专利名称：4×Tβ4基因以及在烟草中表达4×Tβ4蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种融合基因、其表达载体及在植物中表达融合蛋白的方法，具体涉及一种4XT0 4基因、其表达载体以及在烟草中表达4XTP 4融合蛋白的方法。
背景技术：
研究表明胸腺肽P 4 (thymosin P 4, T P 4)是真核生物细胞中的一种重要的G-actin螯合因子(G-actin sequestering factor),有许多重要生理学和细胞学功能(Goldstein等.分子医学进展，2005，11 :421-429)，包括促进细胞迁移、血管形成、细胞存活、干细胞分化、调节细胞因子、趋化因子、特殊蛋白酶、上调细胞质分子的基因表达和下调核转录因子基因表达(Huff等.2001，生物化学和细胞生物学国际期刊，33 :205-220)。在皮肤疾病、眼角膜疾病、心脏病、中枢神经系统疾病和肺病临床和应用中有着重要的作用。目前科学研究和医用的TP 4的来源主要有两种一是从小牛胸腺提取，二是化学合成。从小牛胸腺中提取T3 4不仅成本高，且受材料来源和提取技术的限制，其纯度不高，含量较低；同时由于人畜共患疾病，从动物牛胸腺中提取的T P 4在临床应用存在风险。T P 4化学合成技术的成本高，因此也限制了该方法的应用。随着基因工程的发展，利用基因工程手段生产T ^ 4成为可能，也将成为一个新的方向。基因工程手段生产重组T P 4蛋白，可以克服生物原材料提取率低或化学合成成本高的缺点。文献《生物化学与生物物理学报，2002，34 (4) :502_505》用大肠杆菌克隆表达了Te 4，其表达水平达菌体总蛋白30%，但其纯化步骤较为复杂，分别经过了硫酸铵盐析、SourceRPC反相柱层析和Q Sepharose HP阴离子交换柱来纯化目的蛋白。文献《东南大学学报(医学版)，2007，26 (4) :295-298》研究了在大肠杆菌中高效表达6XHis-TP4，融合蛋白产量达菌体总蛋白的40%，表达产物经过一步镍柱亲和层析即可获得分离纯化。文献《第四军医大学学报，2008，29 (16) :1451-1454》选用真核分泌型表达载体Psec Tag2B，并采用脂质体转染技术瞬时转染真核SW480细胞,采用Western blot法检测TP 4重组蛋白的表达，实现在真核细胞中表达。植物是外源蛋白高效表达和可实现靶蛋白正确修饰的高级表达系统，用转基因植物生产TP 4具有易规模化、低成本和安全特点。现有技术尚未有用植物系统表达4XT P 4的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种4XT P 4基因、其表达载体、4XT@ 4融合蛋白以及在烟草中表达4XT@ 4融合蛋白的方法。将人工合成的T3 4基因在体外完成串联形成四联体即4XTP4，并且利用基因工程方法在4XTP4基因添加His6-tag。通过构建植物表达载体，再采用基因工程方法转化到烟草，在植物中表达6XHis-4XTP 4融合蛋白，该蛋白在皮肤和眼角膜伤口治愈和修复方面具有重要的生物活性和功能。本发明是通过以下技术方案实现
一种4 X T 4基因，其喊基序列如SEQ ID NO. 2所不。一种重组载体，包括目的基因和载体，所述目的基因的碱基序列如SEQ ID NO. 2所示，所述载体选自质粒、粘粒或、噬菌体中的一种。一种如下(a)或(b)的蛋白质(a)由SEQ ID N O. 4所示的氨基酸序列组成的蛋白质，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有促细胞增殖活性的由(a)衍生的蛋白质。