无CO₂条件下诱导间充质干细胞分化成骨细胞的培养方法

专利名称：无CO₂条件下诱导间充质干细胞分化成骨细胞的培养方法
技术领域：
本发明涉及一种无CO2条件下诱导间充质干细胞分化为成骨细胞的培养方法。
背景技术：
细胞的体外培养技术已经历了约一百年的发展历史，并从上世纪五十年代后期开始得到飞速发展。作为生物学研究最基本的技术手段，细胞体外培养技术广泛应用于各个研究领域。目前细胞体外培养系统通常包括常规培养基(含有细胞生长所需的各类氨基酸、糖类、无机盐、维生素等)、10%血清、20% O2,5% 0)2和371恒温等。CO2是提供细胞正常生长所需的成分，但它必须与常规培养基中的高浓度碳酸氢钠联用，构成缓冲体系，来维持pH稳定。如果培养环境中无CO2,则培养基中的碳酸氢钠会迅速分解为碳酸钠,使pH过高导致细胞死亡。随着生物学研究的深入及研究领域的扩展，传统培养基已经难以满足一些特殊条件下研究的需求，因为很多时候往往需要在无CO2条件下进行细胞培养和诱导分化，这在利用航天器搭载进行太空细胞生物学研究中尤为突出。我国航天技术已跻身世界领先地位，并正式实施启动了一系列空间生命科学研究。然而，人类在太空失重环境下长期工作和生活会导致失重性的骨质变化，主要表现为骨量减少，骨矿度降低，钙排出增多，血钙升高，出现负钙平衡，导致骨密度下降和骨质疏松， 最终使骨力学性能下降，骨折风险增高。大量研究表明，微重力环境导致人骨髓间充质干细胞向骨细胞方向分化的潜能降低是引起骨质变化的重要原因。因此，有必要利用各种航天器的搭载条件，进行真实太空环境下空间微重力影响骨细胞分化的生物学效应及其分子机制的研究，对今后开展人类在深空微重力环境下骨质变化的预防和治疗研究以及药物开发提供理论依据具有至关重要的作用。然而，由于受到航天器搭载的有效载荷、容积、装置设计以及安全等因素的限制，往往无法搭载CO2储存罐来提供空间细胞培养所需的高浓度 co2。因此，设计一种在无CO2环境下能正常培养并诱导细胞定向分化的方法具有重要的科学和技术意义。

发明内容
本发明的目的是提供一种在无CO2条件下，能体外正常培养和诱导间充质干细胞定向分化成骨细胞的新型培养方法。本发明是通过对传统培养基进行改造，调整其关键缓冲盐体系的成分及浓度，从而达到在无CO2的特殊条件下，正常培养并诱导间充质干细胞定向分化成骨细胞的目的。本发明通过以下方案实现一种无CO2条件下诱导间充质干细胞分化为成骨细胞的培养方法，所述方法包括(I)收集培养至第3代的人骨髓间充质干细胞，用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的a -MEM培养液调节细胞密度至I X IO5个/ml，制备得到细胞悬液；(2)将步骤(I)细胞悬液以O. 5ml/孔接种至24孔板中，5% C02、37°C条件下培养过夜；(3)待细胞完全贴壁并生长到大约80%融合时，更换本发明新型诱导培养基，在无C02、37°C条件下培养14 21天，获得成骨细胞；所述本发明新型诱导培养基由本发明新型基础培养基添加常规胎牛血清、青霉素、链霉素、地塞米松、β -甘油磷酸钠和维生素C制成，所述本发明新型基础培养基按如下终浓度组成配制碳酸氢钠O. 41g/L ;十二水合磷酸氢二钠I. 5g/L ;磷酸二氢钾O. 07g/L ;氯化钠8. 17g/L ;溶剂为不含碳酸氢钠的L-DMEM细胞培养基。常规情况下，间充质干细胞的传统培养基为L-DMEM细胞培养基(Gibco公司，货号11885084)，其主要成分包括各类氨基酸、维生素、无机盐(含3. 7g/L碳酸氢钠)、葡萄糖(1000mg/L)、丙酮酸等。其中，无机盐既是细胞正常生长所必需的成分，又能构成缓冲体系，维持培养液PH稳定。在上述传统培养基的基础上，添加一定浓度的胎牛血清、地塞米松、β -甘油磷酸钠、维生素、C青霉素和链霉素，即可制备诱导间充质干细胞定向分化成骨细胞的传统诱导培养基。本发明针对传统培养基无法在无CO2条件下培养细胞的缺点，购买不含碳酸氢钠的L-DMEM细胞培养基(Gibco公司，货号31600034)，对其无机盐缓冲体系进行调整，即在该培养基中加入碳酸氢钠(终浓度为0.41g/L。国药集团化学试剂有限公司)、十二水合磷酸氢二钠(终浓度为I. 5g/L。国药集团国药集团化学试剂有限公司)、磷酸二氢钾(终浓度为0.07g/L。国药集团国药集团化学试剂有限公司)，并用氯化钠调节渗透压(终浓度为 8. 17g/L。国药集团化学试剂有限公司)，配置本发明新型基础培养基。然后，在本发明新型基础培养基中通过添加常规浓度的胎牛血清、地塞米松、β -甘油磷酸钠、维生素C、青霉素和链霉素，配制得到本发明新型的诱导培养基。根据本发明配制新型培养基，调节pH至7. 2后O. 22 μ m滤器过滤除菌，即可4°C保存备用。本发明关键在于对基础培养基中碳酸氢钠、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠等组分的浓度进行了调整，所添加的胎牛血清、青霉素、链霉素、地塞米松、β -甘油磷酸钠和维生素C为常规用量。优选的，所述诱导培养基由基础培养基添加10% (ν/ν)胎牛血清、100U/ml青霉素/100U/ml链霉素、IOnM地塞米松、IOnM β -甘油磷酸钠和50 μ g/ml维生素C制成。本发明的有益效果主要体现在(I)本发明提供的新型基础培养基配方能使间充质干细胞在无CO2条件下，正常生长且不影响细胞活性；(2)以本发明提供的新型基础培养基配方为基础配制成骨诱导培养基，能正常诱导间充质干细胞成骨分化，且分化效果良好；(3)使用本发明提供的新型培养基配方，既节省了设备耗费，又适用于无CO2条件下的细胞培养和诱导分化研究。


