法，可通过分析方法确定生物样品中蛋白的水平或浓度。为了测定蛋白的量，分析方法包括在适合抗体和蛋白形成复合物的条件下使待测样品与具有蛋白特异性的抗体组合，并检测或测定(直接或间接)复合物的形成。可通过适合特定样品(例如全血、组织提取物、血清)和所选分析方式的方法获得和制备样品。例如，适用于全血收集的方法是静脉穿剌或从留置动脉导管收集血液。收集血液的容器可包含抗凝血剂，如CACD-A、肝素或EDTA。还选择结合样品和抗体的方法，以及检测复合物形成的方法以与分析方式相适应。可直接检测合适的标签，如放射性、荧光或化学发光标签；或者使用如酶标和其他抗原或特异结合伴侣(如生物素和胶体金)进行间接检测。此类标签的实例包括荧光标签如荧光素、罗丹明、CY5和APC，化学发光标签如荧光素酶，放射性同位素标签如32p、125I和mI，酶标签如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶、P_半乳糖苷酶、生物素、亲和素和自旋标记(spinlabel)等。也可以使用随后被检测的第二抗体通过免疫学方式检测复合物中的抗体。可以采用常规的或其他合适的方法直接或间接标记抗体。在另一个实施方式中，表I中所列的分子可以用于诊断和筛选方法，所述方法包括检测基因中是否存在突变，其中此基因的突变会造成人神经疾病。例如，本发明的诊断和筛选方法对诊断人类患者的神经基因是否存在突变或多态性尤其有用，其中该患者根据其家族史而被怀疑具有患与表I中蛋白表达水平改变相关的疾病的风险，或者患者自愿检测与这些蛋白相关的疾病。在另一个实施方式中，可将本文所述多核苷酸开发成微阵列用于筛选突变的存在，或者野生型序列或使个体易患神经病症的序列的缺失。微阵列可包含本文所述的野生型或改变的序列，以检测来自个体的组织样品中基因表达的变化。所述阵列可以包含本文提供的所有序列或可以与样品中的互补序列特异结合的所述序列的片段和突变体。此阵列也用于确认野生型基因表达的升高或降低，其中所述野生型基因导致易患神经病症或表明存在神经病症。在任何情况下，均在所述阵列上提供典型量的完整序列，从而可以检测到来自组织样品的互补序列。多核苷酸的阵列或微阵列通常是核酸，例如DNA、RNA、PNA和cDNA，但也可包括蛋白质、多肽、寡糖、细胞、组织以及能够与靶分子特异结合的其任何变换(permutation)。微阵列的筛选可包括使用阵列上核酸序列的特异性可检测标签。此类筛选的实施可通过，例如点样微阵列或依据制造商的说明使用Affymetrix，Inc.(SantaClara，Calif.)的片段DNA微阵列技术(并基本如Schenaetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:10614-10619,1996和Helleretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:2150—2155，1997所15述)。FritzetalScience288:316，2000;〃MicroarrayBiochipTechnology"，LShi，丽w.Gene-Chios,com中大致回顾了微阵列在某因表汰分析中的应用。实施微阵列分析的系统禾卩试剂可商购于如Affymetrix，Inc.，SantaClaraCalif.;GeneLogicInc.，ColumbiaMd.;HySeqInc.，Su皿yvaleCalif.;MolecularDynamicsInc.，SunnyvaleCalif.;Nanogen，SanDiegoCalif.;禾口SynteniInc.，FremontCalif(由IncyteGenomics,PaloAltoCalif.购得)等公司。本文使用的"微阵列"和"阵可互换，是指一系列核苷酸序列在集中区域内的排列。阵列可以置于例如，固体基板(如载玻片)或半固体基板(如硝化纤维素膜)的表面上。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其任何变换。本领域内已知，微阵列指固定在基板(表面)上特定位置的不同多核苷酸或寡核苷酸的组合。阵列形成在由下列物质制作的基板上例如纸张、玻璃、塑料(如聚丙烯和尼龙)、聚丙烯酰胺、硝化纤维素、硅、光学纤维、聚苯乙烯或其他任何合适的固体或半固体支持介质，并且制成平板(如玻璃板和硅芯片)或三维(如引脚、纤维、珠、颗粒、微滴定孔和毛细管)结构。可通过多种方式将形成阵列的多核苷酸或寡核苷酸连结到基板上，包括(i)使用照相平板印刷技术的原位合成(如高密度寡核苷酸阵列)(参见Fodoretal.，Science(1991)，251:767-773;Peaseetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1994)，91:5022—5026;Lockhartetal.，NatureBiotechnology(1996)，14:1675;美国专利第5，578，832、5，556，752和5，510，270号)；(ii)以中密度至低密度在玻璃、尼龙或硝化纤维素上点样/印刷(如cDNA探针)(Schenaetal，Science(1995)，270:467-470;DeRisietal，NatureGenetics(1996)，14:457-460;Shalonetal.