专利名称：筛查16SrXII组植原体的芯片及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物信息学及生物检疫鉴定技术领域，尤其涉及筛查16SrXII组植原体的芯片及其应用。
背景技术：
16Sr XII组植原体主要包括澳大利亚植原体候选种、Bois Noir植原体、顽固植原体(stolbur)等多种植原体。葡萄金黄化病是欧洲最具经济影响的葡萄黄化病，在欧洲葡萄园导致巨大产量损失。由澳大利亚植原体候选种引起的葡萄黄化病(以下简称为AusGY) 在澳大利亚新南威尔士和维多利亚温暖地区的葡萄园中频繁发生。此外，澳大利亚植原体候选种还可以引起多种经济作物的严重病害侵染葡萄时，引起葡萄黄化病，其症状和危害与葡萄金黄化病相似；侵染草莓时，引起草莓致死性黄化病，可导致草莓苗死亡；侵染番木瓜时，引起番木瓜顶枯病，是毁灭性病害；侵染澳洲朱蕉时，引起澳洲朱蕉猝衰病；侵染新西兰亚麻时，引起新西兰亚麻黄叶病，是致死性病害。因此，经济影响十分重要。
有观点认为澳大利亚植原体候选种起源于新西兰并随后传播到澳大利亚。尽管许多方面尚不清楚，但在其它植物上已经掌握的证据表明，应将其列为检疫性病害。EPPO也已经将此病列入警戒名单。澳大利亚植原体候选种专性寄生在寄主植物的韧皮部组织的筛管细胞中和介体昆虫如Oliarus atkinsoni Myers体内。迄今无法在活体外人工培养。 用DAPI或Hoechst 33258荧光染色法可以在荧光显微镜下从韧皮部组织中观察到植原体的特异荧光，只有在电子显微镜下才能看清其粒体形态。澳大利亚植原体候选种无细胞壁， 形态多样，大小一般在80 lOOOnm。目前对AusGY的研究尚不够深入，对其发生规律和侵染循环尚不清楚。葡萄上的传播介体昆虫尚不明确。有研究报道说澳大利亚和新西兰野生的一种臭草属植物Coprosma robusta可能是澳大利亚植原体候选种的库源寄主。尽管在新西兰亚麻上已经明确叶蝶Oliarus atkinsoni是葡萄金黄化植原体的传播介体,但0.atkinsoni是单食性昆虫,肯定不是其它植物上的传播介体。由于澳大利亚植原体候选种的寄主范围广泛，因此，在不同植物上，其生活史会有所不同，侵染循环也复杂化。澳大利亚植原体候选种为种苗传，而且寄主范围广，易通过多种植物繁殖材料的进口贸易运输传入。
在新西兰很早就查明叶蝶Oliarus atkinsoni在新西兰亚麻上是该植原体的传播介体，但在葡萄等其它植物上的传播介体尚不清楚。不过有一点可以肯定在不同的寄主上，澳大利亚植原体候选种存在不同的传播介体。0. atkinsoni主要危害新西兰亚麻,有可能随引种的新西兰亚麻传入。
目前，针对16SrXII组植原体的检测方法主要为①血清学检测方法，灵敏度不高， 易产生假阳性基于核酸的分子生物学检测技术，主要包括PCR、实时荧光PCR等技术，灵敏度和特异性相对较高，但存在交叉污染，在通用性和标准化方面存在不足。发明内容
本发明的一个目的是提供一种筛查16SrXII组植原体的探针。
本发明提供的筛查16SrXII组植原体的探针，由3条探针组成，所述3条探针的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列I-序列3。
上述探针中，所述16SrXII组植原体为澳大利亚植原体候选种。
本发明的另一个目的是提供一种筛查16SrXII组植原体的基因芯片。
本发明提供的筛查16SrXII组植原体的基因芯片，为将上述的探针固定在片基表面得到的基因芯片。
在上述基因芯片中，所述片基为醛基化玻璃片基，在本发明的实施例中采用的是博奥生物有限公司晶芯 微阵列基片，产品目录号420022。
在上述基因芯片中，所述16SrXII组植原体为澳大利亚植原体候选种。
本发明的第三个目的是提供一种筛查16SrXII组植原体的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括上述的基因芯片。
在上述试剂盒中，还包括如下引物组
所述弓丨物组由引物对A和引物对B组成；
所述引物对A由引物I和引物2组成；
所述引物对B由引物3和引物4组成；
所述引物I的核苷酸序列为序列表中的序列4
所述引物2的核苷酸序列为序列表中的序列5
所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列6
所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列7
上述试剂盒由上述的基因芯片和上述引物组组成。
上述试剂盒中，所述16SrXII组植原体为澳大利亚植原体候选种。
本发明的第四个目的是提供一种用于筛查16SrXII组植原体的引物组。
