具有葡糖淀粉酶活性的变体的制作方法
【专利说明】
[0001] 序列表的引用
[0002] 所附的是包括SEQ ID NO :1-31的序列表，其全文以引用的方式并入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及具有葡糖淀粉酶活性且具有改善的特性的变体，并且涉及包含适用于 例如生产食品、饮料（例如啤酒）、饲料、生物化学品或者生物燃料的这些变体的组合物。本 发明还公开了编码所述变体的DNA构建体以及在宿主细胞中生成所述葡糖淀粉酶变体的 方法。此外，公开了例如在酿造工艺中与根据本发明的葡糖淀粉酶有关的不同方法和用途。
【背景技术】
[0004] 葡糖淀粉酶（葡聚糖1，4- α -葡糖水解酶，EC 3. 2. 1. 3)是淀粉水解外切作用糖 酶，其催化从淀粉或相关的寡糖和多糖分子的非还原末端移除连续的葡萄糖单元。葡糖淀 粉酶可水解淀粉（例如，直链淀粉和支链淀粉）的直链的和分支的糖苷键。
[0005] 葡糖淀粉酶由多种细菌、真菌、酵母和植物的株系产生。受到特别关注并具有 重要商业价值的是，葡糖淀粉酶是胞外产生的真菌酶，例如来自以下各属的菌株：曲霉属 (Aspergillus)(Svensson et al. , Carlsberg Res. Commun. 48 :529-544(1983)(Svensson 等人，《嘉士伯研究通讯》，第48卷，第529-544页，1983年）；Boel et al·，EMBO J. 3: 1097-1102(1984) (Boel等人，《欧洲分子生物学学会杂志》，第3卷，第1097-1102页， 1984 年）；Hayashida et al.，Agric. Biol. Chem. 53 :923-929(1989) (Hayashida 等人， 《农业与生物化学》，第53卷，第923-929页，1989年）；美国专利No. 5, 024, 941 ;美国专 利 No. 4, 794, 175 和 W088/09795);篮状菌属（Talaromyces)(美国专利 No. 4, 247, 637 ; 美国专利 No. 6, 255, 084 ;和美国专利 No. 6, 620, 924);根霉属（Rhizopus) (Ashikari et al.，Agric. Biol. Chem. 50 :957-964(1986) (Ashikari 等人，农业与生物化学》，第 50 卷， 第 957-964 页，1986 年）；Ashikari et al·，App. Microbio· Biotech. 32 :129-133 (1989) (Ashikari等人，《应用微生物学和生物技术》，第32卷，第129-133页，1989年）和美国专利 No. 4, 863, 864);腐质霉属（Humicola)(W) 05/052148 和美国专利 No. 4, 618, 579);以及毛 霉属（Mucor) (Houghton-Larsen et al.，Appl. Microbiol. Biotechnol. 62 :210-217(2003) (Houghton-Larsen等人，《应用微生物学和生物技术》，第62卷，第210-217页，2003年））。 已对编码这些酶的多个基因进行了克隆，并已使这些基因在酵母、真菌和/或细菌细胞中 表达。在商业上，葡糖淀粉酶是非常重要的酶，且已被用于许多需要水解淀粉（例如用于从 淀粉产生葡萄糖和其他单糖）的应用中。葡糖淀粉酶用于生产高果糖玉米甜味剂，高果糖 玉米甜味剂占据超过美国50 %的甜味剂市场。
[0006] 通常，在淀粉水解工艺中葡糖淀粉酶可与且通常与α-淀粉酶一起使用，以将淀 粉水解为糊精，然后水解为葡萄糖。然后可将葡萄糖由其他酶（例如葡萄糖异构酶）转化 为果糖；结晶；或用于发酵以产生多种终产物（例如乙醇、柠檬酸、乳酸、琥珀酸盐、抗坏血 酸中间体、谷氨酸、甘油和1，3_丙二醇）。通过在含淀粉和/或纤维素的材料的发酵中使用 葡糖淀粉酶而产生的乙醇可用作燃料来源或用于酒精消费。