，GenomeRes.(1996)，6:639-645;禾口Schenaetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1995)，93:10539-11286);(iii)利用掩模(MaskosandSouthern,Nuc.Acids.Res.(1992)，20:1679-1684)和(iv)在尼龙或硝化纤维素杂交膜上的斑点印迹方法(参见例如Sambrooketal.，Eds.，1989，MolecularCloning:ALaboratoryMa皿al，2nded.，Vol.l_3，ColdSpringHarborLaboratory(ColdSpringHarbor,N.Y.))。在一个实施方式中，在制备用于诊断神经病症的阵列时，微阵列包含与选自SURF蛋白家族、SEC22蛋白家族和酰基辅酶A氧化酶的蛋白相关的序列。在另一个实施方式中，本发明涉及用于筛选激活或减弱表I中蛋白活性的化合物的方法。这些蛋白也可以在体外表达并纯化以用于筛选试验，或者在动物模型中表达用于蛋白错误折叠/聚集和神经毒性。对于随机筛选，随机选择如肽、碳水化合物和药剂等的试剂并测定其与蛋白结合或激活/减弱蛋白活性的能力。所述方法包括将表达此蛋白的细胞和待测化合物一起温育；并通过测量化合物对此蛋白与ATP结合的影响来分析细胞的蛋白活性。只要表达功能形式的蛋白并且可测量蛋白活性，任何细胞都可用于上述分析。优选的表达细胞是真核细胞或生物体。可以使用本领域已知的常规手段改造此类细胞以使其包含编码此蛋白的DNA序列。或者，本领域技术人员也可以将编码此蛋白的mRNA直接导入细胞。在另一个实施方式中，本发明涉及对医药品(如药物)的筛选，其中所述医药品可以中和被改变的蛋白的表达或异常活性。优选地，通过本文描述的载体技术，使用神经元培养物来过表达突变形式的蛋白。分析神经元形态和蛋白分布的变化，并使用定量方法。随后，将此生物分析方法用于筛选可以改善该表型的药物。使用表I中蛋白的配体(包括上16述拮抗剂和激动剂)，本发明进一步提供了调节细胞中所述蛋白活性的方法。通常，可制备经鉴定可阻止或激活所述蛋白活性的药物(拮抗剂和激动剂)，以使该化合物可以与在体内表达蛋白的细胞接触。此类细胞与此类化合物的接触导致对该蛋白活性的体内调节。候选化合物可选自传统分类的治疗剂，例如小分子化合物、肽化合物、肽类似物、抗体、抗体片段、抗体衍生物、核苷酸分子和激素等。在一个实施方式中，候选小分子化合物可包括拓扑异构酶II抑制剂、细菌转肽酶抑制剂、钙通道拮抗剂、环氧合酶抑制剂、叶酸合成抑制剂和钠通道阻断剂。如公开的PCT申请W02007/062186A2(其全文通过引用并入本文)中的公开，这些分子防止蛋白错误折叠和聚集，或者提供了神经保护。此分析中筛选的其他试剂包括但不局限于氨基酸衍生物、肽、碳水化合物、维生素衍生物或其他药剂。可以通过合理的选择，或通过使用例如蛋白或配体建模技术的方法(优选计算机建模)随机选择并筛选这些试剂。表I中描述的核苷酸序列和蛋白也可以用于设计充当内源分子的激动剂、拮抗剂或结合伴侣的新化合物。通过本文所述筛选方法鉴定的影响错误折叠和蛋白聚集的活性测试试剂可以作为先导化合物用于类似化合物的合成。通常，合成的类似化合物具有与先导化合物相似的电子构型和分子构象。类似化合物的鉴定可通过使用如自洽场(SCF)分析、构型相互作用(CI)分析和正常模式动态分析的技术完成。可获得执行这些技术的计算机程序。参见，例如Reinetal.，(1989)Computer-AssistedModelingofRec印tor-Ligandlnteractions(AlanLiss，NewYork)。—旦制备出类似物，可以使用本文所述方法对其进行筛选以鉴定出那些对蛋白聚集的调节能力提高的类似物。随后，可对此类化合物采取进一步分析以鉴定那些最有可能成为药剂的化合物。或者，也可以将在筛选方法中显示活性的类似物作为先导化合物用于制备可通过本文所述方法筛选的再进一步类似物。筛选、合成类似物和再筛选的循环可重复多次。或者，也可以合理地选择或设计试剂。在基于蛋白构象选择试剂时，该试剂在本文中被称为"合理选择或设计"。定量构效关系(QSAR)方法可用于量化化合物的化学结构和其生物学活性之间的关系。可通过一个或多个技术来对每一种化合物类型的广谱功效进行定性或定级，这些技术包括构效关系(SAR)和/或定量构效关系(QSAR)方法，所述方法鉴定与化合物类型相关的一个或多个结构所涉及的一个或多个活性。此后，可以根据如合成性、适应性、专一性、活性、毒性和/或新陈代谢的因素来排定这些化合物类型中的每一个的优先次序。在这种情形下，可以测定和分析每个特定化合物类型中的所有化合物或附加组的化合物。由于某些化合物类型十分庞大，可测定和分析化合物类型中的亚组，并且如果此类型持续表现出超过预计水平的功效，则继续测定剩余的成员。此方法也可鉴定用于本发明的化合物的功能类似物和化合物类型。然后，通过使用筛选神经保护作用以及蛋白错误折叠和聚集作用的秀丽隐杆线虫模型确认功能类似物的活性。