图I为诱导前、诱导2天、诱导4天和诱导14天的细胞形态；图2为诱导培养14天后，各处理组细胞数量；
图3为诱导培养14天后，各处理组MTT检测结果；图4为诱导培养14天后，各处理组碱性磷酸酶钙钴法染色结果；图5为ALP凝胶电泳及分析结果；图6为Runx2凝胶电泳及分析结果；图7为诱导培养14天后，各处理组ALP活性定量测定结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I :新型基础培养基配制表I :本发明新型基础培养基详细配方
权利要求
1.一种无CO2条件下诱导间充质干细胞分化为成骨细胞的培养方法，所述方法包括(1)收集培养至第3代的人骨髓间充质干细胞，用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和 100U/ml链霉素的a -MEM培养液调节细胞密度至I X IO5个/ml，制备得到细胞悬液；(2)将步骤⑴细胞悬液以O.5ml/孔接种至24孔板中，5% CO2、37°C条件下培养过夜；(3)待细胞完全贴壁并生长到80%融合时，更换诱导培养基，在无C02、37°C条件下培养 14 21天，获得成骨细胞；所述诱导培养基由基础培养基添加胎牛血清、青霉素、链霉素、 地塞米松、β -甘油磷酸钠和维生素C制成，所述基础培养基按如下终浓度组成配制碳酸氢钠O. 41g/L ;十二水合磷酸氢二钠I. 5g/L ;磷酸二氢钾O. 07g/L ;氯化钠8. 17g/L ;溶剂为不含碳酸氢钠的L-DMEM细胞培养基。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述诱导培养基由基础培养基添加10%胎牛血清、100U/ml青霉素/100U/ml链霉素、IOnM地塞米松、IOnM β -甘油磷酸钠和50 μ g/ml维生素C制成。
全文摘要
本发明提供了一种无CO2条件下诱导间充质干细胞分化为成骨细胞的培养方法，所述方法包括将第3代的人骨髓间充质干细胞，在5％CO2、37℃条件下培养过夜；待细胞完全贴壁并生长到大约80％融合时，更换诱导培养基，在无CO2、37℃条件下培养14～21天，获得成骨细胞；所述诱导培养基由基础培养基添加胎牛血清、青霉素、链霉素、地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C制成，所述基础培养基按如下终浓度组成配制碳酸氢钠0.41g/L；十二水合磷酸氢二钠1.5g/L；磷酸二氢钾0.07g/L；氯化钠8.17g/L；溶剂为不含碳酸氢钠的L-DMEM细胞培养基。使用本发明提供的新型培养基配方，能正常诱导间充质干细胞成骨分化，且分化效果良好，既节省了设备耗费，又适用于无CO2条件下的细胞培养和诱导分化研究。
文档编号C12N5/077GK102586181SQ201210025449
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月7日 优先权日2012年2月7日
发明者王金福, 陈键 申请人:浙江大学