专利名称：一种利用分子标记筛选具有优良生长潜力德国镜鲤选育系的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用分子标记筛选具有优良生长潜力德国镜鲤选育系的方法。
背景技术：
德国镜鲤选育系是黑龙江水产研究所在引进的德国镜鲤原种的基础上，历时十年培育而成，其生长、抗寒、抗病力较原种均有较大提高，1996年被国家评定为良种。目前是黑龙江、吉林、辽宁、内蒙和新疆等多个省市的主要养殖鲤鱼品种。然而，近年来，由于养殖户的随意扩繁、近交等问题导致其优良性状，特别是生长性能衰退严重。因此，对生长性能进行选育改良势在必行。传统选择需要等到鲤鱼发育至商品规格，生长性状得以显现后方能进行。在东北地区，受气候条件影响，鱼类生长期短，每年只有4个月左右，在越冬期，其体重不增反降， 这给性状表现较晚的生长选育带来较大困难；此外，北方鲤鱼性成熟晚(一般需4年)，世代间隔长，这在很大程度上增加了利用子代表型性状评估亲本育种潜力的难度。上述原因导致传统表型选择办法存在选育周期长、准确性低的问题。
发明内容
本发明提供一种利用分子标记筛选具有优良生长潜力德国镜鲤选育系的方法，该方法可在早期进行选择，并提高选择的准确性。本发明利用分子标记筛选具有优良生长潜力德国镜鲤选育系的方法，按以下步骤进行一、从待测的1龄德国镜鲤选育系鳍条组织中提取基因组DNA ；二、以提取的基因组DNA为模板，以IGFlF和IGFlR为引物进行PCR扩增，获得PCR产物；三、用1.5% 的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，选择电泳结果为单条带的的PCR产物所对应的德国镜鲤选育系，即完成筛选；其中步骤二中PCR扩增所用引物IGFlF的序列为 5' -TCAGCACGCAAACGAAAGAC-3‘，引物 IGFlR 的序列为 5‘ -ACTCGATCCATTGGGGTCAG-3‘。本发明的优点本发明采用分子标记的方法，可直接对携有优良基因标记的个体进行早期选择。 使用该方法筛选的个体，其1龄体长、2龄体重，净重及体重越冬损失等性状均显著优于其他个体，该方法的准确性高，操作过程简洁，用时短。
图1是德国镜鲤选育系基因型为DD型的测序峰图；图2是德国镜鲤选育系基因型为II型的测序峰图；图3为具体实施方式
四中PCR检测结果。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式利用分子标记筛选具有优良生长潜力德国镜鲤选育系的方法，按以下步骤进行一、从待测的1龄德国镜鲤选育系鳍条组织中提取基因组DNA ； 二、以提取的基因组DNA为模板，以IGFlF和IGFlR为引物进行PCR扩增，获得PCR产物；三、 用1. 5%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，选择电泳结果为单条带的635bp的PCR产物所对应的德国镜鲤选育系，即完成筛选；其中步骤二中PCR扩增所用引物IGFlF的序列为 5' -TCAGCACGCAAACGAAAGAC-3‘，引物 IGFlR 的序列为 5‘ -ACTCGATCCATTGGGGTCAG-3‘。本实施方式步骤一所述的提取基因组DNA的方法为常规方法。本实施方式采用分子标记的方法，可直接对携有优良基因标记的个体进行早期选择。使用该方法筛选的个体，其1龄体长、2龄体重，净重及体重越冬损失等性状均显著优于其他个体，该方法的准确性高，操作过程简洁，用时短。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中PCR扩增的反应体系为20 μ L反应体系，由下列成分组成
成分用量
100ng/|iL 基因组 DNA\μL
ΙΟμΜ 引物 IGFlF
0.6|iL
5'-TCAGCACGCAAACGAAAGAC-3' ΙΟμΜ 引物 IGFlR
0.6|iL
5'-ACTCGATCCATTGGGGTCAG-3'
ΙΟχΓα Buffer2μL
MgCl21.6|iL
IOmMdNTPs0.4|iL
5\J/μL Taq DNA 聚合酶0.1 μL
去离子水13.7|iL