计算机建模技术可使所选分子的三维原子结构可视化，并合理设计与该分子相互作用的新化合物。这些方法提供了发现那些已知具有神经保护作用和蛋白错误折叠和聚集功能的小分子化合物的功能性类似物的途径。分析化合物与靶蛋白结合时的三维结构可鉴定出相互作用位点，该位点可用于鉴定具有相似结合特性的小分子化合物和功能性类似物。三维结构通常依赖于由所选分子的x射线晶体图像分析或NMR成像所得的数据。分子动力学需要力场数据。计算机图像系统使预测新化合物如何连接到靶分子上成为可能，并且允许实验性地操纵化合物和靶分子的结构以得到完美结合特异性。当分子和化合物之一或二者都发生小变化时，预测分子-化合物相互作用的情况需要分子力学软件和计算密集型计算机(computationallyintensivecomputer)，其通常通过用户友好型菜单操作界面将分子设计程序与用户联系起来。分子建模系统的实例有CHARMm和QUANTA程序，PolygenCorporation，Waltham，Mass。CHARMm执行能量最小化和分子动力学功能。QUANTA程序执行分子结构的建构、图形建模和分析。QUANTA允许分子间相互行为的互动式建构、修饰、可视化和分析。多篇文献概述了与特定蛋白相互作用的药物的计算机建模(SchneiderandFech證，NatRevDrugDiscov.2005Aug;4(8):649-63;G騰r，IDrugs.2005Jul;8(7):567-72;和Hanai，CurrMedChem.2005;12(5):501-25)。其他筛选和图形预测化学物的计算机禾呈序可从如BioDesign，Inc.、Pasadena，Calif.禾口Hypercube，Inc.，Cambridge,Ontario的公司获得。尽管这些软件原本设计是用于特定蛋白的特异性药物，但它们也适合设计对DNA或RNA区域的特异性药物，只要此区域已被鉴定。尽管上述内容涉及设计和产生可改变结合的化合物，但本领域技术人员也可筛选已知化合物文库，包括天然产物或合成化学物质，和生物活性物质包括蛋白，以得到作为抑制剂或活化因子的化合物。通过使用筛选神经保护作用和蛋白错误折叠和聚集作用的秀丽隐杆线虫模型确认使用这种方法鉴定的化合物的活性。本发明还提供了转基因动物模型，该模型用于筛选用于预防和治疗性应用的化合物。本发明的转基因动物是通过非自然手段(即人工操作)导入了一个或多个该动物自然不产生的基因(如外源基因，遗传工程化的内源基因等)的动物。非自然导入的基因(被称为转基因)可来自与该动物相同或不同的物种，但该转基因所赋予的构象和/或染色体位点不是在该动物中自然存在。转基因可以包括外源DNA序列，即通常不在宿主动物基因组内发现的序列。可选地或另外地，转基因可以包括内源DNA序列，所述的该内源DNA序列由于在体外被重排或突变而是异常的，这是为了改变该基因正常的体内表达模式或者改变或消除由该基因编码的内源基因产物的生物活性(Watson，J.D.，etal.，In-RecombinantDNA，2dEd.，W.H.Freeman&Co.，NewYork(1992)，pg.255-272;Gordon，J.W.，1989，Intl.Rev.Cytol.115:171-229;Jaenisch，R.，1989，Science.240:1468-1474;Rossant，J.，1990，Neuron.2:323-334)。可以通过原核注射(pro皿clearinjection)、ES细胞转化、病毒整合方法并入转基因，所有这些方法都是本领域技术人员已知的常规技术。本发明的非人类动物包括内源基因的转基因插入或改变的任何动物(基因敲除动物)和/或向其基因组中引入针对选自SURF蛋白家族、SEC22蛋白家族和乙酰辅酶A氧化酶的蛋白表达的一个或多个转基因的动物。所述非人类动物包括脊椎动物如啮齿类、非人类灵长类、羊、狗、牛、两栖动物、爬行动物等。优选的非人类动物是选自非人类的哺乳动物物种，最优选来自啮齿类动物家族的动物，包括大鼠和小鼠，最优选小鼠。18对疾病易感或因转基因而导致疾病的所得转基因非人类动物可用来鉴定诱导该疾病的化合物和评估已知或怀疑诱导该疾病的化合物的致病潜能((Bems，A.J.M，美国专利第5，174，986号)，或者评估可用来治疗该疾病或缓解其症状的化合物(Scott，etal.，WO94/12627)。靶基因被整合到染色体的，并且在这些转基因生物体中过表达靶蛋白。在一个实施方式中，本发明提供了转基因动物，其通过表达缺陷蛋白折叠系统或易聚集蛋白而表现出与蛋白错误折叠和聚集相关的神经疾病的症状。其他易聚集蛋白如突变亨廷顿蛋白、P-淀粉样蛋白，tau蛋白，a-突触核蛋白、突变雄性激素受体、突变SODI和突变ataxin等可以用来模拟其他神经疾病。例如，在一个实施方式中，使用了通过神经元特异启动子过表达a-突触核蛋白的转基因生物体。过表达a-突触核蛋白产生错误折叠的蛋白中间体、蛋白聚集和神经元变性。可将此转基因系与过表达由此前的RNAi筛选鉴定的靶基因的生物体杂交，从而确定靶基因产物是否赋予了神经保护性能，以及是否降低了a-突触核蛋白错误折叠和聚集的毒性效应。在转基因是选自SURF蛋白家族、SEC22蛋白家族和酰基辅酶A氧化酶的基因的改变形式的情况下，可使用其他模型。