一种在烟草系统中表达4XTP4功能蛋白的方法，该方法包括以下步骤步骤(一)、依据现有技术中TP 4多肽的一级结构，按植物偏爱密码子，同时考虑到载体构建和目标基因TP 4融合而引入相应的限制性内切酶位点，设计合成TP 4基因的核苷酸序列(168bp)；步骤(二)、通过两次酶切和连接，实现所述4XTP 4(588bp)的融合；步骤(三)、通过设计PCR引物在所述4XTP4基因中引入His6_tag，获得含有His6-tag的基因6 X His-4X T P 4 (619bp)，连接到T载体中，然后通过酶切与连接将所述基因6 XHis-4XT P 4克隆到植物表达载体中，通过测序或酶切鉴定，在确保所述表达载体目的基因阅读框架正确前提下，将所述表达载体用冻融法导入根癌农杆菌中，获得携带所述基因6XHis-4XTP4的根癌农杆菌；步骤(四)、将烟草种子表面灭菌后播种于发苗培养基上，取生长2周的无菌烟草叶片作为外植体用于转化所述根癌农杆菌；步骤(五)、提取4XT34功能蛋白。优选的，在所述步骤(四)中，所述转化包括以下步骤步骤(I)，将所述含有目的基因表达载体的根癌农杆菌于28°C摇菌培养至0D_为0. 8 I. 0,室温6000rpm离心5 8分钟；步骤(2)，弃上清，菌体用液体MS培养基重悬，然后加入所述外植体浸泡8 10分钟；步骤(3)，将浸染结束后的所述外植体取出，吸去表面残余菌液，然后将所述外植体置于共培养培养基上在25°C共培养36小时；步骤(4)，共培养结束后将所述外植体转移到分化培养基上，在25 28°C光照下培养至分化芽长出；步骤(5)，当所述分化芽长至3-4厘米时，将其切下移植到生根培养基上进行生根培养7 10天；步骤(6)，所述分化芽形成完整根系后，将植株取出，用自来水洗去附着在根系上的固体培养基，在珍珠岩中驯化并用质量体积百分比为I %的MS粉水溶液补充营养和水分，7天后移入土中。优选的，在所述步骤(五)中，所述提取包括以下步骤步骤(a)，取5g转基因烟草叶片，在液氮中研成粉末，转移至50mL聚丙烯离心管中，加入 5mL 预冷的 I X PBS (KH2PO4O. 2g/L, Na2HPO4L 15g/L, KCl 0. 2g/L, NaCl 8g/L)，悬浮后冰上放置2-3 ；步骤(b)，4°C条件下13000rpm离心30分钟；
步骤(c)，收集上清于干净离心管中保存；步骤(d),按照Bradford法进行蛋白定量分析，取2 ii L上述蛋白样品加98 u LBradford试剂混匀后，在酶标仪下(Bio_TEK，USA)测OD595的吸光值。优选的，所述发苗培养基的组分及各组分的质量百分比为MS粉0.44%、蔗糖3%、烟草凝胶0. 26%，余量为蒸馏水；所述发苗培养基的pH值为5. 8。优选的，所述液体MS培养基的组分及各组分的质量百分比为MS粉0. 22%、蔗糖为3 %，余量为蒸馏水；所述液体MS培养基的pH值为5. 8。优选的，所述共培养培养基的组分及各组分的质量百分比为MS粉0.44%、蔗糖3%、烟草凝胶0. 26%,6-苄氨基嘌呤0. 0001 %、a -萘乙酸0. 00001%，余量为蒸馏水；所述共培养培养基的PH值为5. 8。
优选的，所述分化培养基的组分及各组分的质量百分比为MS粉0.44%、蔗糖3%、烟草凝胶0. 26%,6-苄氨基嘌呤0. 0001%, a -萘乙酸0. 00001 %、卡那霉素0. 005%,羧苄青霉素0. 025%，余量为蒸馏水；所述分化培养基的pH值为5. 8。优选的，所述生根培养基的组分及各组分的质量百分比为MS粉0.22%、蔗糖3%、烟草凝胶0. 26%,6-苄氨基嘌呤0. 0001%, a -萘乙酸0. 00001 %、卡那霉素0. 005%,羧苄青霉素0. 025%，余量为蒸馏水；所述生根培养基的pH值为5.8。本发明提供了一种4XTP 4蛋白生产的新方法，本发明提供的方法按植物偏爱密码子设计合成的6XHis-4XTP 4基因在烟草系统中表达融合蛋白，该蛋白在皮肤和眼角膜伤口的治愈和修复方面具有重要的生物活性和功能。本发明还提供了一种检测、分析再生烟草基因组DNA样品中是否存在6 XHis-4 X T P 4基因，蛋白样品中是否含有6XHis-4XTP 4蛋白的研究方法。本发明提供的方法具有易规模化、低成本和安全的特点。
