专利名称：一种新的倍半萜合成酶及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种新的倍半萜合成酶及其用途。
背景技术：
植物青蒿(Artemisia annua L.)属于菊科植物，为一年生草本植物，其具有良好的药用价值。青蒿含有多种化学成分，如含倍半萜类(包括青蒿素(Qinghaosu，Artemisinin)、青蒿醇(Artemisinol)、青蒿酸(Artemisic acid)等);亦含挥发性成分，如茨烯(Camphene)、β -茨烯(β-Camphene)、异蒿酮(Isoartemisia ketone)、左旋樟脑(1-Camphor)、β-丁香烯(β-Caryophyllene)等；亦含黄酮类成分，如:山柰黄素(Kaemp-ferol)、槲皮黄素(Quercetin)、黄色黄素(Luteolin)等；还含香豆素类成分以及β -半乳糖式酶(β-Galactosidace)、β _葡萄糖式酶(β -Glucosidase) > β_谷甾醇(β-Sitosterol)、豆留醇(Stigmasterol)和掠榈酸(Palmitic acid)等。各种成分发挥了抗疟作用、抗血吸虫 作用，抗微生物作用等。其中的青蒿素，其是含有过氧桥的倍半萜衍生物，是治疗疟疾的有效药物，而紫穗槐二烯合酶(ADS)是青蒿素生物合成途径中重要的倍半萜合成酶。然而，仍然还有很多青蒿素生物合成途径中的酶没有被分离和鉴定。α-没药醇是存在于春黄菊花等植物中的一种成份，是广泛应用于化妆品中的消炎物质，由于其稳定性及很好的皮肤相容性，它很适合于用在化妆品中，不仅具有抗炎性能，还被证明有抑菌活性。目前现有技术中，α-没药醇的生产主要是通过栽培植物提取的手段进行，而未见采用生物技术方法生产的报导。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的倍半萜合成酶及其用途。在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，其是具有SEQ ID NO:3氨基酸序列的多肽、或其同功能的保守性变异多肽、活性片段或活性衍生物。在一个优选例中，所述的保守性变异多肽、活性片段、活性衍生物选自下组:(I)将SEQ ID NO:3氨基酸序列经过一个或多个(如1_30个，更佳地1_20个，更佳地1-10个，更佳地1-5个或1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有SEQ ID NO:3氨基酸序列的多肽功能的多肽；或(2)与SEQ ID NO:3氨基酸序列具有70%以上(更佳地80%以上，更佳地90%以上；更佳地95%以上；更佳地98%以上或99%以上)的序列相同性的，且具有SEQ ID NO:3氨基酸序列的多肽功能的多肽。在另一优选例中，所述的具有SEQ ID NO:3氨基酸序列的多肽的功能包括:环化法尼基焦磷酸(FPP)产生α -没药醇(a -Bisabolol)。在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列中，对应于SEQ ID NO:3中第272位是Ala,第274位是Ala,第276位是Arg,第288位是Leu，第289位是Ala,第291位是Val，第301 位是 He, H 328 位是Met ;第 373 位是 Val, H 381 位是 Leu,第 392 位是Leu,第 394-399位是 Ser He Ala Val Asn Leu ;第 417 位是 Val,第 421 位是 Ala,第 422 位是 Phe,第 428位是Glu，第432位是Leu，第435位是Lys，第446位是Ala，第447位是Gly，第450位是Glu,第457位是Val，第471位是Ser，第476位是Lys，第477位是Asn，第512位是Val，第513 位是 His。在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列中，对应于SEQ ID NO:3中第272-329位氨基酸序列、第343-399位氨基酸序列、第417-486位氨基酸序列是保守的(不发生氨基酸的变异)。在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其是:(i)编码权利要求1-4任一所述多肽的多核苷酸；或(ii)与(i)的多核苷酸互补的多核苷酸。在另一优选例中，该多核苷酸具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为不能简单地借助光合作用，以水、二氧化碳和无机盐等无机物合成碳水化合物、蛋白质来维系生存的细胞；或所述的宿主细胞为非植物繁殖材料。在另一优选例中，所述的宿主细胞为非生殖性细胞。在本发明的另一方面，提供一种生产所述的多肽的方法，包括步骤:(I)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和(2)从培养物中分离所述的多肽。在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于生产α-没药醇。本发明的另一方面，提供一种生产α -没药醇的方法，所述的方法包括:利用所述的多肽环化法尼基焦磷酸(FPP)产生α -没药醇(a -Bisabolol)。在另一优选例中，所述的多肽催化法尼基焦磷酸环化在体外或细胞内进行。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1、天然的萜类合酶QHS3与紫穗槐二烯合成酶(ADS)的蛋白质序列比对图。它们的同源性82%。图2、QHS3的组织表达特征，表明QHS3在花序中高表达。图3、QHS3体外酶活的GC-MS图(FPP为底物)及QHS3体外酶活副产物的含量以及结构(FPP为底物)。Α、对照pET32a空载体的酶活反应GC-MS图；B、QHS3的酶活反应GC-MS图；C、标准品 α -没药醇(a -bisabolol)的 GC-MS D、B图中峰I的质谱图；E、标准品α -没药醇的质谱图；F、QHS3主产物α -没药醇以及其他副产物的含量的比较；G、QHS3副产物的化学结构。图4、野生型和突变体QHS3活力的影响。Ajf QHS3和ADS的C-末端结构域分成两部分207_381aa、392_546aa，加N-末端结构域l_195aa共三部分进行结构域置换的示意图。B、将QHS3和ADS的C-末端活性结构域约350个氨基酸残基分为五部分207-261aa、272-329aa、343-399aa、417-486aa、496-546aa，以 QHS3 的蛋白序列为骨架，用ADS中相同部分进行置换的示意图。C、B示意图中的DW3中被分析的片段再分成两段343-381aa、392_399aa，以ADS中相应部分进行置换的示意图。图5、野生型(A)和突变体QHS3(第373、395、398和399位四个氨基酸残基突变)(B)体外酶活的GC-MS图。·