所述改变可包括导致神经疾病症状的蛋白表达增加或降低，或者突变，或者可选择的剪接形式。在测定神经保护的模型中，使用如已知破坏含多巴胺神经元的6羟色胺(6-0HDA)的神经毒素处理转基因动物。在此筛选方法中也可以使用其他神经毒素，其是本领域技术人员已知的。可在接触毒素后使用荧光显微镜对神经元多态性进行常规筛选。例如，此筛选方法鉴定了以通过保护多巴胺能神经元免受a-突触核蛋白诱导的神经变性的能力为特征的一些基因产物。该基因具有高度的保守性，例如人、线虫、牛、大鼠和小鼠的酰基辅酶A序列的e值都几乎为O。因此，其他物种的同源物在提供神经保护方面应该具有相同的功能。过表达sec-22为多巴胺神经元提供了免受a-突触核蛋白诱导的神经变性的神经保护。相似地，扭转蛋白也为多巴胺神经元提供了免受a-突触核蛋白诱导的神经变性的神经保护(Caoetal.，JNeurosci.2005Apr13;25(15):3801-12)。转基因线虫提供了筛选其他基因或化合物神经保护功效的有效模型系统。在本文中，当通过遗传操作使通常不产生或通常以低水平产生蛋白的细胞产生该蛋白时，该细胞被称为"经改变以表达预期肽"。本领域技术人员可以容易地对方法进行改进，以使其适合将基因组、cDNA或合成的序列导入真核或原核细胞并在其中表达。如果核酸分子(如DNA)包含具有转录和翻译调控信息的核苷酸序列并且此类序列被"可操作地连接"到编码多肽的核苷酸序列上，则将此核酸分子被称为"能够表达"所述多肽。可操作连接是将调控DNA序列和试图表达的DNA序列以允许实现基因表达的方式连接。本文所述核酸分子和蛋白质提供了医治神经疾病的治疗靶点。可通过恢复基因或蛋白质的功能来治疗由该基因或蛋白质缺乏或缺陷造成的神经疾病。可通过使用基因治疗或服用化合物来恢复正常基因或蛋白功能的方法来完成此类恢复。对于已患或易患由蛋白缺乏或缺陷造成的神经疾病的患者，可以以某种方式和剂量向此类患者的细胞提供功能性DNA，从而使由此基因编码的蛋白以足以治疗此类患者的时间和数量表达。本领域已知许多载体系统可以为需要细胞缺失基因或蛋白的人类患者提供这样的递送。例如，可使用逆转录病毒系统，尤其是修饰的逆转录病毒和单纯疱疹病毒(Breakefield，X.0.，etal.，1991，NewBiologist.3:203-218;Huang，Q.，etal.，1992，ExperimentalNeurology.115:303-316;W093/03743;W090/09441)。递送编码功能蛋白的DNA序列会有效替换造成疾病的缺失或突变基因。在本发明的另一实施方式中，基因以重组基因的形式在细胞内表达，这样该细胞可被移植到哺乳动物中，优选移植到需要基因治疗的人类中。为了向个体提供基因治疗，将编码完整或部分基因的遗传序列插入到载体中并导入到宿主细胞。在另一个实施方式中，可以使用RNAi来降低缺陷或功能缺失蛋白的表达。这样的方法见综述Forteetal.(CurrDrugTargets.2005Feb;6(1):21-9)。适用于基因治疗的疾病包括但不局限于神经变性疾病或病症。此类病症包括帕金森病、阿尔茨海默病、朊病毒病、多聚谷氨酰胺病、tau蛋白病、亨廷顿病、张力失常、家族性肌萎縮侧索硬化、匹克病、进行性核上麻痹和皮质退化症。可以使用基因治疗方法将表I中蛋白的编码序列转化到患者体内(ChattedeeandWong，1996，Curr.Top.Microbiol.Immunol.218:61-73;Zhang，1996，J.Mol.Med.74:191-204;Schmidt_WolfandSchmidt-Wolf，1995，J.Hematotherapy.4:551-561;Shaughnessy，etal.，1996，SeminarsinOncology.23:159—11;D皿bar，1996，A皿M.Rev.Med.47:11-20)。可在基因治疗中使用的载体的实例包括但不局限于缺陷逆转录病毒、腺病毒或其他病毒载体(Mulligan,R.C，1993，Science.260:926-932)。将携带基因的载体导入细胞的方法包括但不局限于显微注射、电穿孔、转导，或使用DEAE-Dextran、脂质体和磷酸钙的转染，或者本领域技术人员已知的其他方式(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，andManiatis，T.，1989，In:MolecularCloning.ALaboratoryManual.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor)。可以施用本发明的化合物，包括使用所述筛选方法发现的治疗性化合物，来治疗神经疾病。在一个实施方式中，施用包含治疗用有效剂量化合物的组合物来治疗、降低或根除神经疾病的症状。本领域技术人员也可理解，任何具体治疗方案中的给药剂量都是易于确定的。剂量应该不能大到产生有害副作用，如有害的交叉反应和过敏反应等。通常，剂量依据病人的年龄、病情、性别和患病严重程度、禁忌症(如果有)、以及其他变量而变化，由具体医师来调整。