本发明提供的引物组，由引物对A和引物对B组成；
所述引物对A由引物I和引物2组成；
所述弓丨物对B由引物3和引物4组成；
所述引物I的核苷酸序列为序列表中的序列4
所述引物2的核苷酸序列为序列表中的序列5
所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列6
所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列7
上述引物组中，所述16SrXII组植原体具体为澳大利亚植原体候选种。
本发明还提供一种用于筛查16SrXII组植原体的PCR试剂。
本发明提供的PCR试剂，由上述的引物组、dNTP、PCR缓冲液和聚合酶组成。
上述PCR试剂中，上述引物组中的各条引物在所述PCR试剂中的浓度均为0.2mmol/L。
上述PCR试剂中，所述16SrXII组植原体具体为澳大利亚植原体候选种。
上述探针、上述基因芯片、上述的试剂盒、上述的引物组或上述的PCR试剂在鉴定或辅助鉴定16SrXII组植原中的应用也是本发明保护的范围。
上述探针、上述基因芯片、上述的试剂盒、上述的引物组或上述的PCR试剂在制备鉴定或辅助鉴定16SrXII组植原体产品中的应用也是本发明保护的范围。CN 102534022 A
在上述应用中，所述16SrXII组植原体具体为澳大利亚植原体候选种。
本发明的第五个目的是提供一种筛查或辅助筛查待测样品感染16SrXII组植原体的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤
I)将待测样品的基因组DNA进行标记，得到标记后产物；
2)将步骤I)得到的标记后产物与上述的基因芯片进行杂交，得到杂交后芯片；
3)将步骤2)得到的杂交后芯片扫描，
若所述基因芯片上的至少一条所述探针的信号绝对值大于5000且信噪比大于3.0，则待测样品感染或候选感染16SrXII组植原体。
所述至少一条所述探针为3条所述探针中的任意一条。
在上述方法中，步骤I)中，所述标记为以待测样品的基因组DNA为模板，以上述引物组进行PCR扩增，得到标记后产物；
在上述方法中，步骤2)中，所述杂交的温度为42°C，所述杂交的时间为12h。
在上述方法中，在所述步骤2)后和步骤3)前还包括将所述杂交后芯片进行洗涤的步骤；
在上述方法中，所述至少一条所述探针为3条所述探针中的任意一条；
在上述方法中，所述16SrXII组植原体为澳大利亚植原体候选种。
本发明的实验证明，本发明提供的筛查16SrXII组植原体的芯片中的探针具有 16SrXII组植原体组水平上的高兼容性和植原体组内的特异性，数小时内完成对待检样品中可能存在的新发植原体的筛查，所需的样品量极少，一般仅需0. lg。另外数据的分析与计算机图像处理软件相结合，达到分析结果能够直观化、可视化。本发明采用生物信息学方法对16SrXII组植原体的16Sr DNA和tuf核苷酸序列进行分析，设计了该组的兼容性探针， 标准植原体样品验证结果证明探针效果良好。本发明的筛查16SrXII组植原体的芯片可用于16SrXII组植原体的检疫鉴定，利用DNA芯片技术具有高通量、快速、稳定性好、防交叉污染等优点，针对16SrXII组植原体设计通用型引物与探针并实施DNA芯片检测技术可以大大提高我国检验检疫口岸通关速率，并对于未知的、新发植原体进行有效的监测与鉴定。
图I为16SrXII组植原体筛查芯片探针点阵示意图(3X4)
图2为应用澳大利亚植原体候选种标准样品验证16SrXII组植原体筛查芯片的结果
图3为筛查芯片灵敏度检测结果
图4为PCR灵敏度检测结果具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例I、筛查16SrXII组植原体的芯片的制备
I、组级高兼容性寡核苷酸探针的设计
I)从美国国立生物技术信息中心(NCBI)及核糖体数据库项目官方网站(RDP)数据库下载16SrXII组植原体全基因组及核酸序列数据用于设计探针。
2)整理植原体核酸序列，去除小于200bp长度的核酸序列并分组；同一组内所有植原体序列简称为组内序列，非本组的所有植原体序列简称为组外序列。
3)使用Cluster W联配组内序列，寻找序列保守区域设计探针。探针设计时在序列保守区域内以2 3个碱基作为间隔，连续提取所有19bp的核酸序列，对选取的核酸序列进行筛选，标准为GC含量在40%及60%之间，没有大于3bp的连续重复碱基，以及不会形成大于3bp的发卡结构。
4)使用自编程序将通过步骤3)筛选的探针序列与组外序列联配，程序计算二级结构的自由能、MMPD(The distance of the mismatch in the middle position)、最长相同片段等条件进行综合打分，弃用高于模拟杂交标准分的探针。