ο其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤二中PCR扩增的条件为94°C变性5min，94°C变性30s，59°C退火15s，72°C延伸45s，共30个循环，再 72°C延伸5min，4°C保温。其它与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式利用分子标记筛选具有优良生长潜力德国镜鲤选育系的方法，按以下步骤进行一、从待测的1龄德国镜鲤选育系鳍条组织中提取基因组DNA ； 二、以提取的基因组DNA为模板，以IGFlF和IGFlR为引物进行PCR扩增，获得PCR产物；三、 用1. 5%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，选择电泳结果为单条带的635bp的PCR产物所对应的德国镜鲤选育系，即完成筛选；其中步骤二中PCR扩增所用引物IGFlF的序列为 5' -TCAGCACGCAAACGAAAGAC-3‘，引物 IGFlR 的序列为 5‘ -ACTCGATCCATTGGGGTCAG-3‘。
4
本实施方式步骤一中基因组DNA的提取方法为酚氯仿法，具体如下(1)取待测德国镜鲤选育系的鳍条组织50mg，剪碎后置于1.5mL EP管内，加入 600 μ L组织提取液和8 μ L蛋白酶K，在55°C 140rpm的摇床上过夜消化；(2)加入RnaseA至终浓度为20 μ g/ μ L，37°C消化1小时；(3)加入600 μ L Tris饱和酚上下颠倒10分钟，然后12000rpm离心10分钟，取上层水相，加入等体积酚-氯仿-异戊醇04 23 1)，混合10分钟；(4) 12000rpm离心10分钟，取上层水相，加入等体积氯仿-异戊醇03 1)，混合 10分钟；(5) 12000rpm离心10分钟，取上层水相，加入2倍体积的无水冰乙醇(_20°C )，水平摇30次，出现白色絮状物；(6) IOOOOrpm离心10分钟，管底可见白色DNA沉淀，加入800 μ L体积浓度70%的冰乙醇洗涤DNA沉淀，8000rpm离心5分钟，倒掉乙醇，自然干燥；(7)加适量的TE缓冲液，至于55°C的水浴锅中溶解DNA，工作液在4°C保存，储存液-20°C保存。本实施方式步骤二中PCR扩增的反应体系为20 μ L反应体系，由下列成分组成
成分用量
100ng/|iL 基因组 DNA\μL
ΙΟμΜ 引物 IGFlF
0.6|iL
5'-TCAGCACGCAAACGAAAGAC-3'
ΙΟμΜ 引物 IGFlR
0.6|iL
5'-ACTCGATCCATTGGGGTCAG-3'
ΙΟχΓα Buffer2μL
MgCl21.6|iL
IOmMdNTPs0.4|iL
5\J/μL Taq DNA 聚合酶0.1 μL
去离子水13.7|iL本实施方式步骤二中PCR扩增的条件为94°C变性5min，94°C变性30s，59°C退火 15s，72°C延伸45s，共30个循环，再72°C延伸5min，4°C保温。为验证本实施方式的效果，进行以下实验1、对同期孵化、同池饲养的德国镜鲤选育系子代群体进行研究，于135天(越冬前)选择600尾个体进行性状检测，并剪取1小块鳍条组织置75%酒精中，随即转入-80°C 备用，同时对每尾鱼进行电子标记，以跟踪其在越冬期及越冬后的生长情况。接着，于325 天(越冬后)对越冬后的标记个体进行性状检测，并随机选择300尾个体进行2龄养殖，于 385天和445天分别检测每尾子代标记个体的生长状况，在445天检测相关性状后将鱼杀死，通过观察性腺形态来鉴定性别，取性腺称重，取出所有内脏称鱼体净重。