本发明使用的用以提供免疫激活的剂量包括从约lPg到约500i!g，其中包括O.5、1.0、1.5、2.0、5.0、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400和450iig，包括其间所有区间和亚区间。此剂量可以作为单一剂量施用，或根据疗程施用，包括后续加大剂量，保证其有效，例如本发明的药物组合物可以一次给药或者在以天、周、月和/或年计的疗程时间内连续给药。可以随药学上可接受的载体施用所述剂量。此外，可以根据给药方法适当地使用如可注射制剂(溶液、悬浮液、乳液、使用时溶解的固体等)、片剂、胶囊、颗粒、粉剂、液体、脂质体包涵物、膏剂、凝胶、外用粉剂、喷剂、吸入性粉剂、滴眼液、眼膏、栓剂和阴道栓剂等的剂型；并相应地配制本发明的肽。药物制齐U在本领域中是公知的，并且记述在如ComprehensiveMedicinalChemistry,Volume5，EditorHanschetal，PergamonPress1990中第25.2章中。可以通过注射或随时间逐渐灌注以非肠道方式施用表I的蛋白或其配体。可以通20过静脉、腹膜内、肌内、鞘内或皮下施用。确保化合物透过血脑屏障的其他方法也可用于此化合物的施用。用于非肠道给药饿制剂包括灭菌的含水溶液或非含水溶液、悬浮液和乳液。非含水溶液的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯，如油酸乙酯。含水载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，还包括盐水和缓冲介质。注射用载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖和氯化钠、乳化林格氏溶液或固定油。静脉载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格氏葡萄糖的补充剂等。也可添加防腐剂和其他添加剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等(Remington'sPharmaceuticalScience,16thed.，Eds.:Osol，A.，Ed.，Mack，EastonPA(1980))。在另一个实施方式中，本发明涉及药物组合物，其包含表I中蛋白或足以改变此蛋白活性的其配体，和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。如上所述(Remington'sPharmaceuticalSciences,16thed.，Eds.:Osol，A.，Ed.，Mack，EastonPA(1980);WO91/19008)，本领域技术人员可以容易地确定适当的浓度和剂量单位大小。可用于本发明的药物学上可接受的载体包括但不局限于，赋形剂、粘合剂、润滑剂、着色剂、崩解剂、缓冲剂，等渗剂、防腐剂和麻醉剂等医药领域常用的试剂。在另一个实施方式中，本发明涉及向给动物(优选哺乳动物(更优选人类))施用表I中蛋白或蛋白配体的方法，其施用量足以产生改变该动物体内该蛋白水平的功效。施用的蛋白或配体能够特异影响与蛋白相关的功能。此外，因为表I中的蛋白在脑组织中表达，蛋白或配体的施用可以用于改变脑中蛋白的水平或功能。可以用此方法治疗的神经病症包括蛋白聚集病症，如阿尔茨海默病、帕金森病、朊病毒病、多聚谷氨酰胺病、tau蛋白病、亨廷顿病、家族性肌萎縮侧索硬化、匹克病、进行性核上麻痹和皮质退化症。在另一个实施方式中，本发明涉及用于检测样品中是否存在表I所列核酸或蛋白的试剂盒。在一个实施方式中，该试剂盒包括试剂盒及其使用说明书，其用于检测改变的蛋白或诊断存在或易患神经疾病的倾向。该试剂盒可以包含至少一个含有置于其中的上述核酸探针的容器。在优选的实施方式中，该试剂盒进一步包含含有洗涤试剂和/或能够检测是否存在杂交核酸探针的试剂的其他容器。检测试剂的实例包括但不局限于放射性标记探针、酶探针(辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)和亲和标记探针(生物素、亲和素或链霉亲和素)。在一个实施方式中，该试剂盒包含用于通过实施PCR、杂交或基于序列的分析或其组合(如微阵列)检测病症的一个或多个试剂。详细来说，分隔式试剂盒包含以单独容器存储试剂的任何试剂盒。此类容器包括小玻璃容器、塑料容器或者塑料条或纸条。此类容器可以有效地将试剂从一个间隔转移到另一间隔，这样样品和试剂没有交叉污染，并且每个容器的试剂或溶液可以定量地从一个间隔添加到另一个间隔。此类容器包括可接受待测样品的容器、含有该测定中使用的探针或引物的容器、含有洗涤试剂(如磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液等)的容器和含有用于检测杂交探针、结合抗体或扩增产物等的试剂的容器。本领域技术人员容易认识到本发明所述核酸探针可以容易地加入到本领域已知的一个成熟试剂盒中。在本发明的另一个实施方式中，提供了用于检测表I中蛋白是否存在的试剂盒；或以表I中蛋白是否存在为基础检测哺乳动物产生的病症的可能性。此具体试剂盒包含实施前述检测方法所需的所有试剂。