大眼长蝽卵黄原蛋白新基因及应用
【专利摘要】本发明公开了一种重要半翅目天敌昆虫大眼长蝽(Geocoris pallidipennis)卵黄原蛋白基因DNA序列及其编码的蛋白质序列，补充了半翅目昆虫卵黄原蛋白基因分子特性的信息，为研究卵黄原蛋白基因在大眼长蝽营养和生殖调控中的作用机制、卵黄原蛋白基因功能提供了新基因。该发明将为大眼长蝽大量繁殖和有效利用提供理论基础，具有应用于害虫生物防治的广阔前景。
【专利说明】
大眼长蝽卵黄原蛋白新基因及应用
技术领域
[0001] 本发明公开了一种卵黄原蛋白新基因 DNA序列及其编码的蛋白质序列，属于基因 工程和蛋白质工程领域。本发明涉及一种大眼长蝽（Geocoris pallidipennis)卵黄原蛋 白新基因的克隆及应用。
【背景技术】
[0002] 卵黄原蛋白（Vitellogenin，Vg)是特异地存在于非哺乳类性成熟的卵生雌性动 物血液中的一种蛋白，是几乎所有卵生动物卵黄蛋白的前体。卵黄原蛋白是卵黄发生的关 键性物质，在卵生动物的生殖发育中起重要作用，它在雌性脂肪体中合成，分泌到血淋巴， 然后通过内吞作用被发育中的卵母细胞摄取，为正在发育的胚胎提供氨基酸、脂肪、碳水化 合物、维生素、磷、硫及微量元素等营养和功能性物质。
[0003] 昆虫卵黄原蛋白的研究是近年来昆虫生理学和生物化学研究的热点。到目前为 止，已有多种昆虫的Vg基因被克隆和鉴定，主要包括网翅目、半翅目、鳞翅目、双翅目、鞘翅 目、脉翅目及膜翅目等昆虫，但大眼长蝽Vg基因的克隆未见报道。大眼长蝽是一种重要的 半翅目天敌昆虫，能够有效地控制棉蚜、棉叶螨、棉蓟马、苜蓿盲蝽、叶蝶、红铃虫、棉铃虫等 农业害虫，是棉花和其它作物害虫的重要捕食性天敌，由于其分布广，数量多，取食范围广 而受到生防工作者的关注。大眼长蝽卵黄原蛋白与该天敌昆虫营养生理和生殖特性紧密相 关，因此，研究大眼长蝽卵黄原蛋白具有重要意义和应用价值。本发明首次在半翅目天敌昆 虫大眼长蝽中克隆了卵黄原蛋白基因，并对其编码的氨基酸序列、同源性及进化地位进行 了分析，为Vg基因功能及大分子生物进化研究提供了新基因，为该重要天敌昆虫大量繁育 和有效利用提供了理论基础。
【发明内容】
[0004] 本发明包括以下内容：
[0005] 1.本发明提供了一种编码大眼长蝽卵黄原蛋白的多核苷酸分子SEQ ID N0. 1，所 述的多核苷酸分子包括与SEQ ID NO. 1相符合的核苷酸序列以及与SEQ ID NO. 1所示的核 苷酸序列部分相符合并具有相似功能的片断。
[0006] 2.本发明提供了一种蛋白质，所述的蛋白质包含与SEQ ID N0. 2氨基酸序列基本 及部分相符合的氨基酸序列。
[0007] 3. -种卵黄原蛋白基因应用的方法，包括通过监测卵黄原蛋白基因片段表达量， 来研究卵黄原蛋白片段含量，从而研究卵黄原蛋白片段对昆虫营养和生殖如产卵量、发育 历期影响的方法。
[0008] 文中涉及氨基酸序列的地方使用"基本相符"这一术语是想包含那些不会导致卵 黄原蛋白质生物活性降低的氨基酸序列上的变化.这些变化可能包括保守的氨基酸替代 等。
[0009] 有益效果
[0010] 1.本发明公开了一种编码大眼长蝽卵黄原蛋白基因（GpVg)及其所编码的蛋白 质。该基因为大眼长蝽（Geocoris pallidipennis)中的首次报道，为进一步研究大眼长蝽 卵黄原蛋白基因的表达、调控机制奠定了基础；为研究卵黄原蛋白基因参与大眼长蝽生殖 发育、为该重要天敌昆虫大量繁育和有效利用提供了理论指导；同时该基因功能及其编码 产物研究结果也可应用于其他天敌昆虫营养和生殖方面的研究，为天敌昆虫在生物防治以 及害虫的综合防治中的利用提供理论基础。
[0011] 2.本发明提供了大眼长蝽卵黄原蛋白基因及其所编码的蛋白质，该卵黄原蛋白基 因补充了半翅目昆虫卵黄原蛋白基因分子特性的信息，为研究大分子进化提供了有用的材 料。
[0012] 下面将引用非限定性实例对本发明作进一步的说明。
【具体实施方式】
[0013] 实例 1
