专利名称：珙桐pcr鉴定用引物及pcr鉴定方法
技术领域：
本发明涉及生物检测鉴定技术，具体地说涉及对珙桐生物资源进行PCR鉴定用引物及使用该引物的PCR鉴定方法。
背景技术：
珙桐属珙桐科珙桐属，为落叶乔木，花奇色美，是1000万年前新生代第三纪留下的孑遗植物，在第四纪冰川时期，大部分地区的珙桐相继灭绝，只有在我国南方的一些地区幸存下来，成为了植物界今天的“活化石”。为我国独有的珍稀名贵观赏植物，为世界著名的珍贵观赏树，常植于池畔、溪旁及疗养所、宾馆、展览馆附近，并有和平的象征意义，属于被子植物。材质沉重，是建筑的上等用材，可制作家具和作雕刻材料。是世界上濒于灭绝的、 非常珍贵的、我国独有的单型属植物。由于它具有极高的观赏价值以及非常罕见等特点，被我国列为国家一级重点保护树种。为防止我国珙桐种质资源的流失，对我国的社会生产力造成难以估量的损失，应该加大对我国珙桐资源的保护工作。
随着现代生物技术的出现，致使基因资源更多的是以非活体的遗传物质形式携带出境，增加了口岸查验的困难，为防止我国珙桐资源流失，建立有效的植物遗传资源出境检验鉴定方法就显得极为必要。目前国内外对珙桐检测识别仅限于形态上，在种的水平上未见有关其分子检测方法的研究。
为了保护我国珙桐种质资源，需要建立一种能够对难以从形态上进行判断的珙桐遗传资源进行辨别，且应该适合口岸检查应用，简单且精确的生物鉴定方法，以此防止珙桐不会以非活体遗传物质形式等非传统形态被携带出国境。发明内容
本发明的目的在于提供一种珙桐的PCR鉴定用引物及PCR鉴定方法，对难以从形态上进行判断的珙桐进行简单且精确的鉴定。
本发明应用衍生性酶切扩增多态性序列(dCAPS，derived cleaved amplified polymorphic sequences)分子标记方法对珙桐的分子检测方法进行研究，通过生物信息学的方法，在对珙桐与其近缘种植物叶绿体atpF-atpH基因序列进行分析和比较的基础上， 设计dCAPS分子标记，建立了对珙桐稳定、高效的鉴定方法，可根据对扩增产物酶切结果的琼脂糖电泳判定是否有珙桐核酸存在。
dCAPS是一种通过等位基因快速检测、鉴定单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)的分子标记方法。dCAPS技术原理为在引物中引入错配碱基，使扩增的产物在一个生物型中具有相应的核酸内切酶酶切位点，而在另一种生物型中没有，PCR产物经过核酸内切酶酶切，通过分析图谱，进而检测出SNP位点。在本发明提供的用于鉴定珙桐的引物中，基于atpF-atpH基因中的一个SNP位点，利用dCAPS Finder2. 0软件设计上游引物，用I^rimer Premier 5. 0软件设计下游引物。
本发明提供珙桐PCR鉴定用引物，能对珙桐的DNA进行扩增，生成珙桐特异性扩增片段。本发明提供的珙桐PCR鉴定用引物，其核苷酸序列为正向5，-GGTTACATTTTTCATATGATCTCCG-3，反向5，-ATTTTATTGCCTTGGATG-3，。本发明的引物可以通过利用本领域技术人员公知的化学合成方法来进行的DNA 合成技术来获得。本发明提供了上述引物在鉴定珙桐种质资源中的应用。本发明提供了一种珙桐PCR鉴定方法，该方法以样品总DNA为模板，上述引物进行 PCR扩增，扩增产物经限制性内切酶进行酶切，反应结束根据琼脂糖凝胶电泳，若酶切产物为279bp大小，判定为阳性结果。本发明提供的一种珙桐PCR鉴定方法中，限制性内切酶为Acil。本发明提供的PCR鉴定珙桐的方法中，25 μ L PCR反应体系为
样品DNAlpL(10-50ng)10 χ PCR buffer (无 Mg2+ )2.5\\L25mM MgCl2IOmMdNTPs2\\LΙΟμΜ上游引物IpLΙΟμΜ下游引物IpL5U/pLTaqDNA 聚合酶O.lpLddH20\5ΛμL本发明提供的PCR鉴定珙桐的方法中，PCR的反应条件为预变性94°C、5min ；再经94°C变性30s，51°C退火40s，72°C延伸40s，35个循环；最后72°C延伸IOmin0本发明提供的PCR鉴定珙桐的方法中，20 μ L酶切反应体系为PCR产物10yL， IOXbuffer 2 μ L,内切酶 0. 5 μ L，ddH207. 5 μ L酶切反应条件为37 °C，反应池。在本发明的实施例中，PCR反应产物酶切后，用4%琼脂糖凝胶进行电泳。