图I是转基因烟草聚合酶链式反应(PCR)检测结果图；图2是转基因烟草DNA分子杂交(Southern blot)分析图；图3是实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(REAL TIME-PCR)检测转基因烟草中4XT 0 4基因转录水平的表达不意图；图4是转6Xhis_4XTP4基因烟草总可溶蛋白SDS-PAGE电泳图；图5是转6Xhis_4XTP4基因烟草总可溶蛋白的免疫印迹(Western blot)分析图；图6是酶联免疫吸附分析(ELISA)检测转基因烟草6Xhis_4XT P 4蛋白水平表达量示意图；图7是转基因烟草表达的4XTP 4蛋白的促淋巴细胞增殖及细胞活性测定(MTT)的结果图。
具体实施例方式下面对本发明实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Samtoook等分子克隆实验室手册(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例IT 0 4基因的合成及载体构建(I)基因合成本发明的按植物偏爱密码子设计合成的168bp的TP 4基因(包括保护碱基和酶切位点组成的接头)，其序列如SEQ ID NO. I所示；合成之后连入pUC57载体，SPPUC57-T3 4。(2)4XT3 4 构建
根据Xba I和Spe I的同尾酶特点，通过两次酶切和连接，将Xba I和Sac I酶切的小片段联入由SpeI和SacI酶切的大片段中，实现4XTP 4(592bp)的融合，并命名为PUC57-4XT3 4。(3)植物表达载体构建用KOD plus 酶以 pUC57_4XT @ 4 质粒为模板，用引物Tbeta4Fl (5 ' ggggatccatgcaccaccaccaccaccacggtaccatgtctagaatgtctga3 ' )和 Tbeta4Rl(5 ' ccgagctcttaactagtcataga 3 ')进行PCR扩增获得带6 X His编码序列的目的融合基因6XHis-4XTM(619bp)，将PCR产物经回收后连接至pMD18_T载体中，命名为pMD18-6XHis-4XTP 4，并通过测序确认；用BamHI 和 SacI 双酶切质粒 pMD18_6XHis_4XT P 4，回收 613bp 片段；用 BamHI和SacI双酶切质粒p2300-35S-hIGF，回收大片段；连接上述两个片段并转化大肠杆菌DH5 a，所得载体命名为P35S: :6XHis-4XTP4，用PCR方法检测转化的大肠杆菌，从而获得阳性克隆。(4)植物表达载体p35S: :6XHis-4XT3 4的检测随机挑取抗性单菌落在含有相应抗生素(100mg/L Kan) LB液体培养基中培养。菌液达到一定浓度(0D_ = 0. 5 0. 8)后对目的基因进行PCR检测；PCR 扩增体系 25 U L,包括引物 p35s (5' -ttc gtc aac atg gtg gag ca~3')和Noster (5' -aagacc ggc aac agg att ca~3')各 I U L (10 U mol/L)，0. 3 U L Taq DNA 聚合酶(5units/ ii L)，2. 5 ii L 的 10 X PCR 缓冲液，I. 5 y L 的 MgCl2 (25mmol/L) ,2u L 模板(待检菌液)，I. 5 ii L的dNTPs (2. 5mmol/L), 15. 2 u L去离子无菌水，上覆20 u L灭菌石腊油；PCR 条件94 0C IOmin ；94 °C 45s, 60 °C 45s, 72 °C 45min, 35 次循环；72 °C 延伸IOmin ;电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1140bp。实施例26XHis_4XTP4在烟草细胞中的表达I、含目的基因(4XTP4)表达载体的构建用BamHI和SacI双酶切质粒pMD18_4XTP 4，回收613bp片段获得带有His-tag并且有相应粘性末端的目的基因4XTP 4，然后将其克隆到植物表达载体pCAMBIA2300 (不限于此，也包括如PBI121或改造过的pCA2300-twin等植物表达载体)中，通过测序或酶切鉴定，在确保表达载体中的目的基因阅读框架正确的前提下，再将表达载体质粒用冻融法转入农杆菌EHA105中，并通过农杆菌介导法转化烟草。2、烟草遗传转化将灭菌后的烟草种子播于发苗培养基上，取生长两周的烟草的无菌叶片，作为外植体用于转化；将含有目的基因表达载体的工程菌于28°C摇菌培养至0D_ = 0. 8 I. 0时，室温6000g离心5 8分钟；