例如，该试剂盒包含含有上述抗体的第一容器和含有结合物的第二容器，该结合物包含该抗体的结合伴侣和标签。该试剂盒还可以包含含有上述蛋白的第一容器，和优选地含有结合物的第二容器，该结合物包含该抗体的结合伴侣和标签。更具体地，诊断试剂盒包含如上述表I所列的蛋白质，以检测来自可能已感染的动物和人血浆中的抗体。在另一个优选实施方式中，所述试剂盒还包含含有一个或多个如下成分的一个或多个其他容器洗涤试剂和能够检测是否存在结合抗体的试剂。检测试剂的实例包括但不限于标记的第二抗体，或者，如果第一抗体是标记的，能够与标记抗体反应的发光团、酶或抗体结合试剂。分隔式试剂盒可如上所述用于核酸探针试剂盒。该试剂盒可以是，例如RIA试剂盒或ELISA试剂盒。本领域技术人员可容易地认识到本发明所描述的抗体可以容易地加入到本领域已知的一个成熟试剂盒中。以下将通过具体实施例对本发明进行更详细地描述。以下提供的实施例仅用于说明，并不以任何方式限定或限制本发明。实施例1:使用RNAi筛选在帕金森病中调节蛋白聚集的基因已开发出过表达a-突触核蛋白GFP的转基因秀丽隐杆线虫系，其导致可通过荧光显微镜观察到的可见a-突触核蛋白聚集体的形成。基因表达处于unc-54启动子的控制下，以指导在体壁上的表达。使用含有a-突触核蛋白GFP+T0R-2的另一个转基因线虫系用于与蛋白聚集相关的候选基因的RNAi筛选。在a-突触核蛋白GFP+T0R-2线虫中存在的T0R-2阻止了a-突触核蛋白GFP融合蛋白在体壁肌肉细胞内的聚集，从而产生扩散的荧光。对于多聚谷氨酰胺的蛋白聚集，此前已有报道称T0R-2对蛋白聚集具有相似的抑制(Caldwelletal.HumMolGenet.2003Feb1;12(3):307-19)。此转基因生物允许通过向包含a-突触核蛋白GFP+T0R-2的转基因线虫体壁肌肉饲喂RNAi而进行快速筛选的方法，以用来发现通过RNAi消减时导致错误折叠升高和恢复a-突触核蛋白聚集的基因。使用RNAi筛选秀丽隐杆线虫基因文库以确定基因敲减对a-突触核蛋白聚集的影响。购买含有18，000细菌菌株的RNAi文库以用于在秀丽隐杆线虫全基因组RNAi筛选中进行细菌喂食(SangerCentre,Cambridge)。不同于在整个秀丽隐杆线虫基因组中进行的广泛筛选，合理靶向涉及内质网相关降解(ERAD)、泛素蛋白体系统(UPS)、自噬作用、帕金森病的基因以及相互作用组和微阵列共表达数据鉴定出用于筛选影响蛋白聚集的候选分子。简要而言，在含有氨苄青霉素和四环素的LB琼脂糖平板上制备表达靶基因dsRNA的大肠杆菌新鲜培养物，并使其生长过夜。次日制备a-突触核蛋白GFP幼虫(dauerworm)的新鲜培养物和3mL表达靶基因的大肠杆菌细菌培养物。在实验当天，对每个靶基因，先后使用IPTG和细菌培养物涂布一个小型培养板和一个中型培养板，其中在涂布每种物质之间保留干燥的时间。在每个中型培养板上放5条L4线虫，在25t:下放置约42小时。随后，将所有的原始成虫转移到小型IPTG/细菌涂布的平板上，放置9小时，然后烧掉原始成虫。36小时后对子代所产生表型的表达进行分析。22多轮的RNAi分析(每个基因50条线虫；2次重复；当>80%的线虫表现出聚集升高，则判断为阳性)以及在发育阶段动物中进行的更严格的后续筛选(以用于鉴定随衰老而表现更强作用的候选基因)鉴定了表I中列出的在被敲减后可重复地诱导人a-突触核蛋白的错误折叠的候选基因。这些基因是SURF蛋白家族、SEC22蛋白家族和酰基辅酶A氧化酶的秀丽隐杆线虫同源物。在候选基因的系统性RNAi敲减后，筛选聚集状态得到恢复的ci-突触核蛋白GFP+T0R-2线虫，可以得到多种表型。这些表型包括聚集体在细胞核周围的偶然聚集。这些实验的发现提供了使用常规实验筛选与a-突触核蛋白聚集相关的蛋白的可靠方法。这些实验的结果提供了对靶蛋白的鉴定，用于研究靶蛋白内引起病理表型的突变，同时提供了用于合理药物设计的蛋白目标。实施例2:过表达a-突触核蛋白后表达候选基因对多巴胺神经元的神经保护特别设计了用于筛选候选帕金森病基因的新型线虫同基因系，用于证明神经保护作用。这个新型同基因系包含在多巴胺神经元内过表达人a-突触核蛋白和GFP的染色体整合转基因，以评估在发育和老化期间体内的神经变性。这个系在秀丽隐杆线虫发育的成年期第4天表现出约30_40%变性，并提供了研究环境/遗传因素的理想工具，其中a-突触核蛋白易感性可能影响多巴胺神经变性。通过以下对阳性RNAi筛选候选基因进行系统评估使在该a_突触核蛋白株的多巴胺神经元内过表达相应cDNA的动物杂交，随后寻找神经保护的证据。此株也用于a-突触核蛋白依赖性变性的小分子抑制剂的中等通量筛选。材料和方法秀丽隐杆线虫株和操作方案使用标准程序(Brenner，1974)来培养线虫。通过用带有Pdat—丄::SEC22[UA38(baEx38)株]或Pdat—丄::torsinA和Pdat—丄::T0R-2的Pdat—丄::GFP转化到野生型秀丽隐杆线虫(N2Bristol种类)中产生转基因系。为了构建a-突触核蛋白过表达系，将Pdat—1::GFP和Pdat—1::a-突触核蛋白[UA18(baEx38)株]注射入N2线虫中。