酶切产物大小为279bp，判定为阳性结果，其核苷酸序列见SEQ ID No. 4所示。本发明提供的PCR鉴定珙桐方法，其检测样品总DNA可以来自珙桐的种子、叶片、 珙桐加工品以及珙桐种质资源。本发明还提供了一种珙桐鉴定用试剂盒，其含有的一对引物，该引物对的核苷酸序列为正向5，-GGTTACATTTTTCATATGATCTCCG-3，反向5，-ATTTTATTGCCTTGGATG-3，。可以将本发明引物以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。本发明的试剂盒可以是由多个隔断所形成，以容纳固定一个或多个如管或小瓶的容器。这些容器之一或者多个可以装有本发明的引物，根据需要该引物可以是冻干形式或溶于缓冲液中的状态。另外， 本发明的试剂盒中还可以包括用于PCR反应的一种或多种酶/试剂，以及实施本发明所需要的其它成分及用具。
通过使用本发明的引物，对所测珙桐的DNA进行扩增，生成珙桐特异扩增片段，从而能够简单且精确地对珙桐进行鉴定。并且能有效地缩短试验时间。本研究建立了适合口岸应用的简便的珙桐检测方法，即直接从进、出境的植物类材料上检测珙桐，操作快捷、结果准确，避免了用传统的形态分类学和细胞学方法所产生的耗费时间和易疏漏的缺陷，顺应了当今口岸检测工作的特点。
图1为利用本发明引物的珙桐特异性检测实验结果，其中1 珙桐(1)，2:珙桐 (2),3 喜树，4 辣椒，5 菊花岸地黄红，6 水稻，7 鸭梨，8 水青树，9 大豆，10 攀枝花苏铁，11 福建柏，12 紫毛兜兰，13 银脉虾脊兰，14 鹅掌楸，15 云南拟单性木兰，16 观光木，17 樱桃红灯，18 马铃薯大西洋，19 油菜中双10号，20 水对照。
图2为利用本发明引物的珙桐特异性检测实验结果，其中1 喜树，2 珙桐(1)，3 珙桐(2)，M =DNA Marker DL2000。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1引物的设计
本发明通过分析珙桐与其近缘种植物atpF-atpH基因序列的基础上，利用软件 dCAPS Finder2. 0和Primer Premier 5. 0设计引物，经过多轮筛选，发现以下引物能够快速、准确地对珙桐进行定性检测。
本发明提供的检测引物的核苷酸序列
正向5，-GGTTACATTTTTCATATGATCTCCG-3，
反向5，-ATTTTATTGCCTTGGATG-3，。
实施例2总DNA的提取
(1)取0. 2 0. 3g植物组织，用硅胶保存，剪碎后置研钵中加液氮研成粉末状，移至已灭菌的1. 5mL离心管，一般加到离心管的1/3体积。
(2)在离心管中加入已在65°C预热500 μ LCTAB提取液(20g/LCTAB, 1. 4M NaCl, 0. IM Tris-HCl,20mM EDTA，pH 8.0)混勻，置于 65°C水浴锅保温 30 分钟。
C3)将样品从水浴锅中取出，加入与提取液等体积的氯仿/异戊醇04 1)，上下颠倒离心管充分混勻，12000转/分钟离心15分钟。
(4)吸取上清液置于另一已灭菌的1. 5mL离心管。
(5)再加入等体积的氯仿/异戊醇04 1)，重复步骤(3)，⑷。
(6)加入等体积或两倍体积的无水乙醇(已在_20°C预冷)，轻轻颠倒离心管混勻，置于-20°C冰箱，放置30分钟。(7) 10000转/分钟离心10分钟，倒去上清液，保留沉淀.此时的沉淀物主要为 DNA。(8)加入400 μ L 70%乙醇，10000转/分钟离心5分钟，收集沉淀。置于37°C或 50°C烘箱烘干。(9)加入 100 μ L TE (或者灭菌水)溶解 DNA，再加 2 μ L RNA 酶(10mg/mL)，37°C保温30分钟。(10) 1. 0%琼脂糖电泳检测DNA浓度及质量。实施例3PCR扩增方法的建立1、PCR反应体系以总DNA为模板，进行PCR反应，25 μ L反应体系样品DNA 1 μ L (10_50ng)， IOXPCR buffer (Mg2+free) 2. 5 μ L, 25mM MgCL2 2 μ L, IOmMdNTPs 2 μ L，10 μ M Primers 2 μ L, 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0. 1 μ L，ddH2015. 4 μ L。2、PCR反应条件将装有样品的PCR管放入ABI PCR仪后，设置如下条件进行反应预变性94°C、 5min ；再经94°C变性30s，51°C退火40s，72°C延伸40s，35个循环；最后72°C延伸lOmin。3、限制性内切酶进行酶切20yL酶切反应体系为