弃上清，菌体用液体MS培养基重悬，然后加入准备好的外植体浸泡8 10分钟；将浸染结束后的外植体取出，吸去表面残余菌液；然后将外植体置于共培养培养基上在25°C共培养36小时；共培养结束后将外植体转移到分化培养基上，在25 28°C光照下培养，培养7 15天可见愈伤组织的形成，约20天后可见分化芽长出；待再生芽长至约3-4厘米时，将其切下移植到生根培养基上进行生根培养，7 10天左右生根；根系发达后，将植株取出，用无菌水洗去附着在根系上的固体培养基，在珍珠岩中驯化并用质量体积百分比为I %的MS粉水溶液补充营养和水分，一周后移入土中。3、转基因烟草PCR检测基因组DNA提取用CTAB法提取烟草基因组DNA (Stewart and Via，1993)，取50ng烟草基因组DNA作模板进行PCR检测；PCR 扩增体系 25 U L,包括引物 P35s (5，-ttc gtc aac atg gtg gag ca_3’)和Noster (5，-aagacc ggc aac agg att ca_3，)各 I U L (10 U mol/L)各 I U L (10 U M/L)，0. 3u L Taq DNA 聚合酶(5units/y L)，2. 5 y L 的 10 X PCR 缓冲液，I. 5 y L 的 MgCl2 (25mmol/L), 2 u L 烟草基因组 DNA 模板(50ng), I. 5 y L 的 dNTPs (2. 5mmol/L), 15. 2 u L 去离子无菌水，上覆20 ii L灭菌石蜡油；PCR 条件-MV 8min ；94°C 45s, 55°C 45s, 72°C lmin，35 次循环;72°C延伸 8min ;电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1140bp ；PCR产物检测用带有 EB(ethidium bromide)的 1.0% (w/v)琼脂糖胶在 IXTAE电泳缓冲液中电泳，然后在凝胶成像系统紫光下检测并拍照，如图I所示，其中，泳道M为DL2000DNA分子量标准；泳道P为含载体质粒p35S: :6Xhis-4XT^4的农杆菌EHA105作模板的阳性对照；泳道ck为非转基因烟草的阴性对照；其它泳道为独立的转基因烟草植株1-15。4、转基因烟草Southern blot分析(I)烟草基因组DNA提取和转膜用CTAB 法提取烟草嫩叶基因组 DNA(Stewart and Via, 1993), Hin d III 酶切30 ii g烟草基因组DNA，I %琼脂糖胶电泳分离并转移到Hybond N+膜上(AmershamPharmacia, Uppsala, Sweden)。(2)探针标记、杂交和信号检测以质粒P35S:: 6 X Hi s-4 X T 3 4为模版扩增得到含4 X T 3 4基因DNA片段，用于探针标记；探针标记、杂交和信号检测使用Gene Images Random Primer Labeling method和 CDP-Star detection module 试剂盒(Amersham Pharmacia),按其操作说明书指导进行。在55°C杂交12小时后，用洗膜液I(1XSSC和0. 1% SDS)在62 °C下洗杂交膜2次(各15分钟)，然后用洗膜液II (0.5X SSC和0. 1% SDS)在55°C下洗杂交膜I次(15分钟)；滴加显色液后将杂交膜置于富士 X-光片上暴光2-3小时检测杂交信号，如图2所示，其中，左侧数字是与酶切基因组DNA共分离的入/Hind III的DNA分子量标准；泳道P为p35S::6Xhis-4XT^4质粒作模板的阳性对照；泳道ck为非转基因烟草植株；I、2、3、4、5、7、8为独立的转基因烟草植株。