2、根据GenBank发布的鲤鱼类胰岛素生长因子I(IGFl)的基因序列(GenBank ID :AF465830)设计一对引物，其序列为IGF1F 5' -TCAGCACGCAAACGAAAGAC-3‘和 IGFlR 5' -ACTCGATCCATTGGGGTCAG-3‘。对所有鳍条样本提取基因组DNA。选择体重相差悬殊个体各6尾，利用它们的基因组DNA为模板，以引物IGFlF和IGFlR进行PCR扩增，对PCR产物进行克隆测序来检测IGFl基因3’调控区是否存在变异座位，结果经过测序分析检测到该区域存在一个79bp具有插入/缺失多态性的座位，包含有该79bp插入序列的DNA序列如序列表中的SEQ ID NO :3所示，缺失该79bp序列的DNA序列如序列表中的SEQ ID NO: 4所示，该79bp序列的插入位点为SEQ ID NO 4中序列的384bp与385bp之间。将包含该 79bp插入序列的个体命名为II型，缺失该79bp序列的个体命名为DD型，杂合子同时包含该插入/缺失片段，命名为ID型。其中DD型的测序峰图如图1所示，图中箭头处为该79bp 序列的插入位置。II型的测序峰图如图2所示，图中黑框内的序列即为该79bp插入序列。随后在2 尾德国镜鲤选育系群体中直接按照本实施方式的方法进行PCR分型检测，结果显示有63尾为II型，58尾为DD型，108尾ID型。其中19尾的检测结果如图3所示，图中M为DL2000 Maker, C为阴性对照，II型为一条714bp的条带，DD型为一条63^ρ 的条带，ID型为635bp和714bp的两条条带。将基因型同生长性状进行连锁分析，统计模型为Y= μ+G+S+e，其中Y为生长性状的表型值，μ为群体均值，G为基因型固定效应，S为性别固定效应，e为剩余效应。结果见表1。表 权利要求
1.一种利用分子标记筛选具有优良生长潜力德国镜鲤选育系的方法，其特征在于利用分子标记筛选具有优良生长性状德国镜鲤选育系的方法，按以下步骤进行一、从待测的1 龄德国镜鲤选育系鳍条组织中提取基因组DNA ；二、以提取的基因组DNA为模板，以IGFlF 和IGFlR为引物进行PCR扩增，获得PCR产物；三、用1. 5%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，选择电泳结果为单条带的635bp的PCR产物所对应的德国镜鲤选育系，即完成筛选；其中步骤二中PCR扩增所用引物IGFlF的序列为5 ‘ -TCAGCACGCAAACGAAAGAC-3 ‘，弓| 物 IGFlR 的序列为 5' -ACTCGATCCATTGGGGTCAG-3‘。
2.根据权利要求1所述的一种利用分子标记筛选具有优良生长潜力德国镜鲤选育系的方法，其特征在于步骤二中PCR扩增的反应体系为20 μ L反应体系，由下列成分组成成分用量100ng/|iL 基因组 DNA\μLΙΟμΜ 引物 IGFlF0.6|iL5'-TCAGCACGCAAACGAAAGAC-3' ΙΟμΜ 引物 IGFlR0.6|iL5'-ACTCGATCCATTGGGGTCAG-3'ΙΟχΓα Buffer2μLMgCl21.6|iLIOmMdNTPs0.4|iL5\J/μL Taq DNA 聚合酶0.1 μL去离子水13.7|iLο
3.根据权利要求1或2所述的一种利用分子标记筛选具有优良生长潜力德国镜鲤选育系的方法，其特征在于步骤二中PCR扩增的条件为94°C变性5min，94°C变性30s，59°C退火 15s，72°C延伸45s，共30个循环，再72°C延伸5min，4°C保温。
全文摘要
一种利用分子标记筛选具有优良生长潜力德国镜鲤选育系的方法，涉及一种利用分子标记筛选具有优良生长潜力德国镜鲤选育系的方法。本发明提供一种利用分子标记筛选具有优良生长潜力德国镜鲤选育系的方法。方法一、从待测的德国镜鲤选育系鳍条组织中提取基因组DNA；二、以提取的基因组DNA为模板，以IGF1F和IGF1R为引物进行PCR扩增，获得PCR产物；三、用1.5％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，选择电泳结果为单条带的635bp的PCR产物所对应的德国镜鲤选育系，即完成筛选。本发明采用分子标记的方法，可直接对携有优良基因标记的个体进行早期选择，准确性高，操作过程简洁，用时短。
文档编号C12Q1/68GK102534021SQ20121002433
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月3日 优先权日2012年2月3日
发明者李池陶, 石连玉, 胡雪松, 贾智英 申请人:中国水产科学研究院黑龙江水产研究所