对每份质粒构建体的组合，比较多个表达稳定染色体外阵列的线虫系，将3个有代表性的系用于除6-0HDA以外的实验分析，其中，在对所有稳定系进行初始分析后，将单个代表性转基因系用于重复实验。质粒构建和突变使用GatewayTM技术(Invitrogen，Carlsbad，CA)构建质粒。具体而言，通过HindIII和Kpnl双酶切将unc-54启动子区从pPD30.38(AndrewFire惠赠)切除，并替换成从pRN200(Nassetal.，2002)扩增的dat-1启动子区片段。随后，使用Gateway技术将所得新载体转入Gateway目的载体pDEST-DAT-1中。人a_突触核蛋白cDNA质粒从Phili卯Kahle获得。使用编码SEC22(SEQIDNO:5)a_突触核蛋白、GFP的PCR扩增cDNA片段，通过与pD0NR201或pD0NR221的BP反应制备Gateway入门载体(entryvector)。其后，通过与相应入门载体的LR反应将所有基因克隆到pDEST-DAT-1载体中。制备用于免疫印迹的秀丽隐杆线虫提取物在两个100mmNGM平板上的每个转基因系生长到近乎汇集后，制备提取物。通过使用M9缓冲液洗涤，并在1.5ml微离心管内以5，OOOxg离心1分钟来收集线虫。将线虫沉淀重悬在0.5ml线虫裂解液(lOOmMTris，pH6.8，2%SDS，15%甘油)中，并煮沸5分钟以将其裂解。将此裂解物在13，200xg离心10分钟，收集上清，再使用CnetriconYM-10柱(Millipore)以14，OOOxg离心30分钟进行浓縮。使用二羧基二喹啉(bicinchoninicacid)蛋白测定(Sigma，St.Louis，MO)测定蛋白浓度。a-突触核蛋白诱导的神经变性分析为了得到a-突触核蛋白转基因系的7日龄的动物，选择含绿色荧光的非整合Ll和L2的线虫，并使其生长到成虫期第4天(孵化后约7天)。在每个选定阶段分析每个非整合系的30-40条线虫，对每个转基因组合报道至少3个稳定系的均值。当线虫仍保存所有四个CEP胞体时，无论该树突体形态如何，则将该线虫记录为野生型。结果将来自候选基因的野生型cDNA克隆入多巴胺表达载体，以在神经保护分析中在转基因秀丽隐杆线虫内进行评估。此筛选方法还鉴定以具有保护多巴胺能神经元免受a-突触核蛋白诱导的神经变性的能力为特征的基因。该秀丽隐杆线虫基因为SEC22(SEQIDNO:5)，并与人SEC22基因(SEQIDNO:7)对应。在GFP标记的多巴胺神经元内过表达SEC22cDNA，并在接触6-0HDA后分析神经保护作用。获得了独立的SEC22表达转基因系，其表现出保护多巴胺神经元免受突触核蛋白诱导的神经变性的明显作用。在过表达酰基辅酶A氧化酶时发现了相似的结果。例如，SEC22在DA神经元内的神经保护作用显示于图1中。进一步的研究将区分在发育早期表现出聚集的其它候选基因和仅随动物年龄而表现聚集的候选基因。实施例3:使用微阵列检测蛋白改变并诊断人体对帕金森病的易感性或患有帕金森病的方法帕金森病微阵列的制备可以使用标准的商用微阵列技术制作帕金森病微阵列，例如Affymetrix公司使用的点样微阵列或基于高密度寡核苷酸的平台。选择中等数量至大量的基因和/或转录本进行分析，即，表达(或响应)谱。可使用本发明方法监测的核酸序列包括但不局限于美国国家生物技术信息中心(网址ncbi.nlm.nih.gov)在GenBank.RTM数据库中所列的基因，和其他公共或商业数据库提供的序列(例如NCBIEST序列数据库、EMBL核苷酸序列数据库；Incyte's(PaloAlto，Calif.)LifeSeq.TM.数据库禾PCelera's(Rockville，Md.)"DiscoverySystem".TM.数据库)。所述微阵列还包含编码表I中蛋白的人同源基因序列的相应转录本。本阵列可包含与所述基因/转录本对应的全长序列，或者全长序列中可以提供足以检测样品中基因/转录本的特异性的一个或多个片段。所述微阵列可以包含与SEQIDN0s:3、7或ll对应的转录本或片段及其组合，包括这些序列的突变形式和剪接变体。阵列上包含的其它序列包括与帕金森并相关的其他已知基因。与帕金森病相关的其他基因(如SNPs)也可包含在此阵列上(Maraganoreetal.，AmJHumGenet.2005Nov;77(5):685-93)。此阵列还包括阳性对照和阴性对照。微阵列的使用从个体收集来自个体的组织样品(如生物活检)并使用标准方法制备微阵列探针，将样品转换为标记的多核苷酸探针，与微阵列杂交，并洗去未结合的探针。随后，使用常规阵列扫描仪扫描此阵列以检测标签，从而确认患者样品中是否存在基因野生型或突变型(定性变化)以及基因表达水平的变化(定量变化)。使用标准商用数据挖掘软件对遗传谱进行分析和聚类。使用微阵列所得的结果可用于药物基因组学和预测医学的应用。多个患者的遗传谱与症状程度、疾病的发生和严重程度相关，从而构成了帕金森病谱的数据库。患者谱也与患者对已有治疗方法(如L-D0PA疗法)的反应相关。新型治疗性化合物的功效也与早期临床检验期间的患者谱相关，从而确定新治疗的最佳遗传谱。