5、通过荧光定量 PCR(Real-Time Quantitative PCR, RT-QPCR)检测6XHis-4XTP4在转基因烟草中转录水平的相对表达量⑴RNA提取按植物抽提试剂盒(天根生化科技有限公司，上海)厂家说明抽提烟草叶片总RNA, RNA模板预先用DNase I (RNase-free, TaKaRa)处理以去除来自于烟草基因组DNA的污染。(2)反转录反应制备cDNA按TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)(宝生物工程(大连)有限公司)厂家说明进行烟草叶片总RNA反转录,反转录体系10 V- L,包括2 V- L的5XPrimeScript Buffer(forreal time), 0. 5 u L 的 PrimeScriptTMRT Enzyme Mix 1,0. 5 u L 的 Random 6 mers (100 u M),
0.5 u L 的 Oligo dT Primer (5OmM) ,lug 的总 RNA,用 RNase Free ddH20 补足到 10 u L,反应液需要在冰上配制；所需的反转录反应条件为37°C, 15min(反转录反应)；85°C, 5s (反转录酶的失活反应)。(3)标准曲线的制作将转基因烟草叶片组织总RNA反转录成的cDNA，取2 ii L用EASY Dilution (TaKaRaCode D9160, Shiga, Japan)分别稀释成(单位ng/ u L) :50,5,0. 5,0. 05,0. 005 的浓度各取 2 ii L 作为模板，在 Peltier Thermal Cycler PTC200PCR 仪(BioRed, Watford, UK)上进行反应。PCR反应液组份体系25 u L，包括12. 5 ii L的SYBR PremixEx Taq (2X), I ii L的PCR Forward Primer (10 U M), I u L 的 PCR Reverse Primer (10 U M), 2 u L 的 cDNA,用 RNaseFree ddH20补足到25 u L，反应液的配制需要在冰上进行；PCR反应条件如下95°C变性20s ;95°C变性15s，58°C退火15s，72°C延伸25s，重复27个循环；最后70-95°C延伸10s。反应结束后确认Real-time PCR的扩增曲线和融解曲线，制作标准曲线。(4)用qRT-PCR检测6XHis_4XT0 4在转基因烟草中转录水平的相对表达量以cDNA为模板，按照标准曲线，采用确定的稳定反应体系和最适的稀释倍数，一般采用cDNA稀释100倍后作为模板。以目的基因基因引物Tbeta4Fl (5' ggggatccatgcaccaccaccaccaccacggtaccatgtctagaatgtctga3')和Tbeta4Rl(5' ccgagctcttaactagtcataga 3')以及内源基因泛素(ubiquitin)的引物 UbiF (5aagacctacaccaagcccaa3 ')和UbiR(5; aagtgagcccacacttacca3')作为Real-time PCR的引物,按照标准曲线制作方法配制PCR反应液，反应条件和融解曲线条件不变进行Real-time PCR,每个实验组做6个平行。实验结束后，将数据导出，采用Ct比较法用Microsoft Office Excel计算目的基因在组织中的相对表达量。转基因烟草中4XTP4基因转录水平的表达结果如图3所示，其中
1、2、3、4、5、7、8为独立的转基因烟草植株。6、用western blot检测6XHis_4XTP 4蛋白在转基因烟草叶片中的表达(I)蛋白提取(冰浴中进行)