[0007] 在商业上用于高葡萄糖玉米糖浆（HGCS)和高果糖玉米糖浆（HFCS)生产的 高固形物浓度下，葡糖淀粉酶通过缩合反应合成二糖、三糖和四糖。这是由于淀粉中 α - (1-6)-D-葡萄糖苷键的水解缓慢以及由D-葡萄糖形成多种积聚的缩合产物（主要是异 麦芽糖）而引起的。因此，许多常规工艺中葡萄糖的产率不超过理论产率的95%，全世界通 过该工艺生产的糖浆量是非常大的，即使每吨淀粉的葡萄糖产率有十分小的增加在商业上 都是重要的。
[0008] 若干葡糖淀粉酶在例如 W0/2008/045489、W0/2009/048488、W0/2009/048487、 US8058033、W0/2011/022465、W02011/020852 和 W02012/001139 中进行了描述。
[0009] 在淀粉衍生的碳水化合物的水解中使用葡糖淀粉酶在酿造工业中越来越重要，特 别是用于生产高发酵度（有时称为低卡路里）啤酒。葡萄糖很容易由酵母转化为醇，从而 使得啤酒厂有可能由发酵获得十分高的醇产率并且同时获得啤酒，其在残留碳水化合物方 面是十分低的。将发酵物用水稀释至所需的醇百分比，且最终的啤酒作为"低碳水化合物 (low carb)"出售。出于与产品稳定性和法规相关的原因，使添加的酶活性在最终的啤酒中 除去/失活很重要。遗憾的是，当葡糖淀粉酶源自通常来源，例如曲霉属（Aspergillus)物 种，例如黑曲霉（A. niger)和泡盛曲霉（A. awamori);腐质霉属（Humicola)物种；篮状菌属 (Talaromyces)物种，诸如埃默森篮状菌（T. emersonii);阿太菌属（Athelia)物种，诸如罗 氏阿太菌（A.rolfsii);青霉属（Penicillium)物种，诸如产黄青霉（P. chrysogenum)，并且 所述酶在酿造过程中被添加到发酵容器（FV)中时，由于所述酶的热稳定性，该要求难以满 足。
[0010] 虽然将葡糖淀粉酶添加到淀粉糖化容器中，或在麦芽汁煮沸前的任何阶段添加， 可以避免该问题，但是这引入了其他实际困难。美国专利No. 4, 666, 718描述了采用包括酿 造酶葡糖淀粉酶的反应器的酿造工艺，该酿造酶葡糖淀粉酶固定在固体载体上，由此可从 产物回收酶。美国专利No. 5, 422, 267A描述了采用表达重组葡糖淀粉酶的基因工程酵母的 酿造工艺，但是其中该酶由酵母分泌。
[0011] 因此，仍然需要例如具有葡糖淀粉酶活性的组合物形式的葡糖淀粉酶，其可添加 到使用常规设备来制备发酵饮料（诸如啤酒）的常规工艺中的任何阶段，并且其活性可从 最终产物安全地除去。
[0012] 将例如组合物形式的具有水解活性的葡糖淀粉酶变体添加到在制备发酵饮料中 使用的发酵容器（FV)中是特别有效的。益处为例如酶剂量降低、淀粉向可发酵碳水化合物 的转化增加，以及酵母应激降低。这种方法并不常用的原因是，活性酶于是可存在于最终产 物中，如上所述这是不期望的。市售葡糖淀粉酶一般是热稳定的，并且在发酵饮料的巴氏灭 菌过程中施加的能量不足以使酶失活。因此，还需要不耐热的葡糖淀粉酶，其可在发酵之后 通过巴氏灭菌来灭活。
【发明内容】
[0013] 本发明涉及葡糖淀粉酶变体，其包含由SEQ ID NO :2的残基29、43、48、116和502 或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的界面氨基酸组中的一个或两个氨基酸置换；以及由 SEQ ID N0:2的残基97、98、147、175、483和484或亲本葡糖淀粉酶中的等价位置组成的催 化核心氨基酸残基组中的一个、两个或三个氨基酸置换。
[0014] 本发明还涉及能够编码本发明的葡糖淀粉酶变体的核酸。
[0015] 本发明还涉及能够表达本发明的葡糖淀粉酶变体的核酸。本发明还涉及质粒或表 达载体，诸如包含核酸或能够表达本发明的葡糖淀粉酶变体的重组表达载体。本发明还涉 及具有本发明的葡糖淀粉酶变体的异源表达的宿主细胞，以及包含如上定义的质粒或表达 载体的宿主细胞。本发明还涉及分离、制备和/或表达本发明的葡糖淀粉酶变体的方法。