0180]序列表0181]SEQIDNO:10182]atg朋ccagttccgggctccaggtggtC3g朋Cg朋atgctggcga0183]cgccgctgaagatttcttccgc朋朋c朋ggacctacctaccccacattgctcgcctctg0184]cctcgtctccacattccttg朋g3tgg朋tccgtatgtacttccaatggg0185]acagttcatgcaagagtcttggtcttgcggttggttcatcgcaactttgttcgtcatcta0186]caacttcttcgg3C3gttC3tcccggttttaatgatcatgctccgcaagaaggtgttggt0187]cgcatgtggaattcttgccagcattgtcattctccaaaccatcgcttaccatattctctg0188]gg3Cttg朋gttcttggccag朋3C3ttgCcgttggtggaggacttttgctccttcttgc0189]Cg3g3C3C3gg朋g卿Elggcttccctgttcgccggagttcc朋c朋tggg3gactcg朋0190]tcgtacatgcttcttgccggacgtgttcttcttatcttcatgttcatgtc0191]tttgatgcattttgagatgtccttcatgcaagttttggagattgttgttggatttgctct0192]catcactctcgtctcaattggttec朋gacaaagctttccgcgattgttcttgtcatctg0193]gctcttcggacttaacctttggcttaatgcttggtggaccattccttccgaccgcttcta0194]cagagacttcatg朋gtecgatttcttccaaaccatgtccgtcattggaggacttctcct0195]tgtcattgcctecggaccaggaggagtgtcagtcgatgacgatggtag0196]SEQIDNO:20197]MNQFRAPGGQNEMLAKAEDAAEDFFRKTRTYLPHIARLCLVSTFLEDGIRMYFQWDDQKQ0198]FMQESWSCGWFIATLFVIYNFFGQFIPVLM頂LRKKVLVACGILASIVILQTIAYHILWD0199]LKFLARNIAVGGGLLLLLAETQEEKASLFAGVPTMGDSNKPKSYMLLAGRVLLIFMFMSL0200]MHFEMSFMQVLEIVVGFAUTLVSIGYKTKLSAIVLVIWLFGLNLWLNAWWTIPSDRFYR0201]DFMKYDFFQTMSVIGGLLLVIAYGPGGVSVDDYKKRW0202]SEQIDNO:30203]ggagccgcagccgacgcggagcgaggccggccgccgggcacttcctgtggaggccgcagc0204]gggtgcgggcgccgacgggcgagagccagcgagcgagcgagcgagccgagccgagcctcc0205]cgccgtcgccatgggccagaacgacctgatgggcacggccgaggacttcgccgaccagtt0206]cctccgtgtcacaaagcagtacctgccccacgtggcgcgcctctgtctgatcagcacctt0207]cctggaggacggcatccgtatgtggttccagtggagcgagcagcgcgactacatcgacac0208]cacctggaactgcggctacctgctggcctcgtccttcgtcttcctcaacttgctgggaca0209]gctgactggctgcgtcctggtgttgagcaggaacttcgtgcagtacgcctgcttcgggct0210]ctttggaatcatagctctgcagacgattgcctacagcattttatgggacttgaagttttt0211]gatgaggaacctggccctgggaggaggcctgttgctgctcctagcagaatcccgttctga0212]agggaagagcatgtttgcgggcgtccccaccatgcgtgagagctcccccaaacagtacatgcagctcggaggcagggtcttgctggttctgatgttcatgaccctccttcactttgacgccagcttcttttctattgtccagaacatcgtgggcacagctctgatgattttagtggccattggttttaaaaccaagctggctgctttgactcttgttgtgtggctctttgccatcaacgtatatttcaacgccttctggaccattccagtctacaagcccatgcatgacttcctgaaatacgacttcttccagaccatgtcggtgattgggggcttgctcctggtggtggccctgggccctgggggtgtctccatggatgag^g^g^ggagtggteacagtcacagatccctecctgcctggctaagacccgtggccgtcaaggactggttcggggtggat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