取5g烟草叶片，在加有液氮的研钵中研磨成粉末，然后转移至50mL聚丙烯离心管中，并加入 5mL 预冷的 I XPBS (KH2PO4O. 2g/L, Na2HPO4115g/L, KCl 0. 2g/L, NaC18g/L)，悬浮后冰上放置2-3h ；13000rpm 4°C 离心 30 分钟；收集上清于另一新离心管中备用。(2)蛋白定量 按照Bradford 法(Bradford, 1976),取 2 U L 蛋白样品加 98 U L Bradford 试剂混匀后，在酶标仪下(Bio-TEK，USA)测OD595的吸光值。(3) SDS-PAGE 分离蛋白样品中加入等体积的含50mM DTT加样缓冲液(2 X加样缓冲液甘油2. 4g，IMTris-HCl pH6. 81mL,溴酚兰0. 01 %，H2O定容至20mL)，沸水浴10分钟后置于冰上，冷却后上样；4°C冰箱中在100V电压下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，直到指示剂(溴酚兰)前沿达到凝胶底部；聚丙烯酰胺凝胶，其中一块用于考马斯亮兰(W:v = 2.5%)染色，另一块用于Westernblot分析。转6 Xhis_4X T P 4基因烟草总可溶蛋白SDS-PAGE电泳结果如图4所示，其中泳道M为蛋白分子量标准；泳道ck为源自非转基因烟草叶片的总可溶蛋白；其它泳道源自转基因烟草株系1，2，3，4，5，6，7总可溶蛋白；泳道+为用大肠杆菌表达的6Xhis-4XTP4蛋白；左侧的数据为蛋白分子量大小标准。(4)蛋白质向PVDF膜上转移转移之前，用转移缓冲液(39mM甘氨酸，48mM Tris Base，0. 037% SDS，20%甲醇)平衡凝胶和PVDF膜30分钟；室温下用半干式电转仪转移Ih,凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸。(5) PVDF膜蛋白检测将PVDF膜浸在封闭液中，37 °C缓慢摇动、封闭60分钟(封闭液取5g脱脂奶粉溶于IOOmL的1父？85(含0.58叠氮钠))；再将滤膜浸泡在洗涤缓冲液中，37°C洗涤2次，每次15分钟；加入第一抗体(抗his-tag的抗体)，37°C温育30分钟，洗涤3次，洗涤方法同上所述；加入第二抗体(亲和素-碱性磷酸酶复合物)，37°C温育30分钟，洗涤两次，洗涤方法同上所述；加入底物显色观察蛋白条带，免疫印迹分析的结果如图5所示，其中泳道M为蛋白分子量标准；泳道ck为源自非转基因烟草叶片的总可溶蛋白；其它泳道源自转基因烟草株系1，2，3，4，5，6，7总可溶蛋白；泳道+为用大肠杆菌表达的6Xhis-4XTP4蛋白；左侧的数据为蛋白分子量大小标准。7、转6XHis_4XTP 4基因烟草的ELISA分析采用ELISA方法检测转基因烟草叶片中6XHis-4XTP 4蛋白的含量，具体操作方法如下(I)包被包被酶标板(聚苯乙烯板)时，酶标板每孔加入75 ii L包被液，25 ii L蛋白质提取液，37°C温 育过夜后，倾尽各孔的液体；(2)洗板用TPBS缓冲液150 y L洗漆3次，每次5min。TPBS缓冲液需37°C预热，最后一次拍干孔内液体；(3)封闭每孔加封闭液IOOii L，37°C温育I 2h ;(4)洗涤用TPBS缓冲液150 y L洗漆3次，每次5min ；(5)与第一抗体反应每孔分别加入IOOii L的第一抗体(小鼠抗his-tag单克隆抗体，I 10000)，37°C温育 I. 5 2h ;(6)洗涤用TPBS缓冲液150 y L洗漆3次，每次5min ；(7)与第二抗体反应每孔分别加入IOOii L第二抗体(山羊抗小鼠抗体-AP，I 5000)，37°C温育 I. 5 2h ;(8)洗涤用TPBS缓冲液150 y L洗漆3次，每次5min ；(9)显色每孔加显色剂IOOii L，37°C温育IOmin ；(10)测定吸光值用酶标仪测定410nm的光吸收值。ELISA检测转基因烟草6Xhis-4XTP4蛋白水平表达量的结果如图6所示，其中1、2、3、4、5、7、8为独立的转基因烟草植株。8、烟草表达的4XTP4蛋白的生物活性检测用MTT法检测烟草表达的4 X T M蛋白的生物活性(Mosmann，T. (1983)J. Immunol. Methods 65,55-63)。