[0016] 本发明还涉及包含本发明的一种或多种葡糖淀粉酶变体的组合物。
[0017] 本发明还涉及本发明的葡糖淀粉酶变体或组合物在发酵中的用途，其中在发酵步 骤之前或期间添加所述葡糖淀粉酶变体或组合物。
[0018] 本发明还涉及本发明的不耐热葡糖淀粉酶变体用于提高酿造工艺的发酵步骤中 可发酵糖的产量的用途。
[0019] 本发明还涉及包括在发酵步骤之前或期间添加本发明的葡糖淀粉酶变体或组合 物的方法。
[0020] 本发明还涉及发酵饮料，其中该发酵饮料由本发明的方法制得。
[0021] 本发明还涉及生产食品、饲料或饮料产品（诸如醇饮料或无醇饮料，例如像啤酒 或威士忌的基于谷类或麦芽的饮料，例如葡萄酒、苹果酒、醋、米酒、酱油或果汁）的方法， 所述方法包括用本发明的葡糖淀粉酶变体或组合物来处理含有淀粉和/或糖的植物材料 的步骤。
[0022] 本发明还涉及生产第一代或第二代生物燃料（诸如生物乙醇）的方法，所述方法 包括用如本文所述的葡糖淀粉酶变体来处理含有淀粉的材料的步骤，以及由这种方法获得 的产物。本发明还涉及生产生物化学品（诸如生物基异戊二烯）的方法，所述方法包括用如 本文所述的葡糖淀粉酶变体来处理含有淀粉的材料的步骤，以及由这种方法获得的产物。 本发明还涉及如本文所公开的葡糖淀粉酶变体或组合物用于生产第一代或第二代生物燃 料（诸如生物乙醇）或用于生产生物化学品（诸如生物基异戊二烯）的用途。
[0023] 本发明还涉及试剂盒，其包含本发明的葡糖淀粉酶变体或组合物；以及所述葡糖 淀粉酶变体或组合物的使用说明。
[0024] 因此，本发明的目标是在本发明中不涵盖任何先前已知的产品、生产所述产品的 工艺或使用所述产品的方法，使得申请人保留该权利并特此公开放弃对任何先前已知的 产品、工艺和方法的权利。还应该注意，本发明无意于在本发明的范围内涵盖任何不符合 USPT0(35U.S.C. §112,第一段）或EP0(EPC的第83款）的书面说明和可实施性要求的产 品、所述产品的制备工艺或使用所述产品的方法，使得申请人保留权利并特此公开放弃对 任何先前描述的产品、制备所述产品的工艺或使用所述产品的方法的权利。
[0025] 应该注意，在本公开中，特别是在权利要求书和/或实施例中，诸如"包含"等之类 的术语可具有的含义是其在美国专利法中的含义；如，它们可意指"包括"等。并且诸如"基 本上由...组成"之类的术语具有的含义是其在美国专利法中的含义，例如，它们允许没有 被明确叙述的元素，但排除现有技术中存在的或影响本发明的基本特征或新特征的元素。
[0026] 这些以及其他实施例在下面的【具体实施方式】中公开或根据下面的【具体实施方式】 显而易见并且为下面的【具体实施方式】所涵盖。
【附图说明】
[0027] 下面的以举例的方式给出但无意于将本发明只局限于所描述的具体实施例的具 体实施方式可结合附图得到更好地理解，其中：
[0028] 图 1 是入门载体：A)pEntry_GA CS4 和 B)pEntry_GA wt 的示意图。
[0029] 图 2 是表达载体：A) pTTT-pyrG13-GACS4 和 B) pTTTpyr2-GACS4 的示意图。
[0030] 图3描绘了 TrGA变体的SDS-PAGE分析结果。上图为里氏木霉（Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶变体：R_C_1、R_C_2、R_C_5、R_C_12、R_C_7、R_D_2、R_D_3 和 R_D_5 ;下 图为变体 R_C_13、R_C_22、R_A_1、R_A_2、R_A_6、R_A_7 和 TrGA(wt)。对于每个变体而言， 在括号中示出的是葡糖淀粉酶活性（GAU/mL)。
[0031] 图4描绘了 TrGA变体的SDS-PAGE分析结果。在上图中，如图中所绘那样示出了 里氏木霉葡糖淀粉酶变体CPS3-B01至CPS2-E08,以及空载体和TrGA-CS4的发酵产物。对 于每个变体而言，在括号中示出的是葡糖淀粉酶活性（GAU