5)使用自编程序将通过步骤4)筛选的探针序列与组内序列进行比对，程序计算打分，弃用低于模拟杂交标准分的探针。
6)使用BLASTN将通过步骤5)筛选得到的探针序列与步骤2)得到的特异性数据库进行特异性比对，Word size设为7,筛选标准为Max Score小于15分,并且无7bp以上的相同片段
7)对于剩余的每一条探针进行排序，排序标准依次为探针对组内序列模拟杂交总分、探针对组外序列模拟杂交总分及探针对特异性数据库的BlastN Max Score总分,取排名前两名的两条探针为组特异性探针。
8)如果经过步骤7)无法达到每组至少I个探针对应的标准，则在步骤3)降低序列保守性标准，重新设计，依此循环直到所有16SrXII组序列都有I个探针对应。如果无法从保守区域设计探针，或16SrXII组内序列无保守区域，则使用所有16SrXII组全长序列设计探针。探针设计标准与步骤3)到步骤7)相同。
根据上述原则设计了 16Sr DNA区域的I条探针(探针24，序列I)和tuf区域的2 条探针(探针71，序列2和探针72，序列3)，其核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1-3 所示。
可以人工合成上述3条探针。
2、芯片的制备
上述I得到的3条探针用点样缓冲液(博奥生物有限公司晶芯 芯片点样液，产品目录号440010)溶解，浓度为50 PM，每条探针横向重复2点点在醛基化玻璃片基芯片 (博奥生物有限公司晶芯 微阵列基片，产品目录号420022)上，每点约0. 25nL，点直径约 180iim，点间距为300 iim，点样均匀度的标准方差为15%。将芯片点有探针的一面在65°C 水浴锅上水合10s，芯片距水面距离为3cm，在空气中室温自然干燥，在进行一次水合。将点有探针的一面向上，放在紫外交联仪中250mJ交联。将芯片放在42°C预热，0. 5% SDS清洗lOmin。将芯片转移到42°C预热蒸懼水中清洗2min。把芯片放在50ml锥形离心管中， 2000rpm离心lmin，以去除芯片表面的液体，获得筛查16SrXII组植原体的芯片。
筛查16SrXII组植原体的芯片如图I所示，图I中24、71和72为16SrXII组植原体筛查芯片探针24、71和72 (对应序列I-序列3)，Hex为芯片固定阳性质控，PC为杂交阳性质控，NC为杂交阴性质控。
实施例2、筛查16SrXII组植原体的芯片的应用
一、筛查16SrXII组植原体的芯片检测样品
I、用于检测的样品总DNA提取
I)取感染澳大利亚植原体候选种的葡萄叶片(叶片表现红花、卷曲，植原体拉丁名candidatus phytoplasma australiense,记载在Candidatus Phytoplasma australiense is the phytoplasma associated with Australian grapevine yellows, papaya dieback and Phormium yellow leaf diseases, 1998,104 :619-623.公众可从中国检验检疫科学研究院获得。)0. lg，取适量液氮研磨，再加入研磨液(K2HPO4. 3H20 2. 17g， KH2PO4O. 41g,蔗糖 10g, BSA (Fraction V) 0. 15g, PVP_102g 定容至 IOOmL,调 DH 至 7. 6 后高温灭菌)2mL充分研磨，4°C 20000rpm离心20min,弃上清。
2)加入 ImL DNA 提取液(Tris-HCl 100mM,EDTA 100mM,NaCl 250mM调 pH至 8. 0)， 40iiL蛋白酶K(5mg/mL)，轻轻混匀，加入160 u L 10%十二烷肌氨酸钠，混匀，在55°C温育 2小时,期间不断的颠倒混勻，4°C 6000rpm, IOmin,取上清。
3)加入2/3体积异丙醇到上清液中，轻混匀，-20°C保持至少30min，4°C 12000rpm, 15分钟，弃上清。
4)加入600 ii L带有RNase的水液，加入30 iUSDS，12 ii L蛋白酶K，轻轻彻底混勻， 37°C温育60分钟。
5)加 100 U L 5M NaCl 混匀，再加入 84 U L CTAB/NaCl 溶液，65°C温育 10 分钟。
6)加入等体积苯酚氯仿异戊醇(25 24 I)混匀，4°C 12000rpm，10分钟，重复直至无中间白色层。
7)上层水相加入等体积氯仿异戊醇(24 1)，混匀，4°C 12000rpm，10分钟。
8)上清液加入2/3体积异丙醇，混匀，_20°C保持至少30分钟，4°C 12000rpm, 10分钟，弃上清液。