具体操作步骤如下(I)用PBS法提取转基因和非转基因烟草叶片总可溶蛋白，经滤膜(Millipore，0. 45 u m)除菌后，用1父？85将浓度调整至0.51^/1^;(2)将Balb/c小鼠浸入到乙醚中，取出后用大头钉固定在无菌平板上，用无菌剪刀、镊子剪开腹部皮肤，打开腹腔，取出脾脏；(3)将脾脏放在200目的铜网上，充分研磨，一边研磨一边用含有RPMI1640(完全)培养基冲洗；(4) IOOOrpm 离心 IOmin,弃上清；(5)细胞沉淀用2mL红细胞裂解液悬浮，吹打5min左右使其充分裂解，加入8mLGKN 缓冲液(NaCl 8g, KCl 0. 4g, Na2HPO4 2H20 I. 77g, NaH2PO4 H2O 0. 69g,葡萄糖 2g,酚红0. Olg，溶于1000ml双蒸水中)终止反应；(6) IOOOrpm 离心 IOmin,弃上清；(7)沉淀中加入RPMI1640培养基IOmL，洗两次；(8)用RPMI1640培养基IOmL悬浮，显微镜下血球计数板计数，调整细胞密度为IO5个/mL ；(9)按照IO5个/mL细胞密度加在96孔板上培养；(10)反应体系试验设空白对照组(I X PBS)、阳性对照组(TM蛋白，购自上海吉尔生化)、提取不同转基因烟草株系果实的蛋白作为样品组、以未转基因烟草蛋白为阴性对照组。在含有淋巴细胞的96孔培养板中加入标准的阳性蛋白TP 4(1. Oii g) IOOii L和过滤灭菌后的转基因烟草蛋白样品和未转基因烟草蛋白样品各lOOyL，对照孔加入IXPBS100 u L，每个实验组设5个重复；(11)轻轻混匀后，置5% C02、37°C孵箱中培养24h ；
(12)在无菌条件下向每孔加MTT(5mg/mL母液)溶液10 y L，轻轻混匀，继续培养4h ；(13)在倒置显微镜(Olympus CKX31，Japan)下定期地观察96孔板细胞，当有清晰可见的紫色沉淀产生时，每一孔中加入150 ii L的DMSO (dimethyl sulfoxide),随后轻轻地摇动96孔板，并将96孔板在室温下(黑暗)放置15分钟；(14)在酶标仪(Bio-TEK，USA)读OD57tl的吸光值，以样品剂量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。(15)依据所测定的OD57tl值，利用公式计算促细胞增殖率。促细胞增值率(％ ) = (0D y；验-OD对照)/OD y；验 转基因烟草的4XTP4蛋白生物活性的MTT检测结果如图7所示，其中，4XT ^ 4 (tobacco)为转6Xhis_4XT P 4烟草叶片总可溶性蛋白的促淋巴细胞增值率；TM(GLBiochem)为购于上海吉尔生化的T @ 4的促淋巴细胞增值率；CK为非转基因烟草叶片总可溶性蛋白促淋巴细胞增值率。实验结果显示转6Xhis-4XTP4烟草叶片总可溶性蛋白的促淋巴细胞增值率为28. 59%，购于上海吉尔生化的TP 4的促淋巴细胞增值率为
8.49%，非转基因烟草叶片总可溶性蛋白促淋巴细胞增值率为O。结果表明通过烟草表达的6Xhis-4XTP 4蛋白对小鼠脾脏淋巴细胞具有明显的促进增殖的生物学作用。
权利要求
1.一种4XTP 4基因，其碱基序列如SEQ ID NO. 2所示。
2.一种蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
3.—种重组载体，包括目的基因和载体，其特征在于，所述目的基因的碱基序列如SEQID NO. 2所示,所述载体选自质粒、粘粒或\噬菌体中的一种。
4.一种在烟草系统中表达4XTP 4功能蛋白的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤 步骤一，将含有权利要求I所述4XT P 4基因的克隆载体质粒进行酶切，回收所述.4X T P 4基因的DNA片段，获得带有相应粘性末端的所述4 X T P 4基因，然后将所述带有相应粘性末端的4XTP 4基因克隆到烟草表达载体中，通过测序或酶切鉴定，在确保所述表达载体中的所述目的基因4XTP 4的阅读框架正确的前提下，再将所述表达载体用冻融法导入根癌农杆菌中，获得携带所述目的基因4XTP4的根癌农杆菌； 步骤二，将灭菌后的烟草种子播于发苗培养基上，取生长两周的无菌叶片，作为外植体用于转化所述根癌农杆菌； 步骤三，提取4XT@4功能蛋白。