[0014] 大眼长蝽卵黄原蛋白Vg基因 cDNA的克隆，通过以下步骤进行：从大眼长蝽羽化雌 性成虫中提取总RNA ;按照反转录试剂盒进行cDNA第一链的合成，根据半变态昆虫已知Vg 保守区设计两对简并引物，以上述cDNA为模板进行PCR扩增，纯化以上步骤所得PCR产物， 琼脂糖凝胶回收目的片段，取纯化产物连接到PMD19-T simple载体上，然后转化大肠杆菌 感受态细胞DH5a，37°C平板培养，以M13通用引物对阳性克隆子进行PCR检测鉴定；根据克 隆测序的结果，设计特异引物，将两片段之间的序列连接起来；按Clontech-RACE试剂盒操 作步骤反转录进行cDNA第一链的合成，并根据已知的序列设计3'和5' -RACE特异引物， 按照Clontech试剂盒操作步骤进行3'-末端和5'-末端序列扩增，纯化步骤所得PCR产 物，琼脂糖凝胶回收目的片段，取纯化产物连接到PMD19-T simple载体上，然后转化大肠杆 菌感受态细胞DH5a，37°C平板培养，以M13通用引物对阳性克隆子进行PCR检测鉴定；根据 以上步骤所得的阳性克隆序列测定结果，将所测得基因序列拼接，得到大眼长蝽卵黄原蛋 白基因全长序列。本发明大眼长蝽卵黄原蛋白基因（GpVg)DNA序列SEQ ID N0. 1，为首次在 大眼长蝽中克隆的卵黄原蛋白基因，该基因的序列完整，填补了半翅目昆虫卵黄原蛋白基 因克隆的分子信息，也为研究大分子进化提供了有用的材料。BLAST的结果证明：该卵黄原 蛋白基因为一新基因。本发明提供的大眼长蝽卵黄原蛋白基因及其所编码的产物可应用于 昆虫营养和生殖方面的研究，同时该发明也可以应用于天敌昆虫大量扩繁和工厂化生产。
[0015] 实例 2
[0016] 上述获得的大眼长蝽（Geocoris pallidipennis)卵黄原蛋白基因 GpVg的DNA 序列SEQ ID N0 :1，其编码的蛋白质含有1848个氨基酸，其序列见SEQ ID N0 :2。在数据 库中比较，卵黄原蛋白基因 GpVg编码的蛋白质与数据库中Riptortus clavatus、Plautia stali、Triatoma infestans、Pyrrhocoris apterus 的相似性分别为 57%、43%、40%、 43%，与 Apolygus lucorum、Nesidiocoris tenuis 等均在 40%之下。
[0017] 综上所述，本发明公开了一种大眼长蝽卵黄原蛋白Vg基因（GpVg)及其所编码的 蛋白质。该基因为半翅目天敌昆虫大眼长蝽中的首次报道，本发明实例证明该基因能应用 于研究天敌昆虫营养生理和生殖特性、为该重要天敌昆虫大量繁育和有效利用提供了理论 指导，填补了半翅目昆虫卵黄原蛋白基因的信息，也为研究大分子进化提供了有用的材料。 同时该基因及其表达的重组蛋白质在天敌昆虫营养和生殖研究方面、在生物防治以及害虫 的综合防治领域具有良好的应用前景。
【主权项】
1. 一种大眼长蝽卵黄原蛋白基因 Vg的cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所述。2. 如权利要求1所述多核苷酸编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。3. -种如权利要求1所述的大眼长蝽卵黄原蛋白基因 cDNA克隆方法，包括以下步骤： (1) 从大眼长蝽中提取总RNA，然后反转录合成cDNA ; (2) 根据GenBank登录的半变态昆虫Vg基因保守序列设计2对简并引物； (3) 以步骤⑴得到的cDNA为模板，用步骤⑵所述的引物进行PCR扩增，得到目的片 段； (4) 根据已知的目的片段设计特异引物，以步骤⑴的cDNA为模板进行PCR扩增，得到 扩增片段，将两片段之间的序列连接起来； (5) 根据已知序列的5'和3'端，设计5' -RACE和3' -RACE特异性引物； (6) 按照Clontech-RACE试剂盒操作步骤反转录进行cDNA的合成； (7) 以cDNA为模板，步骤（5)所述的引物，PCR扩增大眼长蝽Vg基因的5' -末端和 3' -末端序列； (8) 将所述基因5'和3'端序列与扩增片段拼接，得到权利要求1所述的cDNA。4. 如权利要求1和2所述的应用，其特征在于：应用的材料中包含权利要求1多核苷 酸序列或权利要求2所述的蛋白质。
【文档编号】C12N15/10GK105886513SQ201410618992
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年11月6日
【发明人】曾凡荣, 梁慧芳, 毛建军
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所