9)加入ImL 70%乙醇12000rpm离心I分钟，洗涤两次，加入30 u L TE混匀溶解， 得到澳大利亚植原体候选种的总DNA(基因组DNA)。
2、样品标记与杂交
标记体系为20 U L,即在0. 2mL的反应管中加入2 ii L上述I得到的基因组DNA、 上游引物0. 2 ii L (终浓度为0. 2mmol/L)、下游引物0. 2 y L (终浓度为0. 20mmol/L，5’端 TAMARA 标记)、dNTP Mix (10mmol/L) I. 6u L, LA-Taq 酶 0. 5 y L、10 XBuffer (Mg2+) 2 y L 及 DEPC-H2O 13. 5 u L0
上下游引物由用于扩增16S rDNA的引物对和用于扩增tuf的引物对组成，
上述用于扩增16S rDNA的引物对由序列表中的序列4和序列表中的序列5组成
上游引物AGAGITTGATCMTGGCTCAG (序列 4)
下游引物GGTTACCTTGTTACGACTT (序列 5)
上述用于扩增tuf的引物对由序列表中的序列6和序列表中的序列7组成
上游引物:5，-CAAATTGATAAYGCTCCTGA A-3，(序列 6)；
下游引物5’-ACGGAAATAG AATTGMGGAC G-3’(序列 7)；
PCR 反应程序94°C 5min ；94°C 30sec,60°C 30sec,72°C lmin 30sec, 35cycles ； 72°C IOmin。
杂交杂交液包括2. 4uL 3XSSC.0. 32 u L 0. 2% SDS,4u L 25% 甲酰胺、0. 32 y L 外标、I. 6 u L 5XDenhard’s及标记样品7. 36 u L ;95°C变性3min,冰浴5min,瞬时离心；将杂交液加到由实施例I得到的16SrXII组植原体筛查芯片上，盖薄片盖好，42°C水浴杂交过夜(12h)，得到杂交后的芯片(澳大利亚植原体候选种)。
3、洗涤、扫描
清洗体系及程序如下
洗液I洗液II洗液组分(最终浓度)2xSSC, 0.2%SDS 0.2XSSC清洗温度42 V42 V清洗时间4min4min
先将洗液I、II放在微波炉中预热到42°C，转移到清洗盒中。杂交结束后，将杂交后的芯片转移到盛放洗液的清洗盒中，杂交面向上，放在水平摇床上缓慢清洗。芯片清洗后，放在50mL锥形离心管中，2000rpm离心lmin，除去芯片表面的液体，分别得到待检测芯片(澳大利亚植原体候选种)。
将上述待检测芯片(澳大利亚植原体候选种)置于扫描仪中进行扫描分析；PMT 设为900，获得各点荧光强度、背景强度等数据。
使用博奥生物开发的LuxScan 3. 0从扫描的芯片中提取数据，探针的信号值为探针前景值的中位值减去背景值的中位值，信噪比为图像对应点内所有信号值中位值与背景值中位值的比值。
若至少一条所述探针的信号绝对值均大于5000且信噪比均大于3. 0，判为阳性 (为16SrXII组植原体感染);探针的信号绝对值均小于5000且信噪比均小于2. 0，判为阴性(不为16SrXII组植原体感染)；如果信号模糊且信噪比介于2.0和3.0之间，判为可疑，实验需重复验证。
图2的探针排列与图I相同，阳性探针均为24、71、72。
澳大利亚植原体候选种的结果如图2所示，探针24、71、72有信号，探针24、71、72 所在位置的信号绝对值均大于7000 ;且信噪比均为4，说明本发明可以检测16SrXII组植原体的澳大利亚植原体候选种；
上述芯片的固定阳性质控、杂交阳性质控及杂交阴性质控表现良好，标准样品杂交信号强而无背景噪音，说明设计的探针及建立的芯片筛查程序具有良好的工作效果。
二、筛查16SrXII组植原体芯片与PCR检测灵敏度比较
准确称取0. Ig澳大利亚植原体候选种感染的葡萄叶片，提取基因组DNA，分别用于16SrXII组植原体筛查芯片检测和PCR检测，两者所用的DNA (初始浓度为300ng/ u L) 均进行5°、5_\5_2、5_3和5_4倍梯度稀释。
芯片检测的方法同上述的一；
芯片检测实验结果如图3所示，图3的探针排列与图I相同，其中A :5_2稀释；B 5_3稀释；C :5_4稀释；可以看出，16SrXII组植原体筛查芯片可检测到待检对象的最高稀释倍数为54。
PCR检测的引物为
上游引物5’-CAAAITGATAAyGCTCCTGAA-3’(序列 6)；
下游引物5’-ACGGAAATAGAAITGMGGACG-3’(序列 7)；
PCR检测的结果如图4所示，I 5°稀释；2 :5^1稀释；3 :5_2稀释；4 :5_3稀释；5 :5_4 稀释；M =Marker DL2000，可以看出，均得到858bp的产物(Genbank号AJ271317的第86-943 位核苷酸)，待检对象的最高稀释倍数为54。