5.根据权利要求4所述的在烟草系统中表达4XTP4功能蛋白的方法，其特征在于，在所述步骤二中，所述转化包括以下具体步骤 步骤I，将所述含有目的基因表达载体的根癌农杆菌于28°C摇菌培养至0D_为0. 8 I.0,室温6000rpm离心5 8分钟； 步骤2，弃上清，菌体用液体MS培养基重悬，然后加入所述外植体浸泡8 10分钟； 步骤3，将浸染结束后的所述外植体取出，吸去表面残余菌液，然后将所述外植体置于共培养培养基上在25°C共培养36小时； 步骤4，共培养结束后将所述外植体转移到分化培养基上，在25 28°C光照下培养至分化芽长出； 步骤5，当所述分化芽长至3-4厘米时，将其切下移植到生根培养基上进行生根培养.7 10天； 步骤6，所述分化芽形成完整根系后，将植株取出，用自来水洗去附着在根系上的固体培养基，在珍珠岩中驯化并用质量体积百分比为I %的MS粉水溶液补充营养和水分，7天后移入土中。
6.根据权利要求4或5所述的在烟草系统中表达4XTP 4功能蛋白的方法，其特征在于，所述发苗培养基的组分及各组分的质量百分比为MS粉0. 44%、蔗糖3%、烟草凝胶.0. 26%，余量为蒸馏水；所述发苗培养基的pH值为5. 8。
7.根据权利要求5所述的在烟草系统中表达4XTP4功能蛋白的方法，其特征在于，所述液体MS培养基的组分及各组分的质量百分比为MS粉0. 22%、蔗糖为3%，余量为蒸馏水；所述液体MS培养基的pH值为5. 8。
8.根据权利要求5所述的在烟草系统中表达4XTP 4功能蛋白的方法，其特征在于，所述共培养培养基的组分及各组分的质量百分比为MS粉0. 44%、蔗糖3%、烟草凝胶.0. 26%、6-苄氨基嘌呤0. 0001%、a -萘乙酸0. 00001 %，余量为蒸馏水；所述共培养培养基的pH值为5.8。
9.根据权利要求5所述的在烟草系统中表达4XTP4功能蛋白的方法，其特征在于，所述分化培养基的组分及各组分的质量百分比为MS粉0. 44%、蔗糖3%、烟草凝胶0. 26%,6-苄氨基嘌呤0. 0001%, a -萘乙酸0. 00001 %、卡那霉素0. 005%、羧苄青霉素0. 025%,余量为蒸馏水；所述分化培养基的PH值为5. 8。
10.根据权利要求5所述的在烟草系统中表达4XT P 4功能蛋白的方法，其特征在于，所述生根培养基的组分及各组分的质量百分比为MS粉0. 22%、蔗糖3%、烟草凝胶0. 26%,6-苄氨基嘌呤0. 0001 %、a -萘乙酸0. 00001 %、卡那霉素0. 005%、羧苄青霉素0. 025%，余量为蒸馏水；所述生根培养基的pH值为5. 8。
全文摘要
本发明涉及一种4×Tβ4基因以及在烟草中表达4×Tβ4蛋白的方法，该基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，该方法包括如下步骤将含有融合基因4×Tβ4的克隆载体质粒进行酶切，回收目标DNA片段，获得带有相应的粘性末端的目的基因4×Tβ4，然后将其克隆到烟草表达载体中，通过测序或酶切鉴定，在确保表达载体中的目的基因阅读框架正确的前提下，再将表达载体质粒用冻融法导入农杆菌中，获得工程菌；将灭菌后的烟草种子播于发苗培养基上，取生长两周的无菌叶片，作为外植体进行转化；提取4×Tβ4功能蛋白。本发明提供的融合蛋白4×Tβ4在皮肤和眼角膜伤口治愈和修复方面具有重要的生物活性和功能。
文档编号A01H5/00GK102643827SQ20121010327
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月10日 优先权日2012年4月10日
发明者李善爽, 杨桂华, 王晓磊, 赵凌侠, 高美凤 申请人:上海交通大学