具体实施例方式本发明人经过长期的研究，分离获得一种新的倍半萜合成酶，所述的倍半萜合成酶可以将法尼基焦磷酸(FPP)环化产生α -没药醇(a -Bisabolol)。通过结构域置换和点突变实验，本发明人还获得了所述倍半萜合成酶的产物特异性的位点。所述的倍半萜合成酶的酶活性良好，可应用于工业生产α-没药醇。在此基础上完成了本发明。本发明的多肽(倍半萜合成酶)可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括倍半萜合成酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的倍半萜合成酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或
(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，术语“倍半萜合成酶”或“倍半萜合成酶蛋白”指具有倍半萜合成酶活性(较佳地为环化FPP产生α-没药醇)的SEQ ID NO:3序列的多肽。该术语还包括具有与倍半萜合成酶相同功能的、SEQ ID NO:3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-30个，较佳地1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括倍半萜合成酶的活性片段和活性衍生物。较佳地，这些变异形式中，对应于SEQID NO:3氨基酸序列中的部分位点是保守的；较佳地，这些保守性位点包括:对应于SEQ IDNO:3的第272位，第274位，第276位，第288位，第289位，第291位，第301位，第328位；第373位，第381位，第392位，第394-399位；第417位，第421位，第422位，第428位，第432位，第435位，第446位，第447位，第450位，第457位，第471位，第476位，第477位，第512位，第513位；更佳地，所述的保守性位点包括:对应于SEQ ID NO:3中第272-329位氨基酸序列、第343-399位氨基酸序列、第417-486位氨基酸序列。上述保守性位点或区域与本发明的倍半萜合成酶的酶功能较为相关，一个或几个位点的变化将导致倍半萜合成酶的酶功能丧失。发明还提供倍半萜合成酶或多肽的类似物。这些类似物与所述的倍半萜合成酶的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。较佳地，较佳地，这种氨基酸的替换发生在前面所指出的保守性位点或区域以外的位点上。修饰(通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，“倍半萜合成酶的保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比，有至多30个，较佳地至多20个，更佳地至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个(如I个、2个或3个)氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。较佳地，这种氨基酸的替换发生在前面所指出的保守性位点或区域以外的位点上。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。表I
权利要求
1.一种分离的多肽，其是具有SEQ ID NO:3氨基酸序列的多肽、或其同功能的保守性变异多肽、活性片段或活性衍生物。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的保守性变异多肽、活性片段、活性衍生物选自下组: (1)将SEQID NO:3氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有SEQ ID NO:3氨基酸序列的多肽功能的多肽；或 (2)与SEQID NO:3氨基酸序列具有70%以上的序列相同性的，且具有SEQ ID NO:3氨基酸序列的多肽功能的多肽。
3.如权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中，对应于SEQIDNO:3中第272位是Ala,第274位是Ala,第276位是Arg,第288位是Leu，第289位是Ala,第291位是Val，第301位是He，第328位是Met ’第373位是Val，第381位是Leu，第392位是 Leu,第 394-399 位是 Ser He Ala Val Asn Leu ;第 417 位是 Val,第 421 位是 Ala,第422位是Phe, H 428位是Glu,第432位是Leu,第435位是Lys, H 446位是Ala,第447位是Gly,第450位是Glu,第457位是Val，第471位是Ser，第476位是Lys, H 477位是Asn,第512位是Val, H 513位是His。
4.如权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中，对应于SEQIDNO:3中第272-329位氨基酸序列、第343-399位氨基酸序列、第417-486位氨基酸序列是保守的。
5.一种分离的多核苷酸，其是: (i)编码权利要求1-4任一所述多肽的多核苷酸；或 (ii)与(i)的多核苷酸互补的多核苷酸。
6.如权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸具有SEQIDNO:1或SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列。
7.—种载体，其特征在于，它含有权利要求5或6所述的多核苷酸。
8.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求7所述的载体，或基因组中整合有权利要求5或6所述的多核苷酸。
9.一种生产权利要求1-4任一所述的多肽的方法，其特征在于，包括步骤: (1)培养权利要求8所述的宿主细胞，获得培养物；和 (2)从培养物中分离权利要求1-4任一所述的多肽。
10.权利要求1-4任一所述的多肽的用途，用于生产α-没药醇。
11.一种生产α-没药醇的方法，其特征在于，所述的方法包括:利用权利要求1-4任一所述的多肽环化法 尼基焦磷酸产生α-没药醇。
全文摘要
本发明涉及一种新的倍半萜合成酶及其用途。本发明人分离获得一种新的倍半萜合成酶，所述的倍半萜合成酶可以将法尼基焦磷酸环化产生α-没药醇。通过结构域置换和点突变实验，本发明人还获得了所述倍半萜合成酶的产物特异性位点。所述的倍半萜合成酶的酶活性良好，可应用于工业生产α-没药醇。
文档编号C12N15/63GK103243083SQ20121002511
公开日2013年8月14日 申请日期2012年2月6日 优先权日2012年2月6日
发明者陈晓亚, 王凌健, 李建戌 申请人:中国科学院上海生命科学研究院