因此，16SrXII组植原体筛查芯片检测灵敏度与PCR方法灵敏度相当。
权利要求
1.一种筛查16SrXII组植原体的探针，由3条探针组成,所述3条探针的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列I-序列3。
2.—种筛查16SrXII组植原体的基因芯片，为将权利要求I所述的探针固定在片基表面得到的基因芯片。
3.根据权利要求2所述的基因芯片，其特征在于所述片基为醛基化玻璃片基；所述 16SrXII组植原体为澳大利亚植原体候选种。
4.一种筛查16SrXII组植原体的试剂盒，包括权利要求2或3所述的基因芯片。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括如下引物组 所述引物组由引物对A和引物对B组成；所述引物对A由引物I和引物2组成；所述引物对B由引物3和引物4组成；所述引物I的核苷酸序列为序列表中的序列4 ；所述引物2的核苷酸序列为序列表中的序列5 ；所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列6 ；所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列7 ；所述试剂盒由权利要求2或3所述的基因芯片和所述引物组组成；所述16SrXII组植原体为澳大利亚植原体候选种。
6.一种用于筛查16SrXII组植原体的引物组，由引物对A和引物对B组成；所述引物对A由引物I和引物2组成；所述引物对B由引物3和引物4组成；所述引物I的核苷酸序列为序列表中的序列4 ；所述引物2的核苷酸序列为序列表中的序列5 ；所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列6 ；所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列7 ；所述16SrXII组植原体具体为澳大利亚植原体候选种。
7.权利要求I所述探针、权利要求2或3所述的基因芯片、权利要求4或5所述的试剂盒或权利要求6所述的引物组在鉴定或辅助鉴定16SrXII组植原体中的应用；所述 16SrXII组植原体具体为澳大利亚植原体候选种。
8.权利要求I所述探针、权利要求2或3所述的基因芯片、权利要求4或5所述的试剂盒或权利要求6所述的引物组在制备鉴定或辅助鉴定16SrXII组植原体产品中的应用；所述16SrXII组植原体具体为澳大利亚植原体候选种。
9.一种筛查或辅助筛查待测样品感染16SrXII组植原体的方法，包括如下步骤1)将待测样品的基因组DNA进行标记，得到标记后产物；2)将步骤I)得到的标记后产物与权利要求2或3所述的基因芯片进行杂交，得到杂交后芯片；3)将步骤2)得到的杂交后芯片扫描，若所述基因芯片上的至少一条所述探针的信号绝对值大于5000且信噪比大于3. 0，则待测样品感染或候选感染16SrXII组植原体。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于步骤I)中，所述标记为以待测样品的基因组DNA为模板，以权利要求4或5所述的试剂盒或权利要求6所述的引物组进行PCR扩增，得到标记后产物；步骤2)中，所述杂交的温度为42°C，所述杂交的时间为12h;在所述步骤2)后和步骤3)前还包括将所述杂交后芯片进行洗涤的步骤；所述至少一条所述探针为3条所述探针任意一条；所述16SrXII组植原体为澳大利亚植原体候选种。
全文摘要
本发明公开了一种筛查16SrXII组植原体的芯片及其应用。本发明的筛查16SrXII组植原体的探针由3条探针组成，所述3条探针的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-3。还提供了筛查16SrXII组植原体的基因芯片，为将上述的探针固定在片基表面得到的基因芯片。本发明的实验证明，本发明提供的筛查16SrXII组植原体的芯片中的探针具有16SrXII组植原体组水平上的高兼容性和植原体组内的特异性，数小时内完成对待检样品中可能存在的新发植原体的筛查，所需的样品量极少，一般仅需0.1g。另外数据的分析与计算机图像处理软件相结合，达到分析结果能够直观化、可视化。
文档编号C12Q1/68GK102534022SQ20121002496
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月6日 优先权日2012年2月6日
发明者张永江, 朱水芳, 牟海清, 赵文军 申请人:中国检验检疫科学研究院