PCR 产物 IOpL 10 χ buffer 2μΣ 内切酶 0.5pL
ddH20 7.5μΣ ；酶切反应条件为37 °C，反应池。4、反应结束后酶切产物经过4%琼脂糖凝胶电泳判定结果，若酶切产物比PCR扩增产物415bp特异性扩增条带小，则为阳性。本实施例中，酶切产物为279bp。实施例4珙桐PCR方法的特异性确定以珙桐2份材料与其他17个植物总DNA为模板，以水为阴性对照，通过PCR反应， PCR产物酶切，酶切反应结束后用4%的琼脂糖凝胶电泳，若酶切产物比PCR扩增产物4Mbp 特异性扩增条带小的话，则可判定为阳性结果。试验结果只有珙桐和其近缘种的PCR扩增产物出现阳性扩增，而其它材料和阴性对照均没有目的扩增信号或有非特异性扩增，结果见图1。经内切酶AciI酶切后，珙桐的 PCR产物的酶切产物与其近缘种喜树的相比略小，结果见图2。
权利要求
1.珙桐PCR鉴定用引物，其特征在于，其能对珙桐的叶绿体atpF-站PH基因进行扩增， 生成珙桐特异性扩增片段。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物核苷酸序列为 正向5’ -GGTTACATTTTTCATATGATCTCCG-3’反向5，-ATTTTATTGCCTTGGATG-3’。
3.权利要求1或2所述的引物在鉴定珙桐种质资源中的应用。
4.一种珙桐PCR鉴定方法，该方法以样品总DNA为模板，利用权利要求1或2所述的引物进行PCR扩增，扩增产物经限制性内切酶进行酶切，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，25μ L PCR反应体系为样品DNA10-50ng,10 χ PCR buffer,无Mg2+2.5\\L25mM MgCl22\\LIOmMdNTPs2\\LΙΟμΜ上游引物IpLΙΟμΜ下游引物IpL5U/pLTaqDNA 聚合酶O.lpLddH20\5AμL
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR的反应条件为预变性94°C、5min;再经 94°C变性30s, 51°C退火40s, 72°C延伸40s, 35个循环；最后72°C延伸IOmin0
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，20μ L酶切反应体系为PCR产物10 μ L， IOXbuffer 2 μ L,内切酶 0. 5 μ L, ddH207. 5 μ L ；酶切反应条件为 37°C，反应 2h。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，用4%琼脂糖凝胶进行电泳。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，样品总DNA来自珙桐的种子、叶片、珙桐加工品以及珙桐种质资源。
10.一种珙桐鉴定用试剂盒，其包括，权利要求1或2所述的引物。
全文摘要
本发明提供了珙桐PCR鉴定用引物及PCR鉴定方法。本发明通过分析珙桐与其近缘种植物atpF-atpH基因，设计了dCAPS引物，所述引物核苷酸序列见序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。本发明的珙桐PCR鉴定方法，是以样品总DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，选择相应的限制性内切酶进行酶切，反应结束后根据琼脂糖电泳判定结果。本发明引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好，为珙桐物种资源的鉴定提供了检测方法。
文档编号C12Q1/68GK102559908SQ20121002440
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月3日 优先权日2012年2月3日
发明者李明福, 许瑾 申